Procédures de transplantation de moelle osseuse chez la souris pour étudier l’hématopoïèse clonale

Summary

Nous décrivons trois méthodes de transplantation de moelle (BMT) : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation blindée, et méthode de BMT sans le pré-conditionnement (BMT adoptif) pour l’étude de l’hématopoïèse clonale dans des modèles murins.

Abstract

L’hématopoïèse clonale est une affection associée à l’âge répandue qui résulte de l’accumulation de mutations somatiques dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs). Les mutations dans les gènes conducteurs, qui confèrent la forme physique cellulaire, peuvent conduire au développement de clones de HSPC en expansion qui donnent de plus en plus lieu à des leucocytes de descendance hébergeant la mutation somatique. Puisque l’hématopoïèse clonale a été associée aux maladies cardiaques, aux accidents vasculaires cérébraux, et à la mortalité, le développement des systèmes expérimentaux qui modélisent ces processus est essentiel pour comprendre les mécanismes qui sous-ensivent ce nouveau facteur de risque. Des procédures de transplantation de moelle impliquant le conditionnement myéloablatif chez la souris, telles que l’irradiation de corps entier (TBI), sont couramment employées pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans les maladies cardio-vasculaires. Cependant, des dommages simultanés à la niche de moelle osseuse et à d’autres sites d’intérêt, tels que le cœur et le cerveau, sont inévitables avec ces procédures. Ainsi, notre laboratoire a développé deux méthodes alternatives pour minimiser ou éviter les effets secondaires possibles causés par TBI : 1) la transplantation de moelle avec blindage d’irradiation et 2) BMT adoptive aux souris non conditionnées. Dans les organes blindés, l’environnement local est préservé permettant l’analyse de l’hématopoïèse clonale tandis que la fonction des cellules immunitaires résidentes est intacte. En revanche, le BMT adoptif aux souris non conditionnées a l’avantage supplémentaire que les environnements locaux des organes et la niche hématopoïétique sont préservés. Ici, nous comparons trois différentes approches de reconstitution de cellules hématopoïétiques et discutons de leurs forces et limites pour des études de l’hématopoïèse clonale dans les maladies cardio-vasculaires.

Introduction

L’hématopoïèse clonale (CH) est une condition qui est fréquemment observée chez les personnes âgées et se produit à la suite d’un clone de tige et de cellule progéniteur hématopoïétique élargie (HSPC) portant une mutation génétique^1. On lui a suggéré qu’à l’âge de 50, la plupart des individus auront acquis une moyenne de cinq mutations exoniques dans chaque HSPC², mais la plupart de ces mutations auront comme conséquence peu ou pas de conséquences phénotypiques à l’individu. Cependant, si par hasard l’une de ces mutations confère un avantage concurrentiel au HSPC, par exemple en favorisant sa prolifération, son auto-reno....

Protocol

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie.

1. Avant le préconditionnement

1. Placer les souris réceptrices sur de l’eau supplémentée aux antibiotiques (5 mM de sulfaméthoxazole, 0,86 mM de triméthoprime) ~ 24 h avant l’irradiation. Ceci est nécessaire pour prévenir l’infection, car le système immunitaire sera supprimé après l’irradiation et maintenu pendant 2 semaines après l’irradiation. À ce stade, compléter les souris avec un gel nutritionnel / hydratation pour encourager l’alimentation et pour prévenir la perte de po....

Results

Pour comparer l’effet de trois méthodes de BMT/pre-conditioning sur l’engraftment de distributeur de cellules, les fractions des cellules de distributeur dans le sang périphérique et le tissu de coeur ont été analysées par cytometry d’écoulement à 1 mois de poteau-BMT. Des cellules d’isolement ont été souillées pour que les marqueurs spécifiques de leucocyte identifient les différents sous-ensembles de leucocytes. Dans ces expériences, le sauvage-type(WT) C57BL/6 (CD45.2) cellules de moelle de distributeur ont é.......

Discussion

Pour des études d’hématopoïèse clonale, nous avons décrit trois méthodes de BMT : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation avec le blindage partiel, et une méthode moins couramment utilisée de BMT qui n’implique aucun préconditionnement (BMT adoptif). Ces méthodes ont été utilisées pour évaluer l’impact de l’hématopoïèse clonale sur les maladies cardiovasculaires. Les chercheurs peuvent modifier ces méthodes en conséquence en fonction de l’objectif spécifique de leur étude.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microcentrifugeuse 0,5 ml	Fisher Scientific	05-408-121	approvisionnement général
Microcentrifugeuse 1,5 ml Fisher	Scientific	05-408-129	approvisionnement général
1/2 cc SERINGUE D’INSULINE LO-DOSE	EXELINT	26028	approvisionnement général
Éthanol absolu (200 prfof)	Fisher chemical	200559	approvisionnement général
BD 1mL Tuberculine Seringues 25G Aiguille 5/8 pouce	Becton Dickinson	309626	approvisionnement général
BD PrecisionGlide Aiguille 18G (1,22 mm x 25 mm)	Becton Dickinson	395195	approvisionnement général
Irradiateur au césium-137	J. L. Shepherd  ;	Équipement Mark IV
DietGel 76A	Clear H2O	70-01-5022	approvisionnement général
Falcon 100 mm Plat de culture cellulaire traité TC Sciences	de la vie	353003	approvisionnement général
Falcon 50 mL Tubes à centrifuger coniques	Fisher Scientific	352098	approvisionnement général
Fisherbrand filtres à cellules stériles, 70 &mu ; m	Fisher Scientific	22363548	approvisionnement général
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10	approvisionnement général
Ciseaux fins renforcés	Outils de science fine	14090-09	approvisionnement général
Isothésie (Isoflurane) solution	Henry Schein	29404	Solution
Kétamine	Zoetis	043-304	injection
Kimwipes Delicate Task Essuie-glaces	Kimtech Science	KCC34155	approvisionnement général
PBS pH7.4 (1X)	Gibco	10010023	Solution
RadDisk &ndash ; Irradiateur pour rongeurs Disque	Braintree Scientific	IRD-P M	approvisionnement général
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093	Medium
Sulfaméthoxazole et triméthoprime	TEVA	0703-9526-01	injection
Xylazine	Akorn	139-236	injection
Irradiateur à rayons X	Source de rad	RS-2000	équipement