Article de méthode

Caractérisation et prédiction fonctionnelle des bactéries dans les tissus ovariens

DOI :

10.3791/61878

⸱

23 octobre 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, 2School of Social Sciences, University of Manchester, 3Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, 4Omega Bioservices Inc

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La coloration immunohistochimique et le séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S (gène de l’ARNr 16S) ont été effectués afin de découvrir et de distinguer les bactéries dans les tissus ovariens cancéreux et non cancéreux in situ. Les différences de composition et de fonctionnement des bactéries ont été prédites à l’aide de BugBase et de Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La théorie d’un appareil reproducteur supérieur féminin « stérile » a rencontré une opposition croissante en raison des progrès de la détection bactérienne. Cependant, la question de savoir si les ovaires contiennent des bactéries n’a pas encore été confirmée. Ici, une expérience pour détecter les bactéries dans les tissus ovariens a été introduite. Nous avons choisi des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire dans le groupe cancer et des patientes non cancéreuses dans le groupe témoin. Le séquençage du gène de l’ARNr 16S a été utilisé pour différencier les bactéries dans les tissus ovariens des groupes cancéreux et témoins. De plus, nous avons prédit la composition fonctionnelle des bactéries identifiées en utilisant BugBase et PICRUSt. Cette méthode peut également être utilisée dans d’autres viscères et tissus, car il a été prouvé que de nombreux organes hébergent des bactéries ces dernières années. La présence de bactéries dans les viscères et les tissus peut aider les scientifiques à évaluer les tissus cancéreux et normaux et peut aider au traitement du cancer.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Récemment, un nombre croissant d’articles ont été publiés qui prouvent l’existence de bactéries dans les viscères abdominaux solides, tels que le rein, la rate, le foie et l’ovaire1,2. Geller et al. ont trouvé des bactéries dans les tumeurs pancréatiques, et ces bactéries étaient résistantes à la gemcitabine, un médicament chimiothérapeutique2. S. Manfredo Vieira et al. ont conclu qu’Enterococcus gallinarum était portable aux ganglions lymphatiques, au foie et à la rate, et qu’il pouvait conduire à l’auto-immunité3.

Étant donné que le col de l’utérus joue un rôle de défenseur, les bactéries dans l’appareil reproducteur féminin supérieur, qui contient l’utérus, les trompes de Fallope et les ovaires, ont été peu étudiées. Cependant, de nouvelles théories ont été établies ces dernières années. Les bactéries peuvent avoir accès à la cavité utérine pendant le cycle menstruel en raison de changements dans les mucines4,5. En outre, Zervomanolakis et al. ont confirmé que l’utérus, avec les trompes de Fallope, est une pompe péristaltique contrôlée par le système endocrinien des ovaires, et cet arrangement permet aux bactéries de pénétrer dans l’endomètre, les trompes de Fallope et les ovaires6.

L’appareil reproducteur supérieur n’est plus un mystère grâce au développement de méthodes de détection bactérienne. Verstraelen et al. ont utilisé une méthode de séquençage par paires à code-barres pour découvrir les bactéries utérines en ciblant la région hypervariable V1-2 du gène 7 de l’ARN 16S. Fang et al. ont utilisé le séquençage par code-barres chez les patients atteints de polypes de l’endomètre et ont révélé la présence de diverses bactéries intra-utérines8. De plus, en utilisant le gène de l’ARN 16S, Miles et al. et Chen et al. ont trouvé des bactéries dans le système génital des femmes qui avaient subi une salpingo-ovariectomie et une hystérectomie, respectivement5,9.

Les bactéries dans les tissus tumoraux ont attiré de plus en plus l’attention ces dernières années. Banerjee et al. ont découvert que la signature du microbiome différait entre les patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire et les témoins10. Unnoxynatronum sibiricum a été associé au stade tumoral, et Methanosarcina vacuolata pourrait être utilisé pour diagnostiquer le cancer de l’ovaire11. En plus du cancer de l’ovaire, d’autres cancers, tels que l’estomac, le poumon, la prostate, le sein, le col de l’utérus et l’endomètre, se sont avérés associés aux bactéries12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. ont proposé une nouvelle classe de diagnostics oncologiques microbiens, prévoyant un dépistage précoce du cancer19. Dans ce protocole, nous avons étudié les différences entre les tissus ovariens cancéreux et normaux en comparant la composition et la fonction des bactéries dans ces deux tissus.

La coloration immunohistochimique et le séquençage du gène de l’ARNr 16S ont été effectués pour confirmer la présence de bactéries dans les ovaires. Les différences et les fonctions prédites des bactéries de l’ovaire dans les tissus ovariens cancéreux et non cancéreux ont été étudiées. Les résultats ont montré l’existence de bactéries dans les tissus ovariens. Anoxynatronum sibiricum et Methanosarcina vacuolata étaient liés au stade et au diagnostic du cancer de l’ovaire, respectivement. Quarante-six voies KEGG significativement différentes qui étaient présentes dans les deux groupes ont été comparées.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique médicale institutionnelle du premier hôpital affilié de l’Université Xi’an Jiaotong (No. XJTUIAF2018LSK-139). Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients inscrits.

1. Critères d’entrée dans le groupe cancéreux et le groupe témoin

  1. Pour le groupe du cancer, recrutez des patientes qui reçoivent principalement un diagnostic de cancer de l’ovaire, et après la laparotomie, il est prouvé qu’elles ont un cancer de l’ovaire séreux par des résultats pathologiques.
  2. Pour le groupe témoin, recruter des patientes qui reçoivent principalement un diagnostic de myome utérin ou d’adénomyose utérine, sans présenter d’affection ovarienne, et qui ont subi une hystérectomie et une salpingo-ovariectomie.
    REMARQUE : Cette norme n’est pas définie. Les patients atteints de maladies n’affectant pas les ovaires qui subissent une hystérectomie et une salpingo-ovariectomie peuvent également être recrutés.
  3. Exclure les patients présentant un ou plusieurs des critères suivants :
    Femmes enceintes ou allaitantes.
    Prendre des antibiotiques 2 mois avant la chirurgie.
    Avoir de la fièvre ou des marqueurs inflammatoires élevés.
    Avoir une inflammation de toute sorte.
    Avoir subi une chimiothérapie néoadjuvante.

2. Prélassez des échantillons

  1. Pendant la chirurgie, placez les ovaires réséqués dans un tube stérile et placez le tube dans de l’azote liquide pour le transport. Évitez de toucher quoi que ce soit d’autre tout au long de la procédure.
  2. Séparez les ovaires en échantillons de tissus d’environ 1 cm d’épaisseur avec une paire de nouvelles pinces stériles sous une armoire à flux laminaire. Après séparation, conserver les échantillons à -80 °C.
    REMARQUE: Toutes les procédures de prélèvement d’échantillons sont aseptiques, y compris la séparation des ovaires.

3. Séquencer le gène de l’ARNr 16S

  1. Extraire l’ADN.
    1. Ajouter 1,2 mL de tampon EX inhibiteur dans un tube de centrifugeuse de 2 mL. Ensuite, ajoutez 180-220 mg d’échantillons dans le tube. Laisser l’échantillon bien mélanger (bain-marie à 70 °C pendant 5 min puis vortex pendant 15 s).
    2. Centrifuger le tube pendant 1 min à 600 x g.
    3. Placer 550 μL du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et centrifuger pendant 1 min à 600 x g.
    4. Transférer 400 μL du surnageant avec 30 μL de protéinase K dans un autre tube de 1,5 mL.
    5. Ajouter 400 μL de tampon AL et utiliser un mélangeur vortex pendant 15 s.
    6. Incuber à 70 °C pendant 10 min.
    7. Ajouter 400 μL d’alcool à 96-100%. Utilisez un mélangeur vortex pendant 15 s.
    8. Transférer 600 μL de mélange dans une colonne d’absorption et centrifuger pendant 1 min à 13700 g. Échangez le tube inférieur. Répétez cette étape 11 fois.
    9. Ajouter 500 μL de tampon AW1, centrifuger pendant 1 min à 13 700 x g, et changer le tube inférieur.
    10. Ajouter 500 μL de tampon AW2, centrifuger pendant 3 min à 13 700 x g, et changer le tube inférieur.
    11. Centrifugeuse pendant 3 min à 13 700 x g.
    12. Transférer le mélange dans un nouveau tube de 1,5 mL, ajouter 200 μL de tampon ATE, incuber à température ambiante pendant 5 min et centrifuger pendant 1 min à 13 700 x g.
  2. Tests de qualité. Utilisez 1% d’électrophorèse sur gel de sépharose pour tester la qualité. Ajouter 400 ng d’échantillon, 120 V, 30 minutes. Résultat idéal : Concentration d’ADN : ≥ 10 ng/μL, pureté de l’ADN : A260/A280 = 1,8-2,0, ADN brut : ≥ 300 ng.
  3. Préparez les bibliothèques à l’aide d’un kit de séquençage métagénomique 16S selon le protocole du fabricant.
    1. Effectuez la PCR. En bref, chaque réaction PCR de 25 μL contient 12,5 ng d’ADN d’échantillon en entrée, 12,5 μL de 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix et 5 μL de chaque amorce à 1 μM.
    2. Effectuer la PCR en utilisant le protocole suivant : une étape initiale de dénaturation réalisée à 95°C pendant 3 min suivie de 25 cycles de dénaturation (95°C, 30 s), de recuit (55°C, 30 s) et d’extension (72°C, 30 s), et un allongement final de 5 min à 72°C.
    3. Nettoyez le produit PCR du mélange réactionnel avec des billes magnétiques en utilisant les instructions du fabricant.
    4. Répétez les étapes 3.3.1 et 3.3.2.
    5. Tests de qualité. Veuillez vous référer à l’étape 3.2.
    6. Répétez l’étape 3.3.3.
    7. Tests de qualité. Utilisez l’électrophorèse sur gel de sépharose à 1 % pour tester l’impureté, un spectrophotomètre pour tester la pureté, un fluoromètre pour tester la concentration et un kit de dosage de l’ARN pour tester l’intégrité. Suivez le protocole du fabricant. Normaliser et regrouper les bibliothèques ; puis séquence (réglage de lecture d’extrémité appariée de 2 x 300 bp) à l’aide de cellules d’écoulement standard V3 de 600 cycles, produisant environ 100 000 lectures de base à extrémité appariée 2 x 300.
      REMARQUE: Les séquences d’amorce pleine longueur: 16S Amplicon polymerase chain reaction (PCR) Forward primer: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] et 16S Amplicon PCR Reverse primer: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].

4. Analyser les données de séquençage du gène de l’ARNr 16S

  1. Filtrez les lectures brutes de chaque échantillon en fonction de la qualité du séquençage avec le progiciel QIIME 2-20180220.
    1. Copiez trois fichiers dans le répertoire : emp-paired-end-sequences_01
      un fichier forward.fastq.gz qui contient la séquence de transfert se lit,
      un fichier reverse.fastq.gz qui contient les lectures de séquence inverse,
      un fichier barcodes.fastq.gz qui contient les lectures de code-barres associées
    2. Exécuter
      Importation d’outils qiime \
      --type EMPPairedEndSequences \
      --input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
  2. Retirez les séquences d’apprêt et d’adaptateur.
    qiime cutadapt trim-paired \
    --i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
    --p-front-f GCTACGGGGGG \
    --p-front-r GCTACGGGGGG \
    --p-taux d’erreur 0 \
    --qualité-coupure 25 \
    --o-trimmed-sequences trimmed-seqs_03.qza \
    --verbeux
  3. Raccourcir les lectures de séquence dans lesquelles les deux qualités d’extrémité appariées sont inférieures à 25. Voir ci-dessus --quality-cutoff 25
  4. Analysez les données de séquençage.
    1. Rassembler des séquences pour former des unités taxonomiques opérationnelles (OTU) avec un seuil de similitude à 97%.
      qiime vsearch dereplicate-sequences \
      --i-séquences découpées-seqs_03.qza \
      --o-dereplicated-table table_04.qza \
      --o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
      ​
      qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
      --i-table table_04.qza \
      --i-sequences rep-seqs_04.qza \
      --i-reference-sequences 97_otus.qza \
      --p-perc-identity 0,97 \
      --o-clustered-table table-cr-97.qza \
      --o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
      --o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza
    2. Pour les OTU, calculez l’abondance relative dans chaque échantillon. L’information sur l’abondance se trouve dans la table-cr-97.qza
  5. Utilisez un classificateur bayésien natif, qui vise l’ensemble de formation RDP (version 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), pour trier toutes les séquences. Les informations cartographique sur les taxons se trouvent dans table-cr-97.qza
  6. Dans l’OTU donné, attribuez une classification qui reflète la cohérence majeure des séquences aux OTU. Ensuite, alignez les OTU. Voir table-cr-97.qza et rep-seqs-cr-97.qza
  7. Sur la base des informations du groupe échantillon, effectuez la diversité alpha (y compris les indices Chao 1, ACE, Shannon, Simpson et Evenness) et l’analyse des coordonnées principales (PCoA) basée sur UniFrac.
    exportation d’outils qiime \
    --input-path table-cr-97.qza \
    --output-path exported-feature-table
    exported-feature-table

    qiime diversité alpha \
    --i-table table-cr-97.qza \
    --p-métrique observed_otus \
    --o-alpha-diversité observed_otus_vector.qza

    qiime diversité bêta \
    --i-table table-cr-97.qza \
    --p-metric braycurtis \
    --o-distance-matrix unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

5. Prédire la fonction bactérienne

  1. Pour prédire la représentation connexe des caractéristiques des bactéries, utilisez BugBase21. La table OTU d’entrée pour BugBase est préparée à l’aide des commandes suivantes.
    biom convert -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
    biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table » --to-json
    REMARQUE: La prédiction est basée sur six catégories de phénotypes (Ward et al. non publiés) (https://bugbase.cs.umn.edu/): coloration de Gram, tolérance à l’oxygène, capacité à former des biofilms, teneur en éléments mobiles, pathogénicité et tolérance au stress oxydatif.
  2. Prédire la composition fonctionnelle d’un métagénome par PICRUSt à l’aide de données de gènes marqueurs et d’une base de données contenant des génomes de référence22.
    make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
    normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
    predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
    categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c « KEGG_Pathways » -l 1 -o picrust_L1.biom
    categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1 .txt
  3. Analyser les différences de fonctions entre chaque groupe à l’aide de STAMP23,24. Veuillez vous référer aux citations pour faire fonctionner le logiciel.

6. Données

  1. Utilisez un logiciel statistique pour calculer la signification des résultats. L’indication de la signification statistique doit être fixée à P < 0,05.
  2. Évaluer les différences d’âge et de parité par le test t de Student. Évaluer les différences dans le statut ménopausique, les antécédents d’hypertension et de diabète par le test du chi carré. Évaluer les différences dans le nombre de taxons bactériens ovariens par le test U de Mann-Whitney.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patient
Au total, 16 patients qualifiés ont été inclus dans l’étude. Le groupe témoin comprenait 10 femmes ayant reçu un diagnostic de tumeur utérine bénigne (parmi elles, 3 patientes ont reçu un diagnostic de myome utérin et 7 patientes ont reçu un diagnostic d’adénomyose utérine). Pendant ce temps, le groupe de cancer comprenait 6 femmes ayant reçu un diagnostic de cancer de l’ovaire séreux (parmi elles, 2 patientes ont reçu un diagnostic de stade II et 2 d’entre elles ont reçu un diagnostic de stad...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cancer de l’ovaire a une influence notable sur la fertilité des femmes25. La plupart des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire sont diagnostiquées à un stade avancé et le taux de survie à 5 ans est inférieur à 30%18. La confirmation de la bactérie dans les viscères solides abdominaux, y compris le foie, le pancréas et la rate, a été publiée. L’existence de bactéries dans l’appareil reproducteur féminin supérieur se produit parce que le col de l’utérus n’est pas fer...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le prix de recherche clinique du premier hôpital affilié de l’Université Xi’an Jiaotong, en Chine (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), le grand projet de recherche fondamentale en sciences naturelles du département provincial des sciences et de la technologie du Shaanxi (2018JM7073, 2017ZDJC-11), le projet de recherche et de développement clé du département provincial des sciences et de la technologie du Shaanxi (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), le projet provincial d’innovation technologique collaborative du Shaanxi (2 017XT-026, 2018XT-002) et le projet de recherche médicale du Plan d’orientation pour le développement social de Xi’an (2017117SF/YX011-3). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Nous remercions les collègues du département de gynécologie du premier hôpital affilié de l’Université Xi’an Jiaotong pour leurs contributions à la collecte d’échantillons.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2200 TapeStation SoftwareAgilgent
États-Unis
AmpliSeq pour la préparation de la bibliothèque Illumina, les index et les accessoiresIllumina
Image-pro plus 7Media Cybernetics
Leica ASP 300SLeica Biosystems Division de Leica Microsystems
Leica EG 1150Leica Biosystems Division de Leica Microsystems
Leica RM2235Leica Biosystems Division de Leica Microsystems
LPS Core Anticorps monoclonal, clone WN1 222-5Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus billes magnétiquesOmega BiotekM1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96 KitOmega BiotekM4029-01
MiSeqIlluminaSY-410-1003
Base de données SilvaInstitut Max Planck de microbiologie marine et Université
, le système d’ADNdb QuantiFluorPromegaE2670
TrimmomaticBjö ; rn Usadel
ZytoChem Plus (HRP) Kit Anti-Lapin (DAB)Systèmes ZytomedHRP008DAB-RB
, Jacobs, ,

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Réimpressions et autorisations

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Mots-clés

Ovarian Tissue Bacteria16S rRNA SequencingImmunohistochemistry StainingBugBase AnalysisPICRUSt Functional PredictionSterile Tissue ProcessingDNA Library PreparationQIIME Data AnalysisAlpha Diversity MetricsStatistical Significance Testing

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