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Article de méthode

Isolement d’adipocytes viables et d’une fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux viscéral humain adapté à l’analyse de l’ARN et au phénotypage des macrophages

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DOI :

10.3791/61884

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27 octobre 2020

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1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit une méthode efficace de digestion de la collagénase pour isoler des adipocytes viables et des cellules stromales de fraction vasculaire-SVF de la graisse viscérale humaine en un seul processus, y compris une méthodologie pour obtenir un ARN de haute qualité à partir d’adipocytes et la phénotypification des macrophages SVF par coloration de plusieurs marqueurs membranaires pour analyse par cytométrie en flux.

Résumé

Le tissu adipeux viscéral (VAT) est un organe métabolique actif composé principalement d’adipocytes matures et de cellules de fraction vasculaire stromale (SVF), qui libèrent différentes molécules bioactives qui contrôlent les processus métaboliques, hormonaux et immunitaires ; Actuellement, on ne sait pas comment ces processus sont régulés dans le tissu adipeux. Par conséquent, le développement de méthodes évaluant la contribution de chaque population cellulaire à la physiopathologie du tissu adipeux est crucial. Ce protocole décrit les étapes d’isolement et fournit les directives de dépannage nécessaires pour isoler efficacement les adipocytes matures viables et la SVF des biopsies de TVA humaine en un seul processus, en utilisant une technique de digestion enzymatique de la collagénase. De plus, le protocole est également optimisé pour identifier les sous-ensembles de macrophages et effectuer l’isolement d’ARN adipocytaires matures pour les études d’expression génique, ce qui permet de réaliser des études disséquant l’interaction entre ces populations cellulaires. En bref, les biopsies de VAT sont lavées, hachées mécaniquement et digérées pour générer une suspension unicellulaire. Après centrifugation, les adipocytes matures sont isolés par flottation à partir de la pastille SVF. Le protocole d’extraction d’ARN garantit un rendement élevé d’ARN total (y compris les miARN) des adipocytes pour les tests d’expression en aval. Simultanément, les cellules SVF sont utilisées pour caractériser les sous-ensembles de macrophages (phénotype pro- et anti-inflammatoire) par analyse par cytométrie en flux.

Introduction

Le tissu adipeux blanc est composé non seulement de cellules adipeuses ou adipocytes, mais aussi d’une fraction de cellules non graisseuses connue sous le nom de fraction vasculaire stromale (SVF), qui contient une population cellulaire hétérogène composée de macrophages, d’autres cellules immunitaires comme les lymphocytes T régulateurs (Tregs) et d’éosinophiles, de préadipocytes et de fibroblastes, entourés de tissu vasculaire et conjonctif 1,2. Le tissu adipeux (TA) est maintenant considéré comme un organe qui régule les processus physiologiques liés au métabolisme et à l’inflammation par le biais d’adipokines, de cytokines et de microARN produits et libérés par différentes cellules dans le tissu, avec des effets autocrines, paracrines et endocriniens 3,4. Chez l’homme, le tissu adipeux blanc comprend le tissu adipeux sous-cutané (SAT) et le tissu adipeux viscéral (VAT), avec d’importantes différences anatomiques, moléculaires, cellulaires et physiologiques entre eux 2,5. Le SAT représente jusqu’à 80 % de l’AT humain, tandis que le VAT est situé dans la cavité abdominale, principalement dans le mésentère et l’épiploon, étant métaboliquement plus actif6. De plus, le VAT est un organe endocrinien qui sécrète des médiateurs ayant un impact substantiel sur le poids corporel, la sensibilité à l’insuline, le métabolisme des lipides et l’inflammation. Par conséquent, l’accumulation de TVA entraîne une obésité abdominale et des maladies liées à l’obésité telles que le diabète de type 2, le syndrome métabolique, l’hypertension et le risque de maladies cardiovasculaires, ce qui représente un meilleur prédicteur de la mortalité associée à l’obésité 6,7,8,9.

Dans des conditions homéostatiques, les adipocytes, les macrophages et les autres cellules immunitaires coopèrent pour maintenir le métabolisme de la TVA par la sécrétion de médiateurs anti-inflammatoires10. Cependant, une expansion excessive de la TVA favorise le recrutement de lymphocytes T, de cellules NK et de macrophages activés. En fait, dans la TVA pauvre, le rapport des macrophages est de 5%, tandis que ce rapport monte jusqu’à 50% dans l’obésité, avec une polarisation des macrophages du phénotype anti-inflammatoire au phénotype pro-inflammatoire, générant un environnement inflammatoire chronique10,11.

En raison de la pandémie d’obésité, un nombre étonnant de rapports ont été publiés sur différents sujets de recherche sur la TVA, notamment la biologie des adipocytes, l’épigénétique, l’inflammation, les propriétés endocriniennes et les domaines émergents comme les vésicules extracellulaires, entre autres 8,10,12,13. Cependant, bien que l’environnement de la TVA soit défini par la diaphonie entre les adipocytes et les macrophages résidents ou entrants, la plupart des études se sont concentrées sur une seule population cellulaire, et il existe peu d’informations sur l’interaction de ces cellules dans la TVA et leurs conséquences physiopathologiques11,14. De plus, des études intéressantes portant sur l’interaction adipocyte-macrophage dans l’AT ont été réalisées à l’aide de lignées cellulaires, sans les conditions d’amorçage in vivo 11,14,15. Une stratégie appropriée pour disséquer l’interaction ou la contribution particulière de ces cellules dans la TVA nécessite l’isolement des deux types de cellules à partir d’une même biopsie graisseuse pour réaliser des tests in vitro qui reflètent aussi similaires que possible les propriétés in vivo qui régulent le métabolisme de la TVA.

Bien que les méthodes de dissociation non enzymatique basées sur les forces mécaniques pour briser l’AT garantissent une manipulation minimale, ces méthodes ne peuvent pas être utilisées si l’objectif est d’étudier les cellules SVF, car elles ont une efficacité moindre dans la récupération cellulaire et une faible viabilité cellulaire par rapport aux méthodes enzymatiques, et un plus grand volume de tissu est nécessaire16,17. La digestion enzymatique à l’aide de la collagénase est une méthode douce qui permet une digestion adéquate du collagène et des protéines de la matrice extracellulaire des tissus fibreux tels que WAT18 et est fréquemment utilisée lorsque la trypsine est inefficace ou dommageable19. Le protocole fournit des directives de dépannage fondamentales pour isoler efficacement des adipocytes matures viables et des cellules SVF à partir de biopsies de VAT humaines en un seul processus, en utilisant une technique de digestion enzymatique de la collagénase, fournissant des informations pour assurer des rendements élevés (quantité, pureté et intégrité) d’ARN total à partir d’adipocytes matures, y compris des microARN, pour les applications d’expression en aval. Simultanément, le protocole est optimisé pour identifier les sous-ensembles de macrophages des cellules SVF grâce à la coloration de plusieurs marqueurs membranaires pour une analyse plus approfondie par cytométrie en flux20.

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Protocole

Ce protocole a été approuvé par l’IRB de l’Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). La participation était volontaire et toutes les femmes inscrites ont signé le formulaire de consentement éclairé.

1. Prélèvement de tissu adipeux viscéral

  1. Obtenez des biopsies de TVA par omentectomie partielle pendant la césarienne de femmes adultes en bonne santé ayant une grossesse unique à terme sans travail.
  2. Après la fermeture utérine et l’hémostase, procédez à l’identification du plus grand épiploon et étendez-le sur une compresse humide. L’AT exposée est la TVA.
  3. Localisez le plus gros vaisseau sanguin et tracez une ligne imaginaire de 7 x 5 cm jusqu’à la plus grande base de l’épiploon.
  4. Identifiez une zone avasculaire et utilisez une pince Kelly pour percer la face externe de la TVA.
  5. Utilisez une pince d’Ochsner pour serrer le côté proximal et distal dans la zone où le VAT a été percé et utilisez des ciseaux Metzenbaum pour couper le tissu.
  6. Nouez le grand épiploon avec de la soie noire numéro 1.
  7. Retirez la pince d’Ochsner et évaluez l’hémostase.
  8. Placez la biopsie VAT dans un récipient stérile et transportez-la immédiatement au laboratoire.

2. Digestion enzymatique du tissu adipeux viscéral et isolement des adipocytes matures et des cellules de la fraction vasculaire stromale

  1. Peser la biopsie de VAT et rincer avec 1x PBS pH 7,4.
  2. Coupez 4 g de TVA et utilisez des ciseaux pour couper le tissu en petits morceaux dans un plateau de dissection.
  3. Transférez la TVA hachée dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml, ajoutez 20 ml de PBS et agitez doucement pour éliminer l’excès de globules rouges.
  4. Jetez le PBS et répétez la procédure deux fois.
  5. Transférer la TVA dans un nouveau tube à centrifuger stérile de 50 mL et ajouter 25 mL de solution de digestion (0,25 % de collagénase de type II, 5 mM de glucose, 1,5 % d’albumine dans le PBS).
  6. Incuber à 37 °C pendant 60 min dans un agitateur orbital à 125 tr/min.
  7. Filtrez le tissu digéré à travers trois couches de gaze dans un nouveau tube à centrifuger stérile de 50 ml.
  8. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
  9. Deux phases sont obtenues, une phase supérieure qui correspond aux adipocytes matures, tandis que les cellules SFV restent dans la cuillère. Transférez délicatement les adipocytes matures dans un nouveau tube à centrifuger stérile de 50 ml à l’aide d’une pipette de transfert.
  10. Ajouter 20 mL de PBS froid, agiter doucement et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
  11. Jetez le PBS et répétez la procédure deux fois.
  12. À l’aide d’une pipette de transfert, transférez délicatement les adipocytes matures dans un tube de microcentrifugation exempt de DNase-RNase de 1,5 ml.
  13. Centrifuger à 200 x g pendant 1 min à 4 °C et éliminer l’excès de PBS à l’aide d’une micropipette P200. Répétez cette étape si nécessaire.
  14. Transférez doucement 300 μL de suspension adipocytaire mature dans des tubes à microcentrifuger exempts de DNase-RNase de 1,5 ml. Conserver les adipocytes matures à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN.
    REMARQUE : Les adipocytes ne forment pas de granules.
  15. Une fois les adipocytes séparés (étape 2.9), aspirer la majeure partie de la solution de digestion avec une pipette de transfert, en gardant la pastille de SVF au fond du tube.
  16. Transférez la pastille avec les cellules SVF dans un nouveau tube à centrifuger de 50 mL à l’aide d’une pipette de transfert.
  17. Lavez doucement la pastille de cellule, en la remettant en suspension dans 20 mL de PBS 1x froid en pipetant de haut en bas.
  18. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter rapidement le surnageant par décantation.
  19. Effectuez un deuxième lavage en répétant les étapes 2.17 et 2.18.
  20. Ajouter 5 mL de tampon de lyse des globules rouges équilibré à la température ambiante (RT) dans la pastille de FVS et mettre en suspension par pipetage répété. Ne pas vortex.
  21. Incuber pendant 5 min à RT et centrifuger pendant 5 min à 800 x g. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette de transfert et jetez-le correctement.
  22. Pour neutraliser le tampon de lyse, ajouter 10 mL de PBS froid et mélanger doucement jusqu’à ce que la pastille cellulaire se désagrège.
  23. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min pour obtenir la pastille SVF et jeter le PBS. Une pastille blanche doit être visible au fond du tube.
  24. Remettre les cellules en suspension dans 5 mL de PBS 1x à RT par pipetage répété et filtrées à travers trois couches de gaze dans un nouveau tube conique de 50 mL. Par la suite, ces cellules seront utilisées pour la caractérisation de sous-populations de macrophages par cytométrie en flux.

3. Extraction de l’ARN des adipocytes matures

  1. Préparez une zone propre, en utilisant un spray de décontamination RNase pour éviter la dégradation de l’ARN. Utilisez un jeu de pipettes réservé aux procédures d’ARN. Tous les tubes et embouts utilisés doivent être exempts de RNase.
  2. Décongeler la suspension adipocytaire mature (section 2.14) à 4 °C si elle a été conservée à -80 °C.
    REMARQUE : Évitez plusieurs cycles de gel-dégel.
  3. Lyser les cellules en ajoutant 1 000 μL de réactif à base d’acide-guanidinium-phénol et bien mélanger avec une micropipette P1000 pour homogénéiser.
  4. Incuber pendant 5 min à RT pour stimuler la dissociation des complexes nucléoprotéiques.
  5. Lysat de cellule centrifuge pendant 5 min à 12 000 x g à RT. Trois phases seront obtenues : une phase supérieure (jaune) correspondant aux lipides adipocytaires, une phase intermédiaire (rose) correspondant aux acides nucléiques, et une pastille (débris cellulaire).
  6. Retirez délicatement la couche lipidique à l’aide d’une micropipette P200.
  7. Transvasez la phase médiane dans un nouveau tube de 2 mL, en évitant de perturber les restes lipidiques et les pastilles (environ 700 μL).

4. Purification de l’ARN total, y compris les microARN

REMARQUE : Une méthode de purification de l’ARN total sur colonne est utilisée pour obtenir de l’ARN total de haute qualité.

  1. Ajouter un volume égal d’éthanol (95 % à 100 %) à l’échantillon de la section 3.7, soit environ 700 μL, et mélanger à la main en inversant le tube pendant 10 s.
  2. Transvaser 700 μL du mélange dans une colonne insérée dans un tube de prélèvement, centrifuger et jeter le flux.
  3. Rechargez la colonne et répétez l’étape 4.2.
  4. Transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte.
  5. Ajouter 400 μL de tampon de prélavage dans la colonne et centrifuger. Jetez le flux et répétez cette étape.
  6. Ajouter 700 μL de tampon de lavage dans la colonne et centrifuger pendant 2 min.
  7. Transférez soigneusement la colonne dans un tube sans nucléase.
  8. Ajouter 50 μL d’eau sans nucléase directement dans la matrice de la colonne et éluer l’ARN par centrifugation. Préparer des aliquotes de 10 μL à l’aide de tubes microfuges de 200 μL.
  9. Mettez immédiatement des aliquotes sur de la glace et utilisez l’une d’entre elles pour déterminer la concentration et la pureté de l’ARN.
  10. Préparer une aliquote de 5 μL d’ARN total ajustée à 100 ng/μL pour mesurer l’intégrité de l’ARN et la concentration en microARN.
  11. Conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.

5. Détermination de la concentration, de la pureté et de l’intégrité de l’ARN adipocytaire mature ; test de quantification des microARN

REMARQUE : Les déterminations de la concentration et de la pureté de l’ARN sont effectuées à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis ; L’intégrité de l’ARN et la quantification des miARN sont effectuées à l’aide d’un analyseur de contrôle de la qualité de l’ARN.

  1. Lavez le lecteur d’échantillons avec de l’eau de qualité moléculaire et essuyez-le.
  2. Chargez 2 μL d’eau d’élution (blanc), changez le paramètre en ARN et cliquez sur le bouton Vide .
  3. Chargez 2 μL d’échantillon et cliquez sur le bouton Mesurer .
  4. Une fois la lecture terminée, notez les rapports A260/A280 et A260/A230 ainsi que la quantité d’ARN (ng/μL) (figure 1A).
    REMARQUE : L’ARN avec un rapport OD260/OD280 et OD260/OD230 autour de 2,0 est considéré comme pur.
  5. Mesurez l’indice d’intégrité de l’ARN (RIN) à l’aide d’une trousse d’intégrité de l’ARN en suivant les instructions du fabricant (figure 1B).
    NOTE : UN RIN = 10 correspond à un ARN intact, tandis qu’un RIN ≤ 3,0 indique un ARN fortement dégradé. Pour les puces d’expression ou la RT-qPCR, utilisez l’ARN avec RIN ≥ 6.0.
  6. Utilisez une petite trousse d’ARN pour déterminer la concentration et le pourcentage de microARN, en suivant les instructions du fabricant (figure 1C).
    REMARQUE : Pour éviter la surestimation des petits et micro-ARN, utilisez des échantillons d’ARN avec RIN ≥ 6.0.

6. Nombre et viabilité des cellules de la fraction vasculaire stromale

  1. Diluer 10 μL de suspension de cellules SVF (section 2.24) dans 90 μL de solution de bleu de trypan à 0,4 % (dilution finale 1 :10) et appliquer 10 μL à un hémocytomètre standard.
  2. Comptez soigneusement les cellules viables, à l’exclusion des cellules mortes, dans quatre carrés au coin de la chambre de comptage.
  3. Déterminer la concentration cellulaire présente dans la suspension d’origine : Concentration cellulaire = Nombre total de cellules/4 x facteur de dilution (10) x 10 000 = cellules/mL
  4. Pour calculer le rendement cellulaire (cellules par gramme de tissu) obtenu, multipliez la concentration cellulaire par le volume total de l’échantillon d’origine (en mL) et divisez par le poids du tissu digéré (en grammes).
  5. Évaluez la viabilité cellulaire en pourcentage de cellules vivantes comme suit : % de viabilité = (Nombre de cellules viables / Nombre total de cellules) x 100.

7. Caractérisation des sous-ensembles de macrophages à partir de la fraction vasculaire stromale

  1. Transférer un total de 1 x 10cellules 6 SVF/mL dans un tube à essai en polypropylène à fond rond de 5 mL pour la cytométrie en flux et les cellules en pastilles par centrifugation à 800 x g pendant 5 min à 4 °C.
  2. Vortex avec précaution pour détacher la pastille et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de 1x PBS à RT.
  3. Ajouter une concentration optimale pré-titrée de chaque anticorps monoclonal conjugué au fluorochrome spécifique d’un antigène de surface cellulaire ; mélanger délicatement et incuber 15 min dans l’obscurité à RT.
  4. Ajouter un excès de 1x PBS froid (≈ 1 mL) et centrifuger le SVF à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
  5. Éliminer rapidement les surnageants par décantation. Attention à ne pas déranger le granulé.
  6. Ajouter 500 μL de 1x solution de lyse et incuber 15 min à RT, en protégeant les tubes de la lumière directe.
  7. Retirer la solution après centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et conserver à 2–8 °C dans l’obscurité jusqu’à l’acquisition des données.
  8. Tourbillonnez complètement les cellules à basse vitesse pour réduire l’agrégation avant d’acquérir.
  9. Remettre la pastille de FVS en suspension dans 5 mL de liquide de gaine à RT, puis filtrer à travers trois couches de gaze dans un nouveau tube à essai en polypropylène à fond rond de 5 mL avant l’analyse par cytométrie en flux, afin de réduire l’obstruction des lignes de tri cellulaire.
  10. Vortex brièvement chaque tube avant l’analyse.
  11. Acquérir des données à partir des échantillons d’intérêt. Pour l’analyse de flux, comptez un minimum de 10 000 événements.
    REMARQUE : Si vous utilisez un cytomètre en flux de tri cellulaire, séparez les macrophages pour les appliquer dans des études ultérieures.

8. Stratégie de contrôle

  1. Tracez la hauteur ou la largeur en fonction de la zone de la dispersion directe (FSC) pour déterminer la population singulet (Figure 2A).
  2. Sélectionnez les cellules en traçant la zone de diffusion latérale (SSC) par rapport à la FSC, en éliminant les débris cellulaires (Figure 2B).
  3. À partir de cellules sélectionnées, identifiez les populations exprimant CD45 comme cellules hématopoïétiques (Figure 2C) et les cellules doublement positives CD45/CD14 comme macrophages (Figure 2D).
  4. À partir des macrophages CD45+/CD14+, détecter les cellules HLA-DR négatives et positives (Figure 2E).
    REMARQUE : Incluez les commandes de compensation pour le panel d’anticorps et ajustez le chevauchement spectral sur un cytomètre en flux multicolore adapté au panel. Nous effectuons une analyse par cytométrie en flux à l’aide d’un cytomètre équipé de trois lasers (laser violet 405 nm, laser bleu 488 nm et laser rouge 640 nm), et de détecteurs pour les fluorochromes indiqués.

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Résultats

Ce protocole décrit une méthode enzymatique utilisant la digestion de la collagénase suivie d’une centrifugation différentielle pour isoler, en un seul processus, des adipocytes matures viables et des cellules SVF à partir de biopsies de TVA obtenues sur des femmes enceintes en bonne santé après une omentectomie partielle. Dans ce cas, nous utilisons les adipocytes pour l’extraction de l’ARN et le SVF pour le phénotypage des macrophages.

Le protocole d’extraction de l’ARN a permis d’obtenir de...

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Discussion

La TVA joue un rôle crucial dans la régulation métabolique et l’inflammation. L’intérêt croissant pour le rôle des adipocytes et des cellules immunitaires dans l’inflammation chronique associée à l’obésité a conduit au développement de différentes techniques pour séparer les SVF et les cellules graisseuses présentes dans l’AT. Cependant, la plupart des techniques ne permettent pas d’obtenir ces deux ensembles différents de cellules viables pour des applications en aval à partir d’une même biopsie de TVA en une seule proc...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par l’Instituto Nacional de Perinatologia (numéros de subvention : 3300-11402-01-575-17 et 212250-3210-21002-06-15) et le CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (numéro de subvention 2015-3-2-61661).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes PCR 0,2 mLAxygenPCR-02-CRNase, DNase libre et apyrogène
Tubes microcentrifuges 1,5 mLAxygenMCT-150-CRNase, DNase et apyrogène
10 mL Pipettes sérologiquesCorningCLS4101-50EAEmballées individuellement
10 µ ; L pointe de pipette universelleAxygenT-300-L-RRNase, sans DNase et apyrogène
10 & micro ; L pointe de pipette universelleAxygenT-300-R-SRNase, sans DNase et apyrogène
1000 µ ; L pointe de pipette universelleAxygenT-1000-B-RRNase, sans DNase et apyrogène
Tube de microcentrifugation de 2,0 mLAxygenMCT-200-CRNase, sans DNase et apyrogène
200 µ ; L pointe de pipette universelleAxygenT-200-Y-RRNase, DNase sans DNase et apyrogène
2100 Bioanalyseur Agilent
G2939BA-2101 Bioanalyseur PCAgilentG2953CA2100 Expert Logiciel préinstallé dans le PC
5 ml Tube à essai en polystyrène à fond rondCorning352003  ;Capuchon à pression, stérile
Tubes à centrifuger de 50 mLCorningCLS430828-100EARéactif à base de polypropilène, à fond conique et stérile
base d’acide-guanidinium-phénolZymo ResearchR2050-1-200TRI ou similaire
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511-Agilent
Small RNA Kit Agilent5067-1548-APC
/Cy7 Anticorps CD14 humainBioLegend3256200,4 mg/106 cellules, présentes sur les monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker--250 ml, non stérile
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA3912-100GFraction de choc thermique, pH 5,2, &ge ; 96 %
Station d’amorçage de puceAgilent5065-9951-Collagénase
type IIGibco17101-015Poudre
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270-100GPoudre
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051Livré avec 50 mL TRI reagen
Pince à dissectionner--Acier, mâchoires dentelées et rondes extrémités
Plateau de dissection--Acier inoxydable
Alcool éthyliqueSigma-AldrichE7023-500ML200  ; preuve, pour la biologie moléculaire
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003-FACS
Lysing Solution BDBiosciences349202-FACSAria
III Cytomètre en flux/Trieur de cellulesBD Biosciences
648282-FASCDiva SoftwareBD Biosciences642868Software v6.0 préinstallé
HemacytometerSigmaZ359629-1EA-Compteur
de cellules manuel--
Ciseaux de dissection Mayo--Microcentrifugeuse en acier inoxydable
--
Spectrophotomètre NanodropThermo ScientificND2000LAPTOP-Agitateur
orbital--Température et vitesse réglables
P10  ; Volume variable  ; micropipette  ;Thermo Scientific-Finnpipette46420401 à 10 &mu ; L
P1000  ; Volume variable  ; micropipette  ;Thermo Scientific-Finnpipette4642090100 à 1000 &mu ; L
P2  ; Volume variable  ; micropipette  ;Thermo Scientific-Finnpipette46420100,2 à 2 &mu ; L
P200  ; Volume variable  ; micropipette  ;Thermo Scientific-Finnpipette464208020 à 200 &mu ; L
Rack de stockage de tubes PCRAxygenR96PCRFSP-PE
/Cy5 anti-HLA-DR humainBioLegend3076080,0625 mg/106 cellules, présentes sur les macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-humain CD45 AnticorpsBioLegend3040160,1 mg/106 cellules, présentes sur les leucocytes, clone H130
Solution salinetamponnée au phosphateSigma-AldrichP3813-10PAKPoudre, pH 7,4, pour la préparation de solutions de 1 L
Contrôleur de pipette---
Tampon de lyse des globules rougesRoche11 814 389 001Pour la lyse préférentielle des globules rouges du sang total humain
Centrifugeuse réfrigérée--Adaptateur Whit pour tubes coniques de 50 mL
Récipient d’échantillons---
Pipette de transfertThermo Scientific-Samco204-1STrypan stérile
BleuGibco15250-0610,4 %
Solution Porte-tubes--Pour différentes tailles de tubes
Vortex Mini ShakerCientifica SENNABV101-
à - à température réglable

Références

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