Microinjection d’oeufs et accouplement efficace pour l’édition du génome dans le Firebrat Thermobia domestica

Résumé

Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.

Résumé

Le firebrat Thermobia domestica est une espèce amétabolique et sans ailes qui convient à l’étude des mécanismes de développement des insectes qui ont mené à leur rayonnement évolutif réussi sur la terre. L’application d’outils génétiques tels que l’édition du génome est la clé pour comprendre les changements génétiques qui sont responsables des transitions évolutionnaires dans une approche Evo-Devo. Dans cet article, nous décrivons notre protocole actuel pour générer et maintenir des souches mutantes de T. domestica. Nous rapportons une méthode d’injection sèche, comme alternative à la méthode d’injection humide rapportée, qui nous permet d’obtenir des taux de survie sensiblement élevés dans les embryons injectés. Nous signalons également un environnement optimisé pour accoupler les adultes et obtenir les générations suivantes avec une grande efficacité. Notre méthode souligne l’importance de tenir compte de la biologie unique de chaque espèce pour l’application réussie des méthodes d’édition du génome aux organismes modèles non traditionnels. Nous prévoyons que ces protocoles d’édition du génome aideront à mettre en œuvre T. domestica en tant que modèle de laboratoire et à accélérer davantage le développement et l’application d’outils génétiques utiles chez cette espèce.

Introduction

Thermobia domestica appartient à l’un des ordres d’insectes les plus basiques, Zygentoma, qui conserve un cycle de vie ancestral amétabolique et sans ailes. Cette position phylogénétique basale et ses caractéristiques ancestrales placent cette espèce comme un modèle attrayant pour l’étude des mécanismes sous-jacents au succès des insectes sur Terre, qui couvrent plus de 70 % des espèces animales^{décrites 1}. T. domestica a longtemps été utilisé principalement pour étudier les caractéristiques ancestrales de la physiologie des insectes en raison de ses caractéristiques appropriées en tant que modèle de laboratoire, comme un cycle....

Protocole

1. Maintien des colonies de laboratoire

1. Pour le maintien des populations sauvages et mutantes, utilisez un grand contenant en plastique (460 mm x 360 mm x 170 mm) avec des aliments artificiels réguliers pour le poisson, de l’eau dans des tasses en plastique avec un trou de ventilation sur le dessus, un papier plié pour cacher les insectes et du coton superposé pour pondre desœufs ( figure 2A). Gardez toutes les cultures T. domestica à l’intérieur des incubateurs de 37 °C et réglez l’humidité relative (HR) à l’intérieur de chaque récipient à 60%-80%.
   REMARQUE : Étant donné que T. domestica absorbe la vapeur d....

Résultats

Dans nos mains, environ 100 oeufs peuvent être bien injectés avec un capillaire à injection unique quand il a la pointe adéquate (Figure 3C). L’injection du complexe de ribonucleoprotein de gRNA/Cas9 dans les embryons dans les 8 premières h après la ponte a comme résultat des indélébiles au site visé de gRNA. Cela provoque des mutations bialéliques dans certaines cellules de la génération injectée (G0) et donc des phénotypes de mosaïque mutante sont généralement obtenus en G0. Par exemple, l.......

Discussion

Pour la génération réussie du mutant T. domestica désiré avec CRISPR/Cas9, il est d’abord important de recueillir un nombre suffisant d’embryons mis en scène pour injection. Pour une collecte constante d’un nombre suffisant d’œufs T. domestica, la clé est de sélectionner une taille appropriée du récipient pour avoir une densité de population inférieure, car elle aiderait à l’achèvement réussi d’une série de comportements complexes d’accouplement, qui se répète après chaque mue^{adulte 13.......}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque 24 puits	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µ ; g	Technologies ADN intégrées	1081060
Nettoyant antistatique	Hozan	Z-292	pour l’élimination de l’électricité statique d’une plaque à 24 puits
Barrier Box 20.7L	AS ONE	4-5606-01	Grand conteneur
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000013	Micro-injecteur électronique
Femtotip II, injection capillaire	Eppendorf	5242957000	Injection de verre capillaire
High Pack 2440mL	AS ONE	5-068-25	Récipient de taille moyenne
Incubateur	Panasonic	MIR-554-PJ	pour 37 ° ; C. Pas besoin d’humidifier à l’intérieur de l’incubateur.
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	Enzyme PCR pour le génotypage. Optimisé pour une amplification à partir de modèles bruts.
Support magnétique	Narishige	GJ-8	pour tenir le micromanipulateur
Microloader	Eppendorf	5242956003
Micromanipulateur	Narishige	MM-3
Microscope	Olympus	SZX12	pour la microinjection. Un grossissement de plus de 35X est suffisant pour la micro-injection
MultiNA	Shimadzu	MCE-202	Système d’électrophorèse à micropuce
NiceTac	Nichiban	NW-5	Ruban adhésif double face pour placer les œufs sur une lame de verre
Pinceau (crin de cheval)	Pentel	ZBS1-0
Plat de culture végétale	SPL Life Sciences	310100	Plat d’accouplement et approvisionnement en eau pour des récipients de grande et moyenne taille
Protéinase K, recombinante, PCR Lyophilize de Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12 microscope	Olympus	SZX 12	grossissement de plus de 35X est suffisant pour la micro-injection
Poudre de talc	Maruishi	877113
Tetra Goldfish Gold	Growth Spectrum Marques		Nourriture artificielle pour poissons ordinaire

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