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Article de méthode

Établir les exigences de pollinisation dans la prune japonaise par surveillance phénologique, pollinisation manuelle, microscopie à fluorescence et génotypage moléculaire

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DOI :

10.3791/61897

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9 novembre 2020

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1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza), Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX), Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Dans cet article

Résumé

Une méthodologie pour la détermination des besoins de pollinisation dans les hybrides japonais de type prune est décrite, qui combine les pollinisations sur le terrain et en laboratoire et les observations de tubes polliniques sous la microscopie à fluorescence avec l’identification des génotypes Spar PCR et la surveillance de la floraison pour la sélection des pollinisateurs.

Résumé

Les cultivars de prunes japonais couramment cultivés sont des hybrides interspécifiques dérivés de croisements entre le Prunus salicina original et d’autres espèces de Prunus. La plupart des hybrides présentent une auto-incompatibilité gamétophytique, qui est contrôlée par un S-locusunique et hautement polymorphe qui contient plusieurs allèles. La plupart des hybrides cultivés sont auto-incompatibles et ont besoin du pollen d’un donneur compatible pour fertiliser leurs fleurs. L’établissement des besoins de pollinisation dans la prune japonaise devient de plus en plus important en raison du nombre élevé de nouveaux cultivars dont les besoins en pollinisation sont inconnus. Dans ce travail, une méthodologie pour la détermination des besoins de pollinisation chez les hybrides japonais de type prune est décrite. L’autocompatibilité est déterminée par des pollinisations manuelles sur le terrain et en laboratoire, suivies de la surveillance de l’allongement du tube pollinique par microscopie à fluorescence et de la surveillance de la maturation des fruits sur le terrain. La sélection des cultivars polliniseurs est évaluée en combinant l’identification des génotypes Spar analyse PCR avec la surveillance du temps de floraison sur le terrain. Connaître les besoins de pollinisation des cultivars facilite la sélection des cultivars pour la conception de nouveaux vergers et permet la détection précoce des problèmes de productivité liés au déficit de pollinisation dans les vergers établis.

Introduction

La prune japonaise(Prunus salicina Lindl.) est originaire de Chine1. Au 19e siècle,cette culture a été introduite du Japon aux États-Unis, où elle a été croisée avec d’autres prunes diploïdes nord-américaines2. Au20ème siècle, certains de ces hybrides ont été répandus dans les régions tempérées du monde entier. De nos jours, le terme « prune japonaise » fait référence à une large gamme d’hybrides interspécifiques dérivés de croisements entre le P. salicina original avec jusqu’à 15 autres diploïdes Prunus spp.3,4,5.

La prune japonaise, comme d’autres espèces de la famille des Rosaceae, présente une auto-incompatibilité gamétophyte (GSI), qui est contrôlée par un S-locusunique et hautement polymorphe contenant plusieurs allèles6. Le S-locus contient deux gènes qui codent une ribonucléase(S-RNase)exprimée dans le pistil, et une protéine F-box (SFB) exprimée dans le grain de pollen7. Dans la réaction d’auto-incompatibilité, lorsque l’allèle Sexprimé dans le grain de pollen (haploïde) est le même que l’un des deux exprimés dans le pistil (diploïde), la croissance du tube pollinique à travers le style est arrêtée en raison de la dégradation de l’ARN du tube pollinique par l’action de la S-RNase8. Étant donné que ce processus empêche la fécondation du gamétophyte femelle dans l’ovule, GSI favorise le croisement entre les cultivars.

Bien que certains cultivars de prunes japonais soient autocompatibles, la plupart des cultivars actuellement cultivés sont auto-incompatibles et ont besoin du pollen de donneurs intercompatibles pour fertiliser leurs fleurs3. Dans les espèces de fruits à noyau du genre Prunus telles que l’amande9,l’abricot10,11,12 et la cerise douce13,les besoins en pollinisation des cultivars peuvent être établis par différentes approches. L’auto-(in)compatibilité peut être déterminée par l’autopollinisation des fleurs sur le terrain et la surveillance ultérieure de la fructification, ou par des autopollinisations semi-in vivo dans des conditions contrôlées en laboratoire et l’observation de tubes polliniques au microscope14,15,16,17,18 . Les relations d’incompatibilité entre cultivars peuvent être déterminées par des pollinisations croisées sur le terrain ou en laboratoire à l’aide du pollen du cultivar polliniseur potentiel, et par l’identification des allèles Sde chaque cultivar par analyse PCR14,15,16 , 19,20,21,22 . Chez des espèces telles que la cerise douce ou l’amande, l’auto-(in)compatibilité peut également être évaluée par l’identification d’allèles S particuliers associés à l’autocompatibilité, comme S4' dans la cerise douce13 ou Sf dans l’amande23.

Plusieurs programmes de sélection de prunes des principaux pays producteurs libèrent un certain nombre de nouveaux cultivars2,14, dont beaucoup ont des besoins de pollinisation inconnus. Dans ce travail, une méthodologie pour la détermination des besoins de pollinisation chez les hybrides japonais de type prune est décrite. L’autocompatibilité est déterminée par des autopollinisations sur le terrain et en laboratoire, suivies d’observations de tubes polliniques sous microscopie à fluorescence. La sélection des cultivars polliniseurs combine l’identification des génotypes Spar analyse PCR avec le suivi du temps de floraison sur le terrain.

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Protocole

1. Pollinisation manuelle sur le terrain

  1. Extraction du pollen
    1. Pour obtenir du pollen, collectez les boutons floraux au stade D24, selon le stade 57 sur l’échelle BBCH25,26.
      REMARQUE: Plus de boutons floraux sont nécessaires dans la prune japonaise que dans les autres espèces de Prunus parce que leurs anthères produisent moins de pollen.
    2. Retirez les anthères à l’aide d’un maillage en plastique (taille des pores de 2 mm x 2 mm) et placez-les sur du papier à température ambiante pendant 24 h jusqu’à la déhiscence de l’anthère.
    3. Tamiser les grains de pollen à travers une maille fine (taille des pores de 0,26 mm x 0,26 mm) et les conserver dans un tube en verre de 10 mL avec un bouchon à 4 °C jusqu’à utilisation.
  2. Pollinisation des fleurs émasculées
    1. Lorsqu’entre 10% et 20% des fleurs sont ouvertes, sélectionnez et étiquetez plusieurs branches. Enlevez les fleurs ouvertes et les jeunes bourgeons, ne laissant que les boutons floraux au stade D24, selon le stade 57 sur l’échelle BBCH25,26.
    2. Enlevez les pétales, les sépales et les étamines de 800 à 1 000 boutons floraux par traitement avec des ongles ou une pince à épier.
    3. Polliniser les pistils à la main à l’aide d’un pinceau fin 24 h après l’émasculation. Certaines branches contiennent la moitié des pistils avec du pollen du même cultivar, et l’autre moitié avec du pollen compatible d’un autre cultivar comme témoin. Veillez à ne pas contaminer le bout du doigt ou le pinceau avec des grains de pollen provenant d’autres cultivars.
    4. Enregistrez le nombre hebdomadaire de fleurs et de fruits en développement pour caractériser le modèle de chute de fruits et quantifier la fructification finale dans chaque traitement de pollinisation.
  3. Pollinisation supplémentaire sur le terrain
    1. Quelques jours avant l’ouverture des premières fleurs, enfermez les arbres sélectionnés dans une cage maillée de 0,8 mm pour éviter l’arrivée d’insectes pollinisateurs.
    2. Lorsque 10 % à 20 % des fleurs sont ouvertes, sélectionnez et étiquetez plusieurs branches par traitement de pollinisation, ce qui laisse 1 000 à 1 500 fleurs par traitement.
    3. Le lendemain, lorsque les fleurs sont ouvertes, polliniser chaque fleur à l’aide d’un pinceau avec le pollen correspondant (pollen du même cultivar pour l’autopollinisation et d’autres cultivars compatibles comme contrôle de pollinisation croisée).
    4. Polliniser tous les deux jours jusqu’à ce que toutes les fleurs s’ouvrent.
    5. Enregistrez le nombre hebdomadaire de fleurs et de fruits en développement depuis l’anthèse jusqu’à la récolte pour caractériser le schéma de chute des fruits et quantifier la fructification finale dans chaque traitement de pollinisation.

2. Pollinisations manuelles en laboratoire

  1. Collectez 50 à 100 fleurs au stade D24,selon le stade 57 de l’échelle BBCH25,26.
  2. En laboratoire, émasculer 30 fleurs par traitement (auto-pollinisation et pollinisation croisée).
    REMARQUE: L’émasculation doit être effectuée avec précaution pour éviter tout dommage sur les pistils.
  3. Faites une coupe fraîche sur la base de chaque pédicelle de fleur sous l’eau avant de la placer sur un morceau de mousse de fleuriste humide (un morceau de mousse pour chaque traitement de pollinisation).
  4. Polliniser à la main chaque pistil 24 heures plus tard à l’aide d’un pinceau fin avec du pollen collecté précédemment (voir rubrique 1.1). Polliniser un ensemble de pistils avec du pollen du même cultivar, et l’autre ensemble avec du pollen d’un cultivar compatible comme témoin.
  5. Laisser les pistils pollinisés 72 h après la pollinisation à température ambiante. La mousse florale doit être continuellement mouillée avec de l’eau.
  6. Fixer les pistils dans une solution fixatrice d’éthanol/acide acétique (3:1) pendant au moins 24 h à 4 °C. Remplacez le fixateur par de l’éthanol à 75 %. Les échantillons peuvent être conservés dans cette solution à 4 °C jusqu’à utilisation27.
    REMARQUE: Assurez-vous que les échantillons sont complètement immergés dans la solution.

3. Observations microscopiques

  1. Évaluation de la germination du pollen in vitro
    1. Pour élaborer le milieu de germination du pollen, dissoudre 25 g de saccharose sur 250 mL d’eau distillée, puis ajouter 0,075 g de nitrate de calcium [Ca(NO3)2]et 0,075 g d’acide borique (H3BO3).
    2. Ajouter 2 g de gélose à la solution et mélanger jusqu’à dissolution complète28.
    3. Pour stériliser le milieu, autoclavez-le à 120 °C pendant 20 min. Refroidir le milieu et, avant qu’il ne se solidifie, répartir 3 mL par boîte de Petri stérile (55 mm x 12 mm) dans une hotte à écoulement laminaire stérile. Après solidification moyenne, conserver les boîtes de Petri enveloppées dans du papier d’aluminium à 4 °C jusqu’à utilisation.
    4. Répandre le pollen de chaque cultivar précédemment utilisé comme donneur de pollen dans les pollinisations contrôlées dans deux boîtes de Pétri et les incuber à 25 °C pendant 24 h.
      REMARQUE: Les milieux de culture inoculés peuvent être observés par microscopie immédiatement après ou stockés à -20 ° C jusqu’à utilisation. À cette fin, les boîtes de Petri doivent être changées du congélateur au réfrigérateur 24 heures avant les observations microscopiques.
    5. Pour observer les grains de pollen, préparez une solution de bleu d’aniline à 1% (v / v) qui tache le callose. Tout d’abord, préparer une solution tribasique de phosphate de potassium(K3PO4) de0,1 N en dissolvant 7,97 g de K3PO4 dans 1 000 mL d’eau distillée. Pour élaborer la solution de bleu d’aniline à 1 % (v/v), dissoudre 1 mL de bleu d’aniline dans 100 mL de 0,1 NK3PO4.
    6. Ajouter 2–3 gouttes de solution de bleu d’aniline à chaque plaque de boîte de Petri et observer après 5 min sous un microscope à épifluorescence UV à l’aide du filtre excitateur BP340-390 et du filtre barrière LP425. Compter les grains de pollen viables et non viables dans trois champs par plaque, chaque champ contenant 100 à 200 grains de pollen, dans deux boîtes de Pétri pour chaque cultivar.
  2. Croissance du tube pollinique
    1. Rincer les pistils fixes avec de l’eau distillée trois fois (1 h chacun, 3 h au total) et transférer à 5 % (p/v) de sulfite de sodium (Na2SO3)à 4 °C pendant 24 h. Pour préparer cette solution, dissoudre 5 g de sulfite de sodium dans 100 mL d’eau distillée.
    2. Autoclaver les pistils à 120 °C pendant 8 min dans du sulfite de sodium à 5 % (p/v) pour ramollir les tissus.
    3. La courge ramollit les pistils dans une goutte de 1% (v / v) de solution de bleu d’aniline sous un verre de couverture sur une lame pour tacher callose.
    4. Observez la croissance des tubes polliniques le long du style au microscope avec épifluorescence UV à l’aide du filtre excitateur BP340-390 et du filtre barrière LP425.

4. Détermination des relations d’incompatibilité

  1. Extraction de l’ADN des feuilles
    1. Pour extraire l’ADN, prélever 3 à 4 jeunes feuilles de chaque cultivar dans le champ, de préférence au printemps.
      REMARQUE: L’ADN peut également être extrait de feuilles matures, mais l’ADN de jeunes feuilles contient moins de composés phénoliques.
    2. Isolez l’ADN à l’aide d’un kit commercial et suivez le kit de protocole fourni (voir table des matériaux).
    3. Quantifier la concentration d’ADN et évaluer la qualité de l’ADN de chaque échantillon à 260 nm dans un spectrophotomètre à microvolume UV-Vis. Ajuster la concentration d’ADN à 10 ng/μL.
  2. Conditions de PCR pour l’amplification de fragments
    1. Étiquetez les tubes et les bouchons PCR de 0,2 mL.
    2. Préparez les réactifs PCR conformément au tableau 1 et laissez-les décongeler sur la glace.
    3. Mettre en place un volume de mélange maître de chaque paire d’amorces dans un microtube de 1,5 mL en fonction du nombre de réactions plus 10% de l’excès, en tenant compte d’un volume de 16 μL par réaction. Ajouter les réactifs en suivant l’ordre du tableau 1 et bien mélanger.
    4. Aliquote 16 μL de mélange maître dans chaque tube PCR de 0,2 mL contenant 4 μL de gabarit d’ADN ou 4 μL d’eau distillée stérilisée comme témoin négatif (C-). Utiliser l’ADN de cultivars dont le génotype est connu comme témoin positif. Mélanger doucement, fermer les tubes de réaction avec les bouchons et centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s pour recueillir tout le volume au fond du tube de réaction.
    5. Placez les tubes de réaction dans le thermocycleur et configurez le programme pcR en utilisant le profil de température suivant: une étape initiale de 3 min à 94 °C, 35 cycles de 1 min à 94 °C, 1 min à 56 °C et 3 min à 72 °C, et une dernière étape de 7 min à 72 °C20.
  3. Électrophorèse et estimation de la taille des fragments
    1. Pour préparer un mini gel d’agarose à 1,7 % (p/v), dissoudre 0,68 g d’agarose et 40 mL de tampon 1x TBE dans une fiole d’Erlenmeyer de 100 mL. Faire fondre la solution en la chauffant au micro-ondes à 600 W à 30 s d’intervalle pour éviter l’ébullition.
    2. Laissez la solution rester sur le banc pour refroidir, puis ajoutez 3,5 μL de solution de coloration aux acides nucléiques.
    3. Placez le plateau de gel dans le support de coulée et placez le peigne sélectionné dans le moule à gel. Assurez-vous d’avoir suffisamment de puits pour chaque produit pcR et échelle d’ADN.
    4. Versez la solution d’agarose dans le moule en gel et laissez-la refroidir jusqu’à la polymérisation. Retirer le peigne du gel polymérisé. Placez le gel dans le système d’électrophorèse horizontale contenant suffisamment de tampon TBE 1x pour couvrir la surface du gel.
    5. Chargez le premier et le dernier puits avec 2 μL de l’échelle de poids moléculaire de l’ADN (échelle d’ADN de 1 kb). Chargez 3 μL de chaque produit de la PCR dans les autres puits. Fermez la chambre, allumez l’alimentation et mettez le gel à 100 V pendant 30 min.
    6. Observez le gel sous la lumière UV à l’aide d’un système de documentation sur le gel. Utilisez l’échelle de poids moléculaire de l’ADN pour déterminer la taille du fragment amplifié et comparez-le avec les témoins positifs afin d’identifier les allèles correspondants.

5. Surveillance des dattes florales

  1. Surveiller la phénologie des différents arbres de chaque cultivar à la floraison sur différentes années. Établissez la durée de la période de floraison de la première (environ 5%) à la dernière fleur ouverte (environ 95%). La pleine floraison est considérée lorsqu’au moins 50% des fleurs sont au stade F24, selon le stade 65 sur l’échelle BBCH25,26.
  2. Pour comparer les dates de floraison des cultivars intercompatibles et déterminer celles qui coïncident au moment de la floraison chaque année, élaborez un calendrier des périodes de floraison avec des données de plusieurs années.

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Résultats

Chaque bouton floral de prune japonaise contient une inflorescence avec 1–3 fleurs. Comme chez les autres espèces de fruits à noyau, chaque fleur est composée de quatre verticilles: carpelle, étamines, pétales et sépales, qui sont fusionnés formant une tasse à la base de la fleur. Les structures florales sont plus petites que les autres fruits à noyau, avec un pistil court et fragile entouré d’étamines qui contiennent une petite quantité de grains de pollen. À pleine floraison, les fleurs de chaque inflorescence apparais...

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Discussion

La méthodologie décrite ici pour les besoins de pollinisation des cultivars de prunes japonais nécessite de déterminer l’auto-(in)compatibilité de chaque cultivar par des pollinisations contrôlées sur le terrain ou en laboratoire, et l’observation ultérieure de la croissance des tubes polliniques par microscopie à fluorescence. Les relations d’incompatibilité sont établies par la caractérisation des S-allèles par génotypage moléculaire. Enfin, la sélection des pollinisateurs est effectuée par la phénologie de s...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par l’Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 et RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón —Fonds social européen, Union européenne (Grupo Consolidado A12-17R), et Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero a été soutenu par une bourse du Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología du Mexique (CONACYT, 471839).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétique GlacialPanreac131008.1611
AgariNtRON Biotechnology25999
Bleu anilineDifco8504-88
Acide borique (H3BO4)Panreac131015.1210
Nitrate de calcium 4-hydraté (Ca(NO3)2 &point moyen ; 4H2O)Panreac131231.1211
CoverglassDeltalabD10246024 mm x 60 mm
Caméra numériqueImagerie Developmet SystemsUI-1490SE
Suite logicielle de caméra numériqueImagerie Developmet Systems4.93.0.
Oligos d’ADNThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM chacunThermoSischer ScientificR0193
DreamTaq Green DNA polyméraseThermoFisher ScientificEP0713
Ethanol 96° ;VWR-Chemicals83804.360
Échelle d’ADN 1Kb (brevet américain n° 4.403.036) (500pb-12Kb)Invitrogen15615-016Taille : 250µ ; g; Conc : 1.0 et micro ; g/µ ; l
Système de documentation sur gelBio-Rad1708195
compteur de mainTamacoTM-4
Logiciel de laboratoire d’imagesd’analyse d’imagesBio-Rad
MetaPhor AgaroseLonza50180
Microcentrifugeuse 5415 REppendorf
microscope avec UV épiflurescenceLeicaDM2500Filtre excitateur BP340-390, Filtre barrière LP425
MicrolamesDeltalabD10000426 mm x 76 mm
Mini système d’électrophorèseFisherbrand14955170
MinicentrifugeuseThermoFisher Scientific15334204
Spectrophotomètre NanoDrop 1000ThermoFisher ScientificND1000
Boîtes de PétriDeltalab20020155 mm x 14 mm
Phosphate de potassium tribasique (K3PO4· ; 1.5H2O)Panreac141513
Primer forward 'Pru C2'ThermoFisherScientific
Primer forward Pru T2'ThermoFisherScientific
Primer reverse 'PCER’ThermoFisherScientific
RedSafe Nucleic Acid Staining SolutioniNtRON Biotechnology21141
SaccharosePanreac131621.1211
Sulfite de sodium anhydre (Na2SO3)Panreac131717.1211
Speedtools Kit d’extraction d’ADN végétalBiotools21272
Tampon TBE (10X)PanreacA0972,5000PE
Thermocycleur T100Bio-Rad
Thermomixeur confortEppendorfT1317
Autoclave vertical Présoclave IIJP Selecta4001725
VortexFisherbrand11746744
Système pour système de documentation sur gel Z605212 1861096

Références

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