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Article de méthode

Prélèvement d’échantillons et analyse du microbiome duodénal

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DOI :

10.3791/61900

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12 janvier 2021

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1Division of Gastroenterology, Hepatology and Parenteral Nutrition, Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 2The Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, 3UCLA Microbiome Center, David Geffen School of Medicine at University of California, 4Department of Surgery, University of California, Los Angeles, 5Department of Medicine and Human Genetics, David Geffen School of Medicine at University of California, 6Cedars-Sinai Cancer and Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

Dans cet article

Résumé

Dans ce manuscrit, nous discutons d’une nouvelle méthode d’échantillonnage et d’analyse du microbiome duodénal. Cette méthode fournit une représentation précise de la diversité et de la composition microbiennes dans le duodénum et pourrait être utile pour une étude plus approfondie du microbiome duodénal.

Résumé

Les changements dans le microbiome ont été corrélés avec la physiologie et la physiopathologie de nombreux systèmes d’organes chez l’homme et chez la souris. Le microbiome intestinal a généralement été étudié à travers des collections d’échantillons fécaux. La facilité d’obtention d’échantillons fécaux a donné lieu à de nombreuses études qui ont révélé des informations concernant le tractus gastro-intestinal luminal distal. Cependant, peu d’études ont abordé l’importance du microbiome dans l’intestin proximal. Étant donné que le duodénum est un site majeur pour la digestion et l’absorption, son microbiome est pertinent pour la nutrition et les maladies du foie et justifie une enquête plus approfondie. Nous détaillons ici une nouvelle méthode d’échantillonnage du microbiome intestinal luminal et muqueux proximal chez des sujets humains subissant une endoscopie supérieure en obtenant une aspiration duodénale et des biopsies. L’obtention d’échantillons est facile et n’est pas affectée par des artefacts tels que l’observance préparatoire du patient, comme cela pourrait être le cas lors de l’obtention d’échantillons du côlon lors de la coloscopie. Les résultats préliminaires montrent que les microbiomes luminal et muqueux diffèrent considérablement, ce qui est probablement lié aux conditions environnementales et aux fonctions barrières. Par conséquent, une combinaison d’aspiration duodénale et de biopsies révèle une image plus complète du microbiome dans le duodénum. Les biopsies sont obtenues à partir des segments descendants et horizontaux du duodénum, qui sont anatomiquement proches du foie et de l’arbre biliaire. Ceci est important pour étudier le rôle de la biologie des acides biliaires et de l’axe intestin-foie dans les maladies du foie. Les biopsies et l’aspiration peuvent être utilisées pour le séquençage de l’ARN ribosomique 16S, la métabolomique et d’autres applications similaires.

Introduction

Le microbiome intestinal est devenu un domaine d’intérêt croissant ces dernières années. Il est maintenant admis que la diversité de la population bactérienne de l’intestin peut différer en fonction de divers facteurs, notamment la génétique, l’alimentation, les médicaments et les influences environnementales1. Des études ont également identifié des profils microbiens uniques liés à diverses maladies gastro-intestinales, telles que l’obésité, les maladies inflammatoires de l’intestin et les maladies du foie 2,3. La majorité des études se concentrent sur le profilage du microbiome du gros intestin par l’analyse d’échantillons de muqueuse fécale et distale4. Bien que la plus forte concentration de bactéries intestinales réside dans le côlon (1012 bactéries/gramme), il existe néanmoins une communauté complexe de microbes résidant dans le duodénum (103/g), le jéjunum (104/g) et l’iléon (107/g) qui joue un rôle clé dans le métabolisme digestif et l’absorption5.

L’intestin grêle sert de site principal de dégradation et d’absorption des nutriments dans le tractus gastro-intestinal. Les bactéries commensales qui tapissent l’intestin grêle jouent un rôle fondamental dans la décomposition chimique des substrats alimentaires et dans la libération de composés bioactifs qui aident à l’absorption des nutriments6. Ces interactions contribuent à un environnement complexe d’activité microbe-microbe et hôte-microbe dans l’intestin grêle7. Une étude observant le microbiote de l’intestin grêle dans des modèles murins a révélé que les souris exemptes de germes nourries avec un régime riche en graisses avaient une absorption des lipides altérée mais, lorsqu’elles étaient colonisées par le microbiote jéjunal, avaient une augmentation directe de l’absorption des lipides6. Une étude pilote humaine dressant le profil du microbiote duodénal d’individus obèses et en bonne santé a révélé que le microbiote duodénal des individus obèses présentait des altérations des voies de dégradation des acides gras et du saccharose, probablement induites dans une relation dépendante de l’alimentation8. De plus, une dysbiose dans le microbiote de l’intestin grêle a été identifiée dans plusieurs maladies, notamment la prolifération bactérienne de l’intestin grêle, le syndrome de l’intestin court, la pochite, la dysfonction entérique environnementale et le syndrome de l’intestin irritable7.

Nous nous intéressons à la relation entre le microbiome et les différents stades de la maladie hépatique chronique. Plus précisément, le duodénum sert de premier site de dégradation chimique et d’absorption nutritionnelle dans l’intestin grêle. De plus, la circulation hépatique porte apporte des nutriments et des métabolites au foie, où ils sont traités et régulés dans la circulation sanguine. La proximité anatomique entre l’intestin et le foie crée un environnement sensible aux réponses pro-inflammatoires qui peuvent survenir en raison d’une défaillance de la barrière intestinale ou d’altérations du microbiome intestinal9. Des études portant sur le microbiome et la progression de la maladie hépatique ont identifié une dysbiose microbienne chez les patients atteints de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), de stéatohépatite (NASH), de maladie alcoolique du foie et de cirrhose10,11. Alors que la majorité des études caractérisent le microbiome du côlon, nous nous sommes intéressés à étudier le microbiome de l’intestin grêle en relation avec les maladies du foie. En utilisant la nouvelle méthode présentée ici, nous avons identifié des profils microbiens duodénaux uniques chez les patients atteints de cirrhose du foie en relation avec le régimealimentaire 12.

Alors que la caractérisation du microbiome de l’intestin grêle continue de devenir un domaine d’intérêt croissant, il est nécessaire de développer des techniques uniformes pour obtenir des échantillons qui représentent avec précision le microbiote de l’intestin grêle. Cependant, il existe des défis associés à l’approvisionnement en échantillons qui ont compliqué l’étude de l’environnement du microbiome de l’intestin grêle. Les méthodes d’échantillonnage actuelles nécessitent des procédures invasives qui sont souvent sujettes à la contamination, comme l’ont souligné Kastlet coll. 7. Nous détaillons ici une nouvelle méthode pour obtenir une aspiration duodénale et des biopsies pour l’analyse microbienne de patients atteints d’une maladie du foie subissant une œsophagogastroduodénoscopie.

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Protocole

Des échantillons duodénaux ont été obtenus au Veteran Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, au Cedars-Sinai Medical Center et au Ronald Reagan UCLA Medical Center après que le protocole clinique de l’étude sur le microbiome, les marqueurs microbiens et les maladies du foie (M3LD) ait été accepté par le comité d’examen institutionnel du comité d’éthique local. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients participants.

1. Consentement des participants

  1. Approchez les sujets ayant un diagnostic de cirrhose du foie de n’importe quelle étiologie avec des endoscopies programmées pour le dépistage variqueux ou l’hypertension portale pour le recrutement. Exclure les patients atteints d’un carcinome hépatocellulaire (CHC).
  2. Présentez l’étude, assurez-vous soigneusement que les participants comprennent et demandez-leur s’ils aimeraient faire du bénévolat dans l’étude. Remplissez un formulaire de consentement éclairé s’ils sont d’accord.
  3. Assurez-vous qu’un professionnel de la santé correctement formé et accrédité effectue l’endoscopie.

2. Prélèvement d’échantillons

  1. Anesthésier le patient avec 50 mg de fentanyl et 2 mg de midazolam. Augmentez la posologie au besoin jusqu’à ce que le patient soit modérément anesthésié et puisse tolérer l’endoscope.
  2. Insérez un endoscope (p. ex. Pentax EG29-i10) dans l’œsophage du patient et progressez vers le pylore.
    REMARQUE : La taille de l’endoscope variera en fonction de la physiologie du patient. N’utilisez pas l’endoscope pour une aspiration avant le prélèvement de l’échantillon afin d’éviter de contaminer le canal de l’endoscope par des sécrétions gastriques ou oropharyngées.
  3. Procurez-vous une lame de microscope et une aiguille de seringue de calibre 18 pour préparer le prélèvement de l’échantillon. Préparez un tampon stérile qui sera utilisé pour transférer les biopsies de la lame de microscope aux cryoflacons.
  4. Lorsque l’endoscope arrive à la deuxième partie du duodénum distal de l’ampoule de Vater, aspirez tout liquide présent à travers un cathéter d’aspiration stérile jetable passé dans le canal de travail de l’endoscope supérieur et recueillez-le dans un récipient d’échantillon jetable de 40 ml. Rincez jusqu’à 30 mL d’eau stérile supplémentaire à l’aide d’une seringue dans le duodénum et aspirez le liquide dans un piège à échantillon liquide pour recueillir un total de 15 mL.
  5. Retirez et fermez immédiatement le récipient d’aspiration fixé au composant d’aspiration du cathéter. Placez le récipient dans un thermos sur de la glace et dans un sac de transport d’échantillons pour le transfert au laboratoire de traitement.
  6. Insérez une pince à biopsie à usage unique de 2,8 mm dans l’orifice situé sur le côté de l’endoscope pour prélever des échantillons de tissu à des fins de recherche. Effectuez 2 passages aléatoires de la pince dans la deuxième partie du duodénum, en recueillant deux morsures de tissu dans chaque passage.
  7. À l’aide d’une aiguille de seringue émoussée de calibre 18, prélevez des échantillons de tissus de la pince et placez-les sur la lame de microscope avant de les transférer dans quatre cryoflacons vides distincts de 2 ml. Vissez fermement les capuchons.
  8. Insérez les 4 cryoflacons hermétiquement bouchés dans un récipient vide, tel qu’un gobelet d’urine, et créez un bain, composé de 20 ml d’éthanol et de glace sèche, pour congeler les biopsies.
  9. Placez les cryoflacons de biopsie dans un récipient isolé en polystyrène sur un lit de glace sèche et transférez les échantillons dans un congélateur à -80 °C pour un stockage à long terme afin de préserver les échantillons.

3. Traitement par aspiration

  1. Après le prélèvement des échantillons biologiques, transférez immédiatement les échantillons biologiques dans un laboratoire de niveau 2 ou supérieur pour traitement.
  2. Retournez doucement le récipient de liquide d’aspiration quatre fois, puis aliquote environ 1,5 mL du liquide dans des cryoflacons de 2 mL.
  3. Stocker les échantillons à -80 °C jusqu’à ce que l’analyse des lots puisse être effectuée.

4. Administration du questionnaire et collecte des données cliniques

  1. Demandez aux participants de remplir des questionnaires pour obtenir de l’information sur l’alimentation, les données démographiques, le tabagisme et l’alcool, les problèmes de santé et les médicaments, et la qualité de vie13.
  2. Examinez les dossiers médicaux pour capturer des données cliniques, y compris les laboratoires cliniques, les données d’imagerie, les médicaments et les complications médicales.

5. Extraction de l’ADN

  1. Effectuer l’extraction de l’ADN immédiatement après le retrait des biopsies duodénales et aspirer hors de l’entreposage à -80 °C. Aucune étape préparatoire n’est nécessaire pour extraire l’ADN des échantillons de biopsie duodénale.
  2. Effectuez l’extraction et le séquençage de l’ADN de tous les échantillons le même jour afin de réduire le risque d’un effet de lot lors de l’analyse. Mettre en place une bibliothèque spécifique aux échantillons collectés avant que les échantillons puissent être séquencés.
  3. Utilisez un kit de micropréparation d’ADN pour extraire l’ADN des échantillons de biopsie duodénale, conformément au protocole14 du fabricant.
  4. Ajouter la quantité maximale d’échantillon conforme aux lignes directrices du protocole dans un tube de lyse contenant 750 μL de solution de lyse et un volume sec de 0,7 mL de billes de verre de 2 mm.
  5. Fixez les tubes de lyse dans un batteur à billes à l’aide d’un porte-tube et faites fonctionner le batteur à vitesse maximale pendant au moins cinq minutes. Le temps variera en fonction du batteur de billes et de l’échantillon analysé.
  6. Centrifuger les tubes de lyse dans une microcentrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 min.
  7. Transférez jusqu’à 400 μL de surnageant à travers un tube de collecte filtré et centrifugez à nouveau à 8000 x g pendant 1 min.
  8. Ajouter 1200 μL de tampon de liaison au filtrat dans un tube de microcentrifugation et bien mélanger jusqu’à ce que l’homogénéité soit homogène.
  9. Transférez 800 μL du mélange dans une colonne de centrifugation et un ensemble de tubes. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
  10. Placez la colonne de centrifugation sur un nouveau tube à centrifuger avec 400 μL de tampon de lavage d’ADN et mélangez soigneusement jusqu’à ce que l’homogénéité soit homogène. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu.
  11. Répétez l’étape 5.10 deux fois, avec 700 μL puis 200 μL de tampon de lavage d’ADN par lavage.
  12. Ajoutez 20 μL de tampon d’élution dans la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de centrifugation. Incuber pendant une minute, puis centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min pour éluer l’ADN. Ignorez la colonne.
  13. Filtrez à nouveau l’ADN. L’ADN est maintenant prêt pour l’amplification par PCR.

6. Amplification de l’ADN

  1. Effectuez une amplification par PCR de la région V4 du gène de l’ARN ribosomique 16S par séquençage 250 × 2 extrémités appariées sur le séquenceur aMiSeq, HiSeq ou NovaSeq15.
  2. Créez une plaque d’amorçage de plaque à 96 puits. Créez un mélange maître de 165 μL d’ILHS_515f amorce avant conservée (100 mM de stock) et de 2970 μL d’eau de biologie moléculaire. Ajouter 28,5 μL de ce mélange dans chaque puits.
  3. Ajouter 1,5 μL d’amorce inverse correspondante à partir de la plaque à 96 puits d’amorces uniques IL_806r à code-barres (stock de 100 μM). Ces codes-barres permettront d’identifier des échantillons uniques de patients.
  4. Créez un mélange maître d’eau (23,1 μL x 3,3 x nombre d’échantillons), de tampon PCR (3 μL x 3,3 x nombre d’échantillons), de dNTP (0,6 μL x 3,3 x nombre d’échantillons) et d’ADN polymérase JumpStart Taq (0,3 μL x 3,3 x nombre d’échantillons).
    REMARQUE : L’amplification de l’ADN 16S doit être effectuée en trois exemplaires.
  5. Ajouter 81 μL de mélange maître dans chaque puits de la première plaque à 96 puits. Ajouter 6 μL d’ADN et 3 mL de mélange d’amorce dans chaque puits. À l’aide d’une pipette multicanaux P200, mélanger les puits, puis pipeter 30 μL dans le puits correspondant de chacune des deux autres plaques de PCR. Scellez la plaque.
  6. Utilisez les réglages suivants du thermocycleur : 94 °C x 3 min ; 35 cycles : 94 °C x 45 s, 50 °C x 1 min, 72 °C x 1,5 min. Après 35 cycles : 72 °C x 10 min, 94 °C x 5 min, 4 °C indéfiniment.

7. Nettoyage et configuration de la bibliothèque

  1. Utilisez un kit de nettoyage PCR ou ADN pour purifier les produits PCR. Éluer l’ADN avec 30 μL d’eau de qualité PCR (traitée DEPC).
  2. Utilisez un spectrophotomètre à spectre UV-visible capable de quantifier les échantillons de PCR.
  3. Ouvrez le logiciel du spectrophotomètre sur le bureau de l’ordinateur. Cliquez sur Acide nucléique.
  4. Essuyez le porto avec de l’eau distillée. Ajoutez 1 μL de 1 tampon PCR/eau dans l’orifice et calibrez.
  5. Entrez l’ID de l’échantillon et pipetez 1 μL d’échantillon sur le port.
  6. Fermez le port et appuyez sur Mesurer.
    REMARQUE : Évitez les bulles d’air lors de l’ajout d’échantillons sur le port.
  7. Essuyez l’échantillon avec des lingettes de laboratoire et de l’eau distillée, puis préparez l’échantillon suivant. Enregistrez les valeurs avec chaque échantillon. L’ordinateur doit également enregistrer automatiquement.
  8. Combinez 250 ng de chaque produit PCR amplifié dans 1 tube. C’est la bibliothèque d’ADN.
  9. Livrez la bibliothèque, ainsi que les lectures 1 et 2 et les amorces de séquençage de l’index à un laboratoire de séquençage pour le séquençage.
    REMARQUE : Si un laboratoire local n’est pas disponible, un laboratoire de séquençage commercial peut être utilisé pour cette étape.

8. Formatage des données

  1. Les données de séquençage fournissent des résultats dans des fichiers .fastq avant et arrière. Convertissez ces données en une fiche technique et nettoyez-les afin que les informations puissent être analysées pour les applications en aval.
  2. Ouvrez le logiciel de programmation R. Suivez les instructions et le code indiqués dans le fichier de codage supplémentaire pour poursuivre dans le pipeline DADA2 et nettoyer les données de séquençage de l’ADN16. Téléchargez la base de données de référence SILVA pour l’attribution de la taxonomie après le passage des séquences dans le pipeline17.
  3. En bref, chargez le package DADA2 dans R. Définissez un chemin dans lequel tous les fichiers .fastq sont enregistrés dans le même répertoire et extrayez les fichiers dans R.
  4. Lit les noms des fichiers fastq et fait correspondre les listes de fichiers fastq avant et arrière.
  5. Inspectez la qualité des lectures avant et arrière.
    REMARQUE : Les séquences nucléotidiques peuvent être tronquées pour maintenir des séquences de haute qualité.
  6. Filtrez et découpez les fichiers fastq. Utilisez la méthode learnErrors pour apprendre le modèle d’erreur paramétrique utilisé par DADA2. Cela montrera les taux d’erreur observés et attendus pour chaque substitution nucléotidique possible (A → C, A → T, A → G, etc.).
  7. Appliquez l’algorithme d’inférence d’échantillon pour déterminer le nombre de séquences uniques dans chaque échantillon et inspectez davantage l’objet de classe dada pour obtenir le nombre de véritables variantes uniques par échantillon.
  8. Fusionnez les lectures avant et arrière pour obtenir des séquences complètes et débruitées.
  9. Construisez une table de variantes de séquence d’amplicon (ASV).
  10. Retirez les chimères de la table ASV. Les suites chimériques sont une séquence unique résultant de deux séquences parentales plus abondantes.
  11. Suivez le nombre total de lectures qui sont passées par le pipeline. DADA2 utilisera SILVA pour attribuer une taxonomie à chaque séquence unique. La précision peut être analysée en incluant une communauté de séquences bactériennes connues dans le pipeline DADA2 et en comparant les variantes de séquence DADA2 à la composition attendue de la communauté.
    REMARQUE : Les données de séquençage de l’ADN sont maintenant nettoyées et prêtes à être analysées en fonction de la portée et des objectifs spécifiques du projet de recherche.

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Résultats

Différences de population entre le microbiome muqueux et luminal de l’intestin proximal
Des études antérieures ont révélé des différences dans les populations microbiennes des échantillons de côlon luminal et muqueux 4,5,18. Les résultats préliminaires montrent que les échantillons d’aspiration duodénale et de biopsie peuvent mesurer à la fois le microbiote luminal et muqueux dans l’intestin proximal. De plus...

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Discussion

Les études du microbiome sont extrêmement importantes, car cet écosystème complexe joue un rôle essentiel dans l’homéostasie énergétique, les réponses immunologiques et le métabolisme. Il existe des différences régionales entre les microbiomes qui peuvent refléter les fonctions physiologiques distinctes de diverses régions du tractus gastro-intestinal, ce qui peut affecter différents états pathologiques20. Le microbiome fécal est le plus so...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier concurrent à signaler.

Remerciements

Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health/National Cancer Institute grant number RO1CA204145.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cryoflans de 2 mL PlaquesCorning430659
96 puitsApplied Biosystems4306737
dNTPsSigmaD7295
GlaceFourni par l’établissement
Endoscope EG29-i10PentaxN/ALa taille de l’endoscope peut varier en fonction de la physiologie du patient
Microplaque d’époque spectrophotomètreBiotekN/A
EthanolSigma Aldrich676829
HiSeq 2500IlluminaN/A
IL_806r amorce inverseIDT DNA technologies amorcespersonnaliséesamorces
directesIDT DNA technologiespersonnalisées
JumpStart Taq DNASigmaD4184
Piège à mucusBusse Hospital Disposables405Piège à échantillons 40 cc avec capuchon de transport
Logiciel Nanodrop Gen5ThermoFisher Scientific
Tampon PCRSigmaP2192
Kit de nettoyage PCRZymo ResearchD4204
Mâchoire radiale 4 Jumbo ForcepsBoston ScientificM00513343Diamètre extérieur de la mâchoire de 2,8 mm
Questionnaire diététique VioscreenVioCareN/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep KitZymo ResearchD430025 ug capacité de liaison
sèche ILHS_515f

Références

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