Isolement de l’ARN fécal (micro)

Summary

Ce protocole isole l’ARN total de haute qualité à partir d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. Un kit commercial d’isolation de miARN est utilisé avec une adaptation significative pour isoler l’ARN pur avec une quantité et une qualité optimisées. Les isolats d’ARN sont bons pour la plupart des tests d’ARN en aval tels que le séquençage, les micro-réseaux et la RT-PCR.

Abstract

Il devient clair que l’ARN existe dans la lumière intestinale et les matières fécales chez les animaux et les humains. Le protocole décrit ci-dessous isole l’ARN total, y compris les microARN, provenant d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. L’objectif est d’isoler l’ARN total avec une pureté et une quantité élevées pour des analyses en aval telles que le séquençage de l’ARN, la RT-PCR et les micro-réseaux. Les avantages de ce protocole optimisé dans l’isolement des miARN sont la capacité d’isoler des produits d’ARN hautement purifiés avec des étapes de lavage supplémentaires décrites, une quantité accrue d’ARN obtenue avec une méthode améliorée de remise en suspension de l’échantillon et des pointes importantes de décontamination. Une limitation est l’incapacité de traiter et de purifier un échantillon plus grand de plus de 200 mg, car ces tailles d’échantillon causeraient une difficulté dans la formation claire de l’interphase. Par conséquent, la grande taille de l’échantillon peut contaminer la phase aqueuse à extraire comme décrit dans le protocole avec des matières organiques qui affectent la qualité de l’ARN isolé à la fin. Cependant, les isolats d’ARN provenant d’un échantillon allant jusqu’à 200 mg sont suffisants pour la plupart des analyses en aval.

Introduction

L’ARN extracellulaire est de plus en plus reconnu comme un facteur important qui médie de nombreux processus biologiques¹. L’ARN extracellulaire dans les matières fécales a été signalé pour la première fois en 2008 en tant que marqueur du cancer du côlon et de la colite ulcéreuse active², et il a récemment été révélé comme un composant normal de la lumière intestinale et des matières fécales et médie les communications hôte-microbe ^3,4,5. Le but de ce protocole d’isolement d’ARN est d’extraire de l’ARN extracellulaire de haute q....

Protocol

Toutes les méthodes impliquant des animaux de recherche décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Brigham and Women’s Hospital de la Harvard Medical School.

Toutes les méthodes impliquant des sujets de recherche humains décrites ici sont conformes aux lignes directrices établies par le Comité de recherche humaine des partenaires.

1. Prélèvement d’échantillons fécaux

1. Autoclaver ou préparer un tube microcentrifuge stérile et sans nucléase de 2 mL avec un bouchon à vis pour chaque animal soumis à une expérience.
   1. Pour les sujets humains, fournir un d....

Results

Des ARN représentatifs ont été isolés à partir d’échantillons fécaux de souris de 50 mg (2 granulés fécaux de souris) et de 100 mg d’échantillons de selles humaines respectivement et élués dans de l’eau exempte de nucléases de 50 μL. L’analyse spectrophotométrique de la concentration suggère qu’une quantité totale de 49 μg et 16 μg d’ARN ont été isolées respectivement (tableau 1). La pureté de l’ARN était élevée, comme l’indiquent un rapport A260/A280 de ~2,0 et un rapport A260/A230 de ~1,8 (tabl.......

Discussion

Il est important d’utiliser une technique sans RNase pour prévenir la contamination par la RNase pendant l’isolement⁷. Après la centrifugation et la formation d’une interphase compacte, il est essentiel d’éviter l’interphase, la phase inférieure et le contaminant particulaire flottant au-dessus de la phase aqueuse lors de la récupération de la phase aqueuse. De plus, deux étapes de lavage avec 500 μL et 250 μL Wash Solution 2/3 sont ajoutées pour éliminer les contaminants dans la membrane filtrant.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide-phénol : Chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Thermo Fischer Scientific	14190-144
Gants
Microcentrifugeuse
mirVana Kit d’isolation des miARN	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Tubes de microcentrifugation sans nucléases (1,5 mL, 2 mL)
Eau sans nucléases (non traitée DEPC)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipette et pointes de pipette sans nucléases (avec filtre)
Homogénéisateur PowerLyzer 24	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase Solution de décontamination	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Agitateur