Isolement de l’ARN fécal (micro)

Summary

Ce protocole isole l’ARN total de haute qualité à partir d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. Un kit commercial d’isolation de miARN est utilisé avec une adaptation significative pour isoler l’ARN pur avec une quantité et une qualité optimisées. Les isolats d’ARN sont bons pour la plupart des tests d’ARN en aval tels que le séquençage, les micro-réseaux et la RT-PCR.

Abstract

Il devient clair que l’ARN existe dans la lumière intestinale et les matières fécales chez les animaux et les humains. Le protocole décrit ci-dessous isole l’ARN total, y compris les microARN, provenant d’échantillons fécaux de sujets animaux et humains. L’objectif est d’isoler l’ARN total avec une pureté et une quantité élevées pour des analyses en aval telles que le séquençage de l’ARN, la RT-PCR et les micro-réseaux. Les avantages de ce protocole optimisé dans l’isolement des miARN sont la capacité d’isoler des produits d’ARN hautement purifiés avec des étapes de lavage supplémentaires décrites, une quantité accrue d’ARN obtenue avec une méthode améliorée de remise en suspension de l’échantillon et des pointes importantes de décontamination. Une limitation est l’incapacité de traiter et de purifier un échantillon plus grand de plus de 200 mg, car ces tailles d’échantillon causeraient une difficulté dans la formation claire de l’interphase. Par conséquent, la grande taille de l’échantillon peut contaminer la phase aqueuse à extraire comme décrit dans le protocole avec des matières organiques qui affectent la qualité de l’ARN isolé à la fin. Cependant, les isolats d’ARN provenant d’un échantillon allant jusqu’à 200 mg sont suffisants pour la plupart des analyses en aval.

Introduction

L’ARN extracellulaire est de plus en plus reconnu comme un facteur important qui médie de nombreux processus biologiques¹. L’ARN extracellulaire dans les matières fécales a été signalé pour la première fois en 2008 en tant que marqueur du cancer du côlon et de la colite ulcéreuse active², et il a récemment été révélé comme un composant normal de la lumière intestinale et des matières fécales et médie les communications hôte-microbe ^3,4,5. Le but de ce protocole d’isolement d’ARN est d’extraire de l’ARN extracellulaire de haute qualité à partir d’échantillons fécaux prélevés sur des sujets animaux et humains. Le protocole a été adapté à partir d’un kit commercial d’isolation de miARN. L’ARN acquis est utilisé pour des analyses en aval telles que le séquençage de l’ARN, la RT-PCR et la micro-matrice. Le protocole comprend plusieurs conseils importants et utiles pour maximiser la quantité et la qualité de l’ARN présent dans les excréments des animaux et des humains. La raison de développer et d’optimiser cette méthode d’isolement de l’ARN (y compris les microARN) est de diminuer l’ARN microbien dans les fèces, de limiter les variables dans les études de recherche et d’analyser la composition de l’ARN dans l’intestin sans tenir compte des divers facteurs de confusion et sources de contamination. Il convient de noter que cet isolement d’ARN minimise la libération d’ARN par les cellules vivantes et les microbes vivants (ARN cellulaire). Il se concentre sur les ARN extracellulaires qui ont été libérés par les cellules intestinales ou ont été acquis par la prise alimentaire. Principalement, cette méthode ne convient pas aux études où le transcriptome microbien est étudié.

Protocol

Toutes les méthodes impliquant des animaux de recherche décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Brigham and Women’s Hospital de la Harvard Medical School.

Toutes les méthodes impliquant des sujets de recherche humains décrites ici sont conformes aux lignes directrices établies par le Comité de recherche humaine des partenaires.

1. Prélèvement d’échantillons fécaux

1. Autoclaver ou préparer un tube microcentrifuge stérile et sans nucléase de 2 mL avec un bouchon à vis pour chaque animal soumis à une expérience.
   1. Pour les sujets humains, fournir un dispositif de prélèvement d’échantillons de selles approprié, exempt de nucléases et stérile pour chaque sujet.
2. Prélever 25 à 100 mg (environ 1 à 4 granulés fécaux pour les échantillons fécaux de souris) d’échantillons fécaux de chaque animal sujet dans un environnement stérile.
   REMARQUE: Deux granulés fécaux ou plus (~ 50 mg ou plus) sont préférés pour obtenir de l’ARN de la plus haute pureté.
   1. Utilisez tout l’équipement de protection individuelle (EPI) et le matériel nécessaires, par exemple : une paire de gants de laboratoire, un spray désinfectant et une serviette en papier stérile, pour stériliser la zone de travail, où le sujet de recherche animale est placé, afin d’éviter la contamination des échantillons fécaux.
      1. Pour les sujets humains, demander à chaque sujet de recherche/collecteur de prélever de 100 à 200 mg d’échantillons de selles dans un environnement aussi stérile que possible. Utilisez un fonctionnement stérile standard et évitez la contamination des échantillons de selles.
3. Prélever des échantillons fécaux de chaque animal directement dans un tube microcentrifuge de 2 ml muni d’un bouchon à vis sans toucher d’autres surfaces pour éviter toute contamination.
   1. Pour les sujets humains, demandez à chaque sujet de déféquer directement dans un dispositif de prélèvement applicable fourni (p. ex. une trousse de prélèvement d’échantillons de selles stériles) pour éviter la contamination.
      REMARQUE: Donner des instructions sous réserve d’éviter la contamination par les surfaces des toilettes, l’eau, l’urine ou toute autre surface / objet non stérile.
4. Congeler immédiatement à -80 °C les échantillons fécaux prélevés dans des tubes à microcentrifugation de 2 ml ou les placer dans un seau de glace sèche pour obtenir une meilleure quantité et une meilleure qualité d’ARN avant la remise en suspension des matières fécales comme décrit dans les étapes ci-dessous.
   1. Pour les échantillons de selles humaines, aliquote chaque échantillon frais de 200 mg dans des tubes microcentrifugés de 2 mL munis de bouchons à vis et les congeler à -80 °C avant la remise en suspension des matières fécales comme décrit ci-dessous.
      1. Pour l’entreposage d’échantillons de selles qui ne sont pas dans des tubes microcentrifugés de 2 mL munis de bouchons à vis, peser et transférer de 100 à 200 mg chacun des échantillons congelés dans des tubes microcentrifugeuses séparés de 2 mL munis de bouchons à vis avant la remise en suspension des matières fécales, comme décrit ci-dessous.
         NOTE: Pour les échantillons de selles humaines, évitez de prendre plus de 200 mg d’échantillons de selles pour l’isolement de l’ARN car cela peut causer des difficultés dans les étapes suivantes. Avec un échantillon surchargé dans un tube microcentrifuge de 2 mL, la phase aqueuse, la phase organique et l’interphase peuvent ne pas être clairement formées et séparées. La procédure peut être interrompue ici.

2. Préparations de solutions de lavage

1. Ajouter 21 ml d’éthanol 100 % de qualité American Chemical Society (ACS) à la solution de lavage 1 fournie dans la trousse d’isolation des miARN (voir le tableau des matériaux) pour atteindre le volume final de 30 mL, comme indiqué sur le flacon. Vortex jusqu’à ce que tout se dissolve dans la bouteille.
2. Ajouter 40 mL d’éthanol 100 % de qualité ACS à la solution de lavage 2/3 fournie pour atteindre le volume final de 50 mL, comme indiqué sur la bouteille. Vortex pendant 5 s ou jusqu’à ce que le mélange final soit bien mélangé.

3. Préparation de l’équipement et du matériel

1. Pulvériser la zone de travail et l’équipement, par exemple : la paillasse de laboratoire, la zone de travail dans la hotte chimique et les supports de tubes microcentrifugés, avec une solution de décontamination Ribonuclease (RNase) (p. ex. solution de décontamination RNase disponible dans le commerce). Pour éviter toute contamination, appliquer avec la solution de décontamination RNase sur les surfaces où et quand cela est jugé nécessaire.
2. Enfilez une blouse de laboratoire propre, mettez un masque facial et portez des gants de laboratoire appropriés pour protéger l’ARN dans les échantillons fécaux des nucléases présentes sur la peau humaine. Vaporisez des gants avec une solution de décontamination RNase et changez fréquemment de gants pour éviter la contamination.
3. Préparez un seau de glace sèche pour les échantillons fécaux stockés à -80 °C pour éviter la décongélation avant la remise en suspension des matières fécales et un seau de glace pour les matériaux, par exemple: Acide-phénol: Chloroforme, pour prolonger la durée de conservation.
   REMARQUE : S’assurer que les matériaux, y compris les milieux utilisés dans le protocole, sont stériles sans contamination des nucléases.

4. Remise en suspension des matières fécales

1. Remettez en suspension 25 à 100 mg d’échantillons fécaux dans 600 μL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) stérile 1x Dulbecco.
   ATTENTION : Les échantillons fécaux doivent être traités immédiatement lorsqu’ils sont décongelés à partir de -80 °C sans même décongélation partielle afin de minimiser la libération de RNases et d’ARN cellulaire, car les cristaux de glace rompent les compartiments cellulaires intérieurs et extérieurs lorsque les cellules de l’échantillon dégèlent.
   1. Ajouter 600 μL de 1x DPBS au tube microcentrifuge de 2 mL avec un bouchon à vis contenant des échantillons de matières fécales à température ambiante (RT).
   2. Incuber le mélange d’échantillons fécaux immergés dans 600 μL de 1x DPBS dans le tube microcentrifugeuse de 2 mL coiffé pendant 30 min à TA.
   3. Remettez le mélange en suspension en écrasant avec 1 mL d’embout de pipette et en remutant bien vortex avec le tube microcentrifugeuse de 2 mL bouché. Pour optimiser et augmenter la quantité et la qualité de l’ARN, remettre le mélange en suspension avec un homogénéisateur avec le réglage pour un cycle à S4000 (ou 4000 rpm) et 45 s.

5. Extraction biologique

ATTENTION : Utilisez la hotte chimique dangereuse pour les étapes suivantes jusqu’à l’étape 6 avec l’utilisation d’acide-phénol : chloroforme et ACS grade 100% éthanol en raison de leur toxicité et de leur inflammabilité. Changez l’EPI au besoin et suivez les précautions standard appropriées lorsque vous manipulez des matières dangereuses.

1. Extraire l’ARN avec 600 μL d’acide-phénol: chloroforme (le volume d’acide-phénol: chloroforme requis est égal au volume initial de 1x DPBS ajouté à l’étape 4.1).
   1. Ajouter 600 μL de chloroforme acide-phénol à la suspension de l’étape 4.1.
      NOTE: Retirer l’acide-phénol: chloroforme de la phase inférieure dans la bouteille lorsque la phase supérieure est mélangée avec un tampon aqueux. Si l’interphase entre ces deux phases est perturbée, alors attendre et retirer l’acide-phénol: chloroforme uniquement lorsque l’interphase se rétablit pour éviter la contamination.
2. Vortex le mélange pendant 60 s pour bien mélanger. Alternativement, pour optimiser et augmenter la quantité d’ARN dans le rendement, mélanger en utilisant un homogénéisateur avec le réglage pour un cycle à S4000 et 45 s.
3. Centrifuger pendant 15 min à 10 000 x g à TA pour séparer les phases aqueuse et organique avec une microcentrifugeuse. Après centrifugation, l’interphase doit être compacte. Si ce n’est pas le cas, répétez la centrifugation.
   NOTE: Si l’interphase n’a pas pu être aussi compacte que souhaité en raison d’un rapport inégal du volume initial au volume d’acide-phénol: chloroforme ajouté après plusieurs répétitions de centrifugation, procéder à la récupération de la phase aqueuse avec un plus grand soin pour éviter la contamination.
4. Récupérer la phase aqueuse et la transférer dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 mL muni d’un capuchon de charnière (non fourni par le kit d’isolation miARN).
   1. Retirez soigneusement la phase aqueuse (ou supérieure) sans perturber la phase inférieure et transférez-la dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 mL muni d’un capuchon de charnière. Notez le volume transféré (p. ex., ~500 μL).
      REMARQUE: Lorsque l’interphase est compacte et que la phase supérieure est clairement séparée, il y a peut-être quelques minuscules particules résiduelles flottant au-dessus de la phase aqueuse. Pipeter soigneusement pour éviter ces résidus et ne récupérer que la phase aqueuse visiblement et clairement séparée pour assurer un rendement en ARN de qualité, même si vous ne pouvez obtenir qu’un faible volume de la phase aqueuse.

6. Isolement final de l’ARN

1. Ajouter 1,25 volume d’éthanol 100 % de qualité RT ACS à la phase aqueuse dans le tube microcentrifuge de 2 mL (p. ex., ajouter 625 μL d’éthanol à 100 % si 500 μL de phase aqueuse sont récupérés à l’étape 5.4). Vortex 3 s.
2. Chargez le mélange phase aqueuse/éthanol à travers la cartouche filtrante fournie dans le kit d’isolation miARN.
   1. Pour chaque échantillon, placez la cartouche filtrante dans l’un des tubes de prélèvement fournis par le kit.
      1. Pipeter et charger 600 μL du mélange phase aqueuse/éthanol dans la cartouche filtrante.
         NOTE: Vortex le mélange brièvement pour bien mélanger l’éthanol avec la phase aqueuse avant le pipetage. Pas plus de 700 μL du mélange phase aqueuse/éthanol peuvent être chargés à la fois.
   2. Centrifuger à 10 000 x g pendant 90 s pour filtrer à travers le mélange. La rotation à une vitesse plus élevée peut endommager le filtre.
   3. Jeter le filtrat et répéter les étapes 6.2.1 à 6.2.2 jusqu’à ce que tout le mélange soit filtré à travers la même membrane filtrante dans des applications successives. Conservez et réutilisez le même tube de collecte pour les étapes de lavage ci-dessous.
   4. Lavez le filtre avec 700 μL de solution de lavage miARN 1.
      ATTENTION : miRNA Wash Solution 1 contient du thiocyanate de guanidine qui peut provoquer une irritation de la peau et de graves lésions oculaires. Portez l’EPI nécessaire, par exemple : gants, écran facial, blouse de laboratoire de protection. Changez de gants fréquemment au besoin.
      1. Appliquez 700 μL de miRNA Wash Solution 1, la solution de travail préparée avec l’éthanol 100% ACS, dans la cartouche filtrante.
      2. Centrifuger pendant 60 s pour filtrer la solution de lavage miARN 1 à travers la cartouche filtrante.
      3. Jetez le filtrat du tube de collecte et placez la même cartouche filtrante dans le même tube de collecte.
   5. Lavez le filtre avec la solution de lavage 2/3 une fois chacun avec des volumes de 700 μL, 500 μL et 250 μL consécutivement.
      1. Appliquez 700 μL de Wash Solution 2/3, la solution de travail préparée avec l’éthanol 100% ACS, dans la cartouche filtrante.
         1. Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min.
         2. Jetez le filtrat du tube de collecte et placez la même cartouche filtrante dans le même tube de collecte.
      2. Appliquer 500 μL de Wash Solution 2/3 dans la cartouche filtrante.
         1. Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min.
         2. Jetez le filtrat du tube de collecte et placez la même cartouche filtrante dans le même tube de collecte.
      3. Appliquer 250 μL de solution de lavage 2/3 dans la cartouche filtrante.
         1. Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min.
         2. Jetez le filtrat du tube de collecte.
      4. Transférez la cartouche filtrante dans un nouveau tube de collecte et faites tourner l’ensemble pendant 5 minutes pour éliminer le liquide résiduel du filtre.

7. ARN éluté avec 50 μL d’eau sans nucléase

1. Transférez la cartouche filtrante dans un nouveau tube de collecte. Pipeter 50 μL d’eau sans nucléase au centre du filtre et boucher le tube de collecte.
   1. Incuber à TA pendant 10 min.
   2. Faire tourner pendant 5 min à 8 000 x g pour récupérer l’ARN dans le nouveau tube de collecte.
   3. Déterminer la concentration et la pureté de l’ARN fécal récupéré à l’aide d’un fluoromètre. L’ARN fécal récupéré peut être conservé à -80 °C.

Results

Des ARN représentatifs ont été isolés à partir d’échantillons fécaux de souris de 50 mg (2 granulés fécaux de souris) et de 100 mg d’échantillons de selles humaines respectivement et élués dans de l’eau exempte de nucléases de 50 μL. L’analyse spectrophotométrique de la concentration suggère qu’une quantité totale de 49 μg et 16 μg d’ARN ont été isolées respectivement (tableau 1). La pureté de l’ARN était élevée, comme l’indiquent un rapport A260/A280 de ~2,0 et un rapport A260/A230 de ~1,8 (tabl...

Discussion

Il est important d’utiliser une technique sans RNase pour prévenir la contamination par la RNase pendant l’isolement⁷. Après la centrifugation et la formation d’une interphase compacte, il est essentiel d’éviter l’interphase, la phase inférieure et le contaminant particulaire flottant au-dessus de la phase aqueuse lors de la récupération de la phase aqueuse. De plus, deux étapes de lavage avec 500 μL et 250 μL Wash Solution 2/3 sont ajoutées pour éliminer les contaminants dans la membrane filtrant...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide-phénol : Chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Thermo Fischer Scientific	14190-144
Gants
Microcentrifugeuse
mirVana Kit d’isolation des miARN	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Tubes de microcentrifugation sans nucléases (1,5 mL, 2 mL)
Eau sans nucléases (non traitée DEPC)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipette et pointes de pipette sans nucléases (avec filtre)
Homogénéisateur PowerLyzer 24	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase Solution de décontamination	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Agitateur