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Article de méthode

Mesure de la force tétatanique isométrique maximale du muscle antérieur de Tibialis chez le rat

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DOI :

10.3791/61926

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26 juin 2021

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1Department of Orthopedic Surgery, Mayo Clinic, 2Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Health Sciences, Department of Plastic Surgery, Nijmegen, The Netherlands

Dans cet article

Résumé

L’évaluation du rétablissement de moteur demeure la mesure de résultats de référence dans des études périphériques expérimentales de nerf. La mesure isométrique de force tétanique du muscle antérieur de tibialis chez le rat est un outil inestimable pour évaluer des résultats fonctionnels après reconstruction des défauts de nerf sciatique. Les méthodes et les nuances sont détaillées dans cet article.

Résumé

Les dommages traumatiques de nerf ont comme conséquence la perte fonctionnelle substantielle et les défauts segmentaires de nerf nécessitent souvent l’utilisation des greffes autologous de nerf d’interposition. En raison de leur disponibilité limitée et de la morbidité associée du côté donneur, de nombreuses études dans le domaine de la régénération nerveuse se concentrent sur des techniques alternatives pour combler un écart nerveux segmentaire. Afin d’étudier les résultats des options de traitement expérimental chirurgical ou pharmacologique, le modèle du nerf sciatique du rat est souvent utilisé comme essai biologique. Il existe une variété de mesures de résultats utilisées dans les modèles de rats pour déterminer l’étendue de la régénération nerveuse. La force de sortie maximale du muscle cible reste le résultat le plus pertinent pour la traduction clinique des thérapies expérimentales. La mesure isométrique de force de la contraction tétanique de muscle a été précédemment décrite comme technique reproductible et valide pour évaluer le rétablissement de moteur après des dommages ou la réparation de nerf dans des modèles de rat et de lapin. Dans cette vidéo, nous fournirons une instruction étape par étape de cette procédure inestimable pour l’évaluation de la récupération fonctionnelle du muscle antérieur de tibialis dans un modèle de défaut de nerf sciatique de rat utilisant des paramètres optimisés. Nous décrirons les préparations pré-chirurgicales nécessaires en plus de l’approche chirurgicale et de la dissection du nerf péronéal commun et du tendon antérieur de muscle de tibialis. La technique isométrique de mesure de la force tétanique sera détaillée. La détermination de la longueur musculaire optimale et de la fréquence d’impulsion de stimulus est expliquée et la mesure de la contraction maximale du muscle tétanoïque est démontrée.

Introduction

La perte de la fonction motrice à la suite d’une lésion nerveuse périphérique traumatique a un impact significatif sur la qualité de vie et le statut socio-économique des patients1,2,3. Le pronostic de cette population patiente demeure pauvre en raison des améliorations minimales des techniques chirurgicales au cours des années4. La réparation épinérale directe de bout en bout sans tension forme la reconstruction chirurgicale de référence. Cependant, dans les cas où les lacunes nerveuses sont prolongées, l’interposition d’une greffe de nerf autologue s’est avérée supérieure5,6. La morbidité associée d’emplacement de distributeur et la disponibilité limitée des greffes de nerf autologue ont imposé le besoin de techniques alternatives7,8.

Des modèles animaux expérimentaux ont été utilisés pour élucider le mécanisme de régénération des nerfs périphériques et pour évaluer les résultats d’une variété d’options de traitement reconstructif et pharmacologique8,9. Le modèle du nerf sciatique du rat est le modèle animal le plus fréquemment utilisé10. Leur petite taille les rend faciles à manipuler et à loger. En raison de leur potentiel neurorégénératif superlatif, la diminution du temps entre l’intervention et l’évaluation des résultats peut entraîner des coûts relativement inférieurs11,12. D’autres avantages de son utilisation comprennent des similitudes morphologiques avec les fibres nerveuses humaines et le nombre élevé d’études comparatives / historiques13. Bien que ce dernier point doive être abordé avec prudence, car une grande variété de mesures de résultats différentes entre les études rend difficile la comparaison des résultats14,15,16,17,18.

Les mesures de résultats pour évaluer la régénération nerveuse vont de l’électrophysiologie à l’histomorphométrie, mais ces méthodes impliquent une corrélation mais ne mesurent pas nécessairement directement le retour de la fonction motrice14,15. La régénération des fibres nerveuses peut ne pas faire les connexions appropriées qui peuvent provoquer une surestimation du nombre de connexions fonctionnelles14,15,19,20. La mesure la meilleure et cliniquement la plus pertinente pour démontrer la réinnervation correcte des organes finaux reste l’évaluation de la fonction musculaire21,22,23. La création d’outils d’évaluation de la fonction motrice pour les modèles animaux est toutefois un défi. Medinaceli et al. ont d’abord décrit l’analyse de la piste de marche, qui a depuis été la méthode la plus fréquemment utilisée pour évaluer la récupération fonctionnelle dans les études expérimentales sur les nerfs périphériques21,24, 25,26,27,28. L’analyse de la piste de marche quantifie l’indice fonctionnel sciatique (IFS) sur la base de mesures des empreintes de pattes de rats marchants21,29. Les limitations majeures de l’analyse de la piste de marche, telles que les contractures des orteils, l’automutilation, le maculage de l’impression et la faible corrélation avec d’autres mesures de réinnervation, ont nécessité l’utilisation d’autres paramètres pour la quantification de la récupération fonctionnelle30,31.

Dans des études précédentes chez des rats Lewis32 et des lapins néo-zélandais33,nous avons validé la mesure isométrique de la force tétanique (ITF) pour le muscle tibialis antérieur (TA) et démontré son efficacité dans l’évaluation de la récupération musculaire après différents types de réparation nerveuse34,35,36,37,38,39. Le muscle TA est bien adapté en raison de sa taille relativement grande, de son innervation par la branche péronéale du nerf sciatique et de ses propriétés biochimiques bien élucidées40,41,42,43. Lorsque la longueur musculaire (force de précharge) et les paramètres électriques sont optimisés, l’ITF offre une variabilité côte à côte de 4,4% et 7,5% chez les rats32 et les lapins33,respectivement.

Cet article fournit un protocole détaillé de la mesure d’ITF dans le modèle de nerf sciatique de rat, y compris une description complète de la planification pré-chirurgicale nécessaire, de l’approche chirurgicale et de la dissection du nerf péronéal commun et du tendon distal de muscle de TA. En utilisant des valeurs prédéterminées pour l’intensité et la durée du stimulus, la longueur musculaire optimale et la fréquence de l’impulsion du stimulus seront définies. Grâce à ces quatre paramètres, l’ITF peut par la suite être mesuré de manière cohérente et précise.

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Protocole

Toutes les interventions sur les animaux ont été effectuées avec l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC A334818).

1. Étalonnage du transducteur de force

  1. Assurez-vous que l’ordinateur est correctement connecté au périphérique d’acquisition de données d’E/S (DAQ) multifonctionnel USB-6009, qui doit à son tour être connecté au transducteur de force.
    NOTA : D’autres souches et espèces de rats peuvent nécessiter un transducteur de force de cellule de charge différent, car des forces plus élevées sont à prévoir 44.
  2. Fixez une pince personnalisée fabriquée à partir d’un hémostatique chirurgical modifié au transducteur de force monté sur un bras de levier réglable à base de vide.
    REMARQUE: La pince sur mesure se compose d’un hémostat chirurgical modifié avec une vis de serrage qui permet le réglage de la tension (Figure 1).
  3. Placez sur la table la plate-forme d’essai en verre acrylique sur mesure, qui contient deux blocs de bois pour la fixation du membre postérieur du rat.
    REMARQUE: D’autres matériaux tels que l’uréthane peuvent également être utilisés à la place du bois tant que les fils K sont capables de pénétrer et de se fixer.
  4. Fixez verticalement la pince, le transducteur de force et la combinaison de bras de levier réglable à la plate-forme d’essai à l’aide de sa base sous vide.
  5. Fixez un crochet ou une boucle à la pince pour les poids d’étalonnage.
  6. Ouvrez l’ordinateur et le logiciel (par exemple, LabVIEW).
  7. Une fois le logiciel ouvert, démarrez l’instrument virtuel (VI) sur mesure sur mesure de l’ITF (Figure 2).
    REMARQUE : la figure 2 contient le code LabVIEW dans un extrait de vi. Cet extrait de VI peut être glissé sur le schéma fonctionnel dans LabVIEW. Il sera automatiquement transformé en code graphique. Pour cette expérience, le taux d’échantillonnage a été fixé à 2000 Hz avec 25 échantillons à lire pour chaque itération.
  8. Exécutez le VI en appuyant sur la flèche blanche dans le coin supérieur gauche et sélectionnez Nouveau étalonnage. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.
  9. Démarrez le processus d’étalonnage avec un poids nul (uniquement la pince avec un crochet ou une boucle attaché) et appuyez sur OK.
  10. Consécutivement, ajoutez 10, 20, 30 et 50 grammes de poids et appuyez sur OK entre chaque mesure de poids.
  11. Une fois les cinq mesures collectées, cliquez sur Processus.
  12. N’acceptez les valeurs que si le graphique du VI affiche une courbe linéaire positive(Figure 3).
  13. Repositionnez la combinaison de bras de serrage, de transducteur de force et de bras de levier réglable horizontalement sur la plate-forme d’essai. Ce sera la position utilisée pour mesurer l’ITF.
  14. Cliquez sur Zéro et la fenêtre se fermera automatiquement.

2. Sujets animaux

  1. Utilisez des rats Lewis mâles pesant entre 300 et 500 g.
    REMARQUE: Pour la comparaison de la régénération nerveuse, il est impératif d’utiliser la même souche de rat dans les groupes témoins et expérimentaux, car le poids et l’incidence de l’autotomie dépendent de la souche et peuvent influencer considérablement les résultats de l’ITF10,32,45,46,47.

3. Préparation chirurgicale

  1. Préparer tous les instruments chirurgicaux requis avant la chirurgie(table des matériaux).
  2. Peser les animaux pour déterminer la quantité requise d’anesthésie.
  3. Induire une anesthésie en plaçant le rat dans une chambre gazée avec 3% d’isoflurane dans l’oxygène.
  4. Anesthésier profondément le rat à l’aide d’un cocktail de kétamine en dix parties (100 mg/mL) et de xylazine en une partie (100 mg/mL) à une dose de 1 mL/kg de poids corporel par injection intrapéritonéale. Surveiller la profondeur de l’anesthésie en fonction de la réponse à un pincement de l’enfant et en observant la fréquence respiratoire.
  5. Environ 30 minutes après la dose initiale du cocktail kétamine/xylazine, administrer une dose supplémentaire de 0,3 à 0,6 mL/kg de poids corporel de kétamine (100 mg/mL) par voie intrapéritonéale pour maintenir une anesthésie adéquate tout au long de la procédure, qui est définie comme une faible fréquence respiratoire et une réponse absente à un pincement des orteils.
    ATTENTION : Il est important d’administrer méticuleusement l’anesthésie requise car un surdosage ne peut pas être contrecarré.
  6. Rasez soigneusement les membres postérieurs du rat à l’aide de tondeuses électriques.
  7. Placez le rat en position couchée sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 °C. En option, la température corporelle peut être surveillée à l’aide d’un thermomètre rectal.
  8. Injecter 5 mL de chlorure de sodium (NaCl) à 0,9 % par voie sous-cutanée dans la peau lâche au-dessus du cou du rat pour préserver un état d’hydratation adéquat tout au long de l’intervention.
  9. En raison de la nature non-survie de cette procédure, le champ chirurgical et les instruments n’ont pas besoin d’être stériles. Le chirurgien doit utiliser un équipement de protection individuelle (EPI) et les loupes chirurgicales sont conseillées pour une visualisation appropriée des structures anatomiques.

4. Approche chirurgicale du nerf péronéal commun

  1. Placez le rat en position couchée latérale droite ou gauche selon le côté qui sera mesuré en premier.
  2. Créez une incision de 2 à 3 cm dans la peau de la cuisse postérolatérale parallèlement au fémur en commençant au plus grand trochanter à l’aide d’une lame chirurgicale n° 15.
  3. Identifiez le plan entre le muscle femoris du biceps et le maximus de gluteus et les muscles vastus de lateralis et exécutez une dissection émoussée utilisant des ciseaux de tenotomy pour séparer ces muscles et exposer le nerf sciatique fondamental.
  4. Localisez la trifurcation du nerf sciatique et placez un rétracteur pour obtenir un meilleur accès. Les trois branches du nerf sciatique comprennent le nerf péronéal commun, le nerf tibialis et le nerf sural.
  5. Isoler la branche commune de nerf péronéal (habituellement la branche la plus ventrale) du nerf sciatique utilisant une pince microchirurgicale courbée.
    REMARQUE: En cas d’incertitude, stimulez doucement le nerf isolé avec un stimulateur nerveux chirurgical et observez la réponse motrice. La stimulation du nerf péronéal commun entraîne une dorsiflexion de la patte.

5. Dissection du tendon distal du muscle antérieur tibialis

  1. Afin d’exposer le muscle TA et son insertion, inciser la peau à l’aspect antérolatéral de la jambe inférieure, en commençant par l’articulation du genou et en descendant jusqu’au côté médiodorsal de la patte postérieure.
  2. Disséquer le tendon distal de muscle ta du tissu environnant utilisant un scalpel avec une lame chirurgicale n ° 15.
  3. À l’aide d’une pince à moustique, disséquer carrément le tendon musculaire TA vers l’insertion et couper le tendon aussi distal que possible. Laissez le muscle proximal de TA tranquille, préservant le pedicle neurovascular.
    REMARQUE: Régulièrement (environ toutes les 5 minutes), humidifier le muscle TA avec du NaCl chauffé à 0,9% (37 °C) pour éviter le refroidissement et la dessiccation.

6. Mesure isométrique de la force tétatanique

  1. Connectez les câbles d’électrode bipolaire et le câble de masse selon leur couleur à un stimulateur bipolaire.
  2. Fixez l’autre extrémité des câbles d’électrode bipolaire à une électrode subminiature.
    REMARQUE: L’électrode de référence (rouge, anode) doit être placée distale et l’électrode active (noire, cathode) proximale.
  3. Transférer l’animal avec le coussin chauffant sur la plate-forme d’essai.
  4. Fixer le membre postérieur du rat au bloc de bois à l’aide de deux fils de Kirschner de 1 mm à travers la cheville et le condyle latéral du fémur distal en évitant l’aspect postérieur du genou.
    ATTENTION : Évitez les dommages vasculaires à l’artère poplitée et à la veine qui sont situés dorsalement au condyle de fémur.
  5. Fixez un support avec une pince personnalisée à la plate-forme de test à l’aide de sa base sous vide.
  6. Fixez le tendon distal du muscle TA à la pince fixée au transducteur de force.
    REMARQUE: La pince et le transducteur de force doivent être placés parallèlement au cours du muscle TA.
  7. Placez le rétracteur au niveau de la cuisse postérolatérale du rat afin d’accéder au nerf péronéal commun.
    REMARQUE: Le nerf sciatique et ses branches doivent être maintenus humides avec du NaCl chauffé à 0,9% (37 °C) pour éviter le refroidissement et la dessiccation.
  8. Insérez le câble de terre dans les muscles environnants (p. ex. le muscle vastus lateralis).
    REMARQUE: Le stimulateur Grass SD9 nécessite un câble de terre pour réduire les artefacts électriques. Les nouveaux stimulateurs peuvent ne pas nécessiter de câble de masse supplémentaire.
  9. Accrochez le nerf péronéal commun à l’électrode de sous-taille et fixez sa position à l’aide du support sur la plate-forme(Figure 4).
    REMARQUE: Assurez-vous que seul le nerf péronéal commun est accroché à l’électrode subminiature.
  10. Optimisation de la longueur musculaire
    1. Allumez le stimulateur bipolaire et ajustez les réglages comme suit: impulsion monophasique carrée, retard de 2 ms, durée de l’impulsion de stimulus 0,4 ms, intensité du stimulus 2 V.
      Remarque : le délai détermine le temps entre l’impulsion de synchronisation et la livraison du bord d’attaque de l’impulsion.
    2. Sélectionnez Test de paramètre et activez la collection de déclencheurs dans le VI.
    3. Augmentez la longueur du muscle (précharge) en ajustant le bras de levier fixé au transducteur de force.
    4. Commencez à 10 g de précharge et utilisez des incréments de 10 g jusqu’à ce que la force musculaire active maximale soit déterminée.
    5. Pour chaque préchargement, appliquez deux secousses simples directement l’une après l’autre à l’aide du bouton du stimulateur bipolaire. La sortie sera visible à l’écran et le rat devrait montrer une dorsiflexion de la patte.
      REMARQUE: Avant de stimuler le nerf, retirez toujours tout excès de NaCl à 0,9% entourant le nerf à l’aide d’applicateurs à bout de coton pour vous assurer que le signal n’est pas conduit aux tissus environnants.
    6. Pour arrêter la mesure, appuyez à nouveau sur Collection Trigger dans le VI.
    7. Si le programme détecte automatiquement les deux forces de sortie de crête, cliquez sur Accepter. Dans le cas où le programme ne sélectionne pas automatiquement ces forces de sortie, appuyez sur Refuser et sélectionnez les pics manuellement. La moyenne des deux forces de sortie de crête sera moyenne avec une force de sortie de crête moyenne (Figure 5).
    8. Calculer la force musculaire active en soustrayant la précharge de la force de sortie maximale moyenne.
    9. Notez la force active pour chaque précharge afin de visualiser la tendance et de reconnaître la force active maximale(Figure 6). Une feuille de calcul peut également être utilisée.
  11. Mesure de la force tétatanique isométrique
    1. Après avoir déterminé la longueur musculaire idéale, laissez le muscle reposer à zéro précharge pendant 5 minutes avant de commencer les contractions musculaires tétataniques.
    2. Pendant ce temps, passez du test de paramètre au test de fréquence sur le VI et ajustez l’intensité du stimulus à 10 V sur le stimulateur bipolaire.
    3. Gardez le retard et la durée de l’impulsion de stimulus à 2 ms et 0,4 ms, respectivement.
    4. Mesurer la force musculaire tétanique isométrique en utilisant des fréquences de stimulus croissantes commençant à 30 Hz avec des incréments de 30 Hz jusqu’à ce que le plateau de force maximale soit observé.
    5. Cliquez sur Trigger collection et définissez sur la longueur musculaire optimale prédéterminée.
    6. Appuyez sur le bouton Répéter du stimulateur bipolaire pour induire une stimulation tétatanique pendant un maximum de 5 secondes ou jusqu’à ce qu’un pic de force soit clairement observé.
      REMARQUE: Avant de stimuler le nerf, retirez toujours tout excès de NaCl à 0,9% entourant le nerf à l’aide d’applicateurs à bout de coton pour vous assurer que le signal n’est pas conduit aux tissus environnants.
    7. Pour collecter les données, appuyez à nouveau sur Trigger collection et documentez la force de sortie maximale. Dans le cas où le programme ne détecte pas automatiquement la force de sortie maximale maximale, appuyez sur Refuser et sélectionnez le pic manuellement.
    8. Laissez le muscle reposer à nouveau à zéro précharge pendant 5 minutes avant de commencer les prochaines contractions musculaires tétataniques.
      REMARQUE: Régulièrement (environ toutes les 5 minutes), humidifier le muscle TA avec du NaCl chauffé à 0,9% (37 °C) pour éviter le refroidissement et la dessiccation.
    9. Continuer à augmenter la fréquence du stimulus jusqu’à ce que le plateau de force maximale soit atteint. Le plateau de force sera défini comme la force tétatanique isométrique maximale.
      REMARQUE: Après cette étape, retirez les fils K, agrafez ou suturez la peau et répétez toute la procédure jusqu’au membre postérieur controlatéral, à partir de l’étape 4.

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Résultats

Cinq paramètres sont utilisés pour mesurer la mesure de l’ITF. Ceux-ci incluent la tension musculaire (force de précharge), l’intensité du stimulus (tension), la fréquence du stimulus pulse, la durée du stimulus de 0,4 ms et un retard de 2 ms. Avant de mesurer l’ITF, la tension musculaire optimale doit être déterminée à l’aide de deux contractions musculaires à contraction unique à une intensité de 2 V pendant le test de paramètre. Ces stimuli provoquent une dorsiflexion de la patte et produisent un signal de sortie sur ...

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Discussion

Ce protocole décrit une méthode préalablement validée pour l’acquisition de mesures ITF maximales précises du muscle TA dans le modèle de rat32. La récupération de la force maximale après les traitements expérimentaux de reconstruction nerveuse est d’un intérêt primordial dans le cadre clinique car elle prouve que le nerf non seulement s’est régénéré, mais a également établi des connexions de travail avec le muscle cible. L’ITF peut être utilisé dans un modèle d’écart nerveux de petite taille, tel...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La recherche présentée dans cette publication a été financée par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke des National Institutes of Health sous le numéro ro1 NS 102360. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de sodium à 0,9 %Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, États-UnisG130203
1 mm Fils KirshnerPfizer Howmedica, Rutherford,NJ N/A
Adson Pince à tissusASSI, Westbury, NY, USAMTK-6801226
Câbles d’électrodes bipolairesGrass Instrument, Quincy, MAN/A
Dispositifde stimulation bipolaireGrass SD9, Grass Instrument, Quincy, MAN/A
Applicateurs à embout cotonCardinal Health, Waukegan, IL, USAC15055-006
Pince à moustiques incurvéeASSI, Westbury, NY, USAMTK-1201112
Transducteur de force MDB-2.5Transducteur Techniques, Temecula, CAN/A
Éponges de gaze 4x4Covidien, Mansfield, MA, USA2733
Câble de terreGrass Instrument, Quincy, MAN/A
Chambre d’isofluraneN/AN/A
Kétalar, Par Pharmaceutical, Châtaignier, NJ42023-115-10
LabView SoftwareNational Instruments, Austin, TX
LoopN/AN/ASur mesure
Pince courbe microchirurgicaleASSI, Westbury, NY, USAJFA-5B
Ciseaux microchirurgicauxASSI, Westbury, NY, USA SAS-15R-8-18
Pince droite microchirurgicaleASSI, Westbury, NY, USAJF-3
ÉcarteurASSI, Westbury, NY, USAAG-124426
Lame de scalpel n° 15Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA
agrafeuse cutanée à corps minceCovidien, Mansfield, MA, États-Unis8886803512
Électrode subminiatureHarvard Apparatus, Holliston, MAN/A
Stimulateur nerveux chirurgicalCheckpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, États-Unis9094
Terrell IsofluranePiramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, États-UnisH961J19A
Plate-forme d’essaiN/AN/A
Ciseaux de tétontomieASSI, Westbury, NY, USAASIM-187
Minuterie/chronomètre traçable à gros chiffresFisher Scientific, Waltham, MA, États-UnisS407992
Périphérique d’acquisition de données d’E/S (DAQ) multifonctionnel USB-6009National Instruments, Austin, TX779026-01
Supportde base à videNoga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, IsrealN/ALa pince attachée est faite sur mesure
Poids (10 g)Denver Instruments, Denver, CO, USA820010.4
Poids (20 g)Denver Instruments, Denver, CO, USA820020.4
Poids (50 g)Denver Instruments, Denver, CO, USA820050.4
XylazineXylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada1XYL002
sur mesure371115 sur mesure

Références

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