Article de méthode

Synthèse de fluorophores de pyrazole, d’imidazole et de dipyrrinone isoindolone dépendant du pH à l’aide d’une approche de condensation de Claisen-Schmidt

5.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/61944

⸱

10 juin 2021

 ,  , 
1Department of Physical and Life Sciences, Nevada State College, 2Department of Humanities, Nevada State College

Dans cet article

Résumé

La réaction de condensation de Claisen-Schmidt est une méthodologie importante pour la génération de composés aromatiques bicycliques conjugués pontés par la méthine. En utilisant une variante à médiation de base de la réaction aldol, une gamme de molécules fluorescentes et/ou biologiquement pertinentes peut être accessible par une approche synthétique généralement peu coûteuse et opérationnellement simple.

Résumé

Les composés aromatiques bicycliques conjugués à pont de methine sont des constituants communs d’une gamme de molécules biologiquement pertinentes telles que les porphyrines, les dipyrrinones et les produits pharmaceutiques. De plus, la rotation restreinte de ces systèmes entraîne souvent des systèmes fortement à modérément fluorescents comme observé dans les systèmes 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pyrimidin-3-ones, les xanthoglows, les analogues de pyrroloindolizinedione, les analogues BODIPY et les systèmes cycliques phénoliques et imidazolinone de la protéine fluorescente verte (GFP). Ce manuscrit décrit une méthode peu coûteuse et simple sur le plan opérationnel d’effectuer une condensation de Claisen-Schmidt pour générer une série d’analogues fluorescents de pyrazole/imidazole/dipyrrinone isoindolone dépendant du pH. Bien que la méthodologie illustre la synthèse d’analogues de la dipyrrinone, elle peut être traduite pour produire un large éventail de composés aromatiques bicycliques conjugués. La réaction de condensation de Claisen-Schmidt utilisée dans cette méthode est limitée dans sa portée aux nucléophiles et aux électrophiles qui sont enolissables dans des conditions de base (composant nucléophile) et aux aldéhydes non énolithables (composant électrophile). De plus, les réactifs nucléophiles et électrophiles doivent contenir des groupes fonctionnels qui ne réagiront pas par inadvertance avec l’hydroxyde. Malgré ces limites, cette méthodologie offre un accès à des systèmes complètement nouveaux qui peuvent être utilisés comme sondes biologiques ou moléculaires.

Introduction

Un certain nombre de systèmes bicycliques conjugués, dans lesquels deux cycles aromatiques sont reliés par un pont monométhine, subissent une isomérisation par rotation de liaison, lorsqu’ils sont excités par un photon(figure 1A)1,2,3,4,5. L’isomère excité va généralement se détendre à l’état fondamental par des processus de désintégration non radiatifs6. Si la barrière d’énergie à la rotation de liaison est augmentée dans une mesure suffisamment importante, il est possible de restreindre ou d’empêcher la photoisomérisation. Au lieu de cela, l’excitation photonique se traduit par un état siat excité qui se détend souvent par fluorescence plutôt que par désintégration non radiative(Figure 1B). La photoisomérisation restrictive est le plus souvent accomplie en limitant mécaniquement la rotation des liaisons en attachant les deux systèmes cycliques aromatiques par des liaisons covalentes, verrouillant ainsi la molécule dans un état isomérique particulier. Cette approche a été utilisée pour créer plusieurs analogues tricycliques différents de dipyrrinone et de dipyrroleméthane tels que: 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pyrimidin-3-ones(1),xanthoglows(2)6,7,analogues pyrroloindolizinedione(3)8,et analogues BODIPY9 (4, Figure 2)par lesquels les systèmes de cycle pyrrolidine et / ou pyrrole sont attachés avec des linkers de difluoro méthylène, carbonyle ou bore. Typiquement, 1-4 possèdent ΦF > 0,7 ce qui suggère que ces systèmes sont très efficaces en tant qu’unités de fluorophore.

Il est également possible de restreindre la photoisomérisation par d’autres moyens que la liaison covalente des systèmes d’anneaux. Par exemple, les cycles phénolique et imidazolinone (Figure 2) de la protéine fluorescente verte (GFP) sont limités à la rotation par l’environnement protéique; le réglage restrictif augmente le rendement quantique de trois ordres de grandeur par rapport à la même unité de chromophore en solution libre10. On pense que l’échafaudage protéique de GFP fournit une barrière de rotation par des effets stériques et électrostatiques11. Récemment, notre groupe en collaboration avec le groupe Odoh de l’Université du Nevada, Reno a découvert un autre système de fluorophores qui présente des similitudes structurelles avec les systèmes xanthoglow à base de dipyrrinone (Figure 2)12. Ces analogues de dipyrrinone, cependant, diffèrent du système xanthoglow en ce que les liaisons hydrogène intramoléculaires, plutôt que les liaisons covalentes, déterment la photoisomérisation et ont comme conséquence un système bicyclique fluorescent. En outre, les analogues de pyrazole, d’imidazole, et de dipyrrinone d’isoindolone peuvent se lier à hydrogène dans des états protonés et déprotonés ; la déprotonation entraîne le déplacement vers le rouge des longueurs d’onde d’excitation et d’émission, probablement en raison d’un changement dans la nature électronique du système. Alors que la liaison hydrogène a été signalé pour augmenter les rendements quantiques bien que la rotation restreinte13,14,15,16,nous ne sommes pas au courant de tout autre système de fluorophore dans lequel l’isomérisation restreinte sert de mode de fluorescence dans les états protonés et déprotonés de la molécule. Par conséquent, ces fluorophores de dipyrrinone dépendants du pH sont uniques à cet égard.

Dans cette vidéo, nous nous concentrons sur la synthèse et la caractérisation chimique de la série analogique de dipyrrinone fluorescente. En particulier, l’accent est mis sur la méthodologie de condensation de Claisen-Schmidt qui a été utilisée pour construire la série complète d’analogues fluorescents. Cette réaction repose sur la génération d’un ion énolate vinylogous médié par la base qui attaque un groupe aldéhyde, pour produire un alcool qui subit ensuite une élimination. Pour la série analogique dipyrrinone, une pyrrolinone/isoindolone est convertie en énolate pour faciliter une attaque sur un groupe aldéhyde attaché à un cycle pyrazole ou imidazole (Figure 3) ; après élimination, un système bicyclique entièrement conjugué, relié par un pont de méthine, est formé. Il est à noter que toute la série d’analogues de la dipyrrinone peut être construite à partir de matériaux commerciaux facilement disponibles et peut être produite dans une seule séquence de réaction à un pot généralement dans des rendements modérés à élevés (les rendements varient d’environ 50 à 95%). Étant donné que la plupart des analogues de la dipyrrinone sont de nature très cristalline, très peu de purification en dehors des conditions de manoeuvre standard est nécessaire pour produire des échantillons analytiques purs. Par conséquent, ce système de fluorophores ne nécessite que quelques étapes pour accéder à partir de matériaux commerciaux facilement disponibles et peut être synthétisé, purifié et préparé pour des études analytiques ou biologiques dans un laps de temps relativement court.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Procédure générale pour la synthèse des analogues de dipyrrinone 16-25

  1. Dissoudre la pyrrolinone/isoindolone (1,00 mmol) et l’aldéhyde pyrazole/imidazole correspondant (1,00 mmol) dans 5,0 mL d’éthanol dans une fiole à fond rond.
  2. Ajouter le KOH aqueux (24,0 mmol, 10 M, 2,40 mL) à la fiole en une seule portion.
  3. Agiter et refluxer le mélange jusqu’à ce que l’achèvement de la réaction soit confirmé par TLC (voir le tableau 1 pour une liste des temps de réaction). Un éluant TLC de méthanol à 10% dans le dichlorométhane a été utilisé et les analogues ont été observés pour posséder des valeurs de Rf dans ou autour de la gamme de 0,62 à 0,86. Appliquer une quantité suffisante de graisse sous vide ou utiliser un manchon en PTFE à l’interphase des joints de verre pour empêcher le verre du condenseur et le ballon à fond rond de se saisir à des températures élevées et dans des conditions de base.
  4. Laisser refroidir le mélange réactionnel à température ambiante et évaporer les matières volatiles sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif.
  5. Refroidir le mélange réactionnel à 0 °C à l’aide d’un bain de glace.
  6. Neutraliser le mélange huileux restant en ajoutant de l’acide acétique (30,0 mmol, 1,70 mL) dans une portion.
  7. Purifier le matériau du produit résultant en utilisant la filtration sous vide (voir l’étape 2a,pour les composés: 17, 18, 20-22, 24 et 25)ou utiliser l’extraction liquide-liquide / chromatographie sur colonne (voir l’étape 2b,pour les composés: 16, 19et 23).

2. Purification de la procédure

  1. par filtration sous vide
    1. Installer un entonnoir Hirsch sur un ballon à bras latéral à l’aide d’un adaptateur en caoutchouc.
    2. Appliquez un morceau de papier filtre rond sur l’entonnoir Hirsch et mouillez légèrement à l’aide d’eau désionisée pour permettre l’adhérence à l’entonnoir.
    3. Connectez une source de vide au bras latéral du ballon et assurez-vous qu’il y a un joint sous vide suffisant en vous assurant qu’aucune de la verrerie ne peut être séparée sous vide.
    4. Verser le ballon contenant le produit cristallisé sur le filtre à vide et laisser filtrer. Rincer les cristaux avec 10 mL d’eau désionisée glacée.
    5. Laissez les cristaux filtrés continuer à sécher sur le papier filtre, tout en restant connectés à la source de vide, après la filtration de tous les liquides.
    6. Recueillir les cristaux filtrés et les placer dans une fiole à fond rond de 25 mL.
    7. Fixez le ballon à fond rond à un joint en verre rodé fritte/adaptateur de conduite sous vide. Fixez l’union du joint de verre avec un clip de picotement.
    8. À l’extrémité nervurée de l’adaptateur de conduite à vide poussé en verre, fixez une conduite de vide qui est acheminée vers une pompe à vide élevé et refroidissez adéquatement un piège à vide (à l’aide d’un liquide de refroidissement tel que de l’azote liquide ou de la glace carbonique/acétone) pour condenser les matériaux volatils qui peuvent s’évaporer du matériau cristallin. Allumez la pompe à vide élevé pour assurer l’évaporation complète de toute trace de solvant restant des cristaux.
    9. Laisser sécher les cristaux sous vide poussé pendant au moins 1 h. Retirez le ballon à fond rond de la conduite ou de l’adaptateur de vide, éteignez la pompe à vide haute et nettoyez le piège à vide.
  2. Procédure de purification par chromatographie sur colonne
    1. Diluer le contenu du mélange réactionnel traité à l’acide acétique (à partir de l’étape 1.6) avec 10 mL d’eau désionisée et le transférer dans un entonnoir séparateur. Ajouter 10 mL de dichlorométhane à l’entonnoir séparateur. Secouez doucement et évacuez l’entonnoir séparateur afin de séparer les deux couches.
    2. Extraire la couche aqueuse à l’aide des portions subséquentes de dichlorométhane (3 x 5 mL). Combiner les fractions organiques et sécher àl’aide de Na2SOanhydre. Décanter et éliminer tous les composés volatils sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif.
    3. Diluer le résidu obtenu à l’étape 2.2.2. avec 5 mL deCH2Cl2. Effectuer une chromatographie sur colonne flash en utilisant environ 75 g de gel de silice. Éluer l’échantillon avec une solution de méthanol à 10 % dans du dichlorométhane.
    4. Retirer les fractions de solvant collectées sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif. Transer le résidu solide dans une fiole à fond rond de 25 mL en utilisant environ 10 mL deCH2Cl2. Retirer le solvant sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif.
    5. Sécher le résidu solide restant sous vide poussé comme décrit précédemment aux étapes 2.1.7 à 2.1.9.

3. Acquisition d’absorptivité molaire et UV / Vis pKa Études pour les analogues 16-25

  1. Créer des solutions de stock composé pour la spectrophotométrie UV / Vis pour les analogues 16 - 25.
    1. Peser 10 μmol de l’analogue de dipyrrinone sélectionné(16 - 25)et l’ajouter à une fiole jaugée de 10 mL.
    2. Ajouter le DMSO à la marque de 10,0 mL sur la fiole jaugée.
      NOTA: Si le composé ne se dissout pas entièrement, chauffer le ballon à l’aide d’un pistolet thermique et agiter le ballon selon les besoins pour dissoudre complètement le composé.
  2. Fabriquer des solutions salines tamponnés au phosphate (PBS) à différents niveaux de pH. Les analogues ont été caractérisés dans des tampons PBS s’étendant dans le pH d’approximativement 4 à 15.
    1. À l’aide d’un cylindre volumétrique de 1 L, créer 1 L de solution mère de PBS en diluant 100 mL de PBS (x100) dans 900 mL d’eau désionisée.
    2. Transférer 50 mL de la solution mère de PBS préparée (étape 3.2.1) dans un bécher de 100 mL et ajouter une barre d’agitation magnétique. Ensuite, à l’aide d’un pH-mètre étalonné pour surveiller les changements de pH, titrer le tampon PBS avec du NaOH aqueux de 1,0 M (pour obtenir des tampons avec un pH > 7,0) ou du HCl de 1,0 M (pour obtenir des tampons avec un pH < 7,0).
      NOTA : Pour obtenir des données qui se traduit par une courbe de titrage bien définie, nous recommandons de générer des tampons de pH par incréments de 0,1 unité de pH dans ± 0,5 du point d’inflexion prévu et des incréments de 0,5 en dehors du point d’inflexion prévu.
  3. Acquérir des spectres d’absorptivité molaire pour les analogues 16 - 25 dans des solutions PBS (pH 7,0) et NaOH 1,0 M (pH 14,0).
    1. Préparer un « blanc » à l’aide d’une cuvette de quartz propre et sèche, puis ajouter 2,0 mL de solution mère de PBS (pH 7,0) ou de NaOH aqueuse de 1,0 M à la cuvette à l’aide d’une micropipette de 100 à 1000 μL.
      REMARQUE : Il est important pour l’intégrité du processus d’acquisition des données de la solution à blanc de s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la solution de la cuvette et d’essuyer soigneusement les côtés de la cuvette avec une lingette Kim pour éviter la diffusion de la lumière résultant de la poussière ou des débris à l’extérieur de la cuvette. Si les bulles persistent, appuyez doucement et à plusieurs reprises sur une serviette en papier posée sur une surface dure.
    2. À l’aide d’un spectrophotomètre UV/Vis, videz la solution sélectionnée pour une plage de 200 à 800 nm.
    3. Dans une seconde cuvette de quartz propre et sèche, ajouter 2,00 mL de PBS (pH 7,0) ou 1,0 M de NaOH (pH 14), suivi de 10 μL de la solution mère analogue de dipyrrinone(16 - 25)(voir étape 3.1) avec une micropipette de 5 à 50 μL. Placez un bouchon sur la cuvette et bien agiter en plus d’inverser la cuvette.
      NOTA : Il est important pour l’intégrité du processus d’acquisition des données de la solution d’échantillon de s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la solution de la cuvette et d’essuyer soigneusement les côtés de la cuvette avec une lingette Kim pour éviter la diffusion de la lumière résultant de la poussière ou des débris à l’extérieur de la cuvette. Si les bulles persistent, appuyez doucement et à plusieurs reprises sur une serviette en papier posée sur une surface dure.
    4. À l’aide du spectrophotomètre UV/Vis, acquérir un spectre d’absorption pour la solution analogique de dipyrrinone pour une plage de 200 à 800 nm.
    5. À la même cuvette, ajouter 10 μL supplémentaires de la solution mère analogique de dipyrrinone et répéter les étapes 3.3.3 et 3.3.4.
    6. Répétez l’étape 3.3.5 jusqu’à ce qu’un total de 50 μL de solution mère analogique de dipyrrinone ait été ajouté à la cuvette afin d’acquérir au moins cinq points de données de longueur d’onde d’excitation. Répéter les étapes 3.3.1 à 3.3.6 jusqu’à ce que toutes les solutions d’origine de 16 à 25 aient été obtenues à la fois dans du PBS (pH 7,0) et du NaOH de 1,0 M.
  4. Obtenir des valeurs d’absorptivité molaire pour 16 - 25 dans pbs (pH 7,0) et naOH 1,0 M en utilisant l’analyse de régression linéaire la mieux ajustée.
    1. À l’aide d’un programme graphique tel que GraphPad Prism 7, tracez l’absorbance mesurée (axe des y) par rapport à la concentration analogique de dipyrrinone (axe des x). Créez une analyse de régression linéaire ajustée au mieux pour les cinq points tracés. Une relation linéaire doit être observée et l’analyse statistique doit montrer une valeur R2 ≥ 0,98.
    2. Répéter l’étape 3.4.1 pour les analogues 16 - 25 en PBS (pH 7,0) et NaOH 1,0 M.
    3. Calculer l’absorptivité molaire pour 16 - 25 dans pbs (pH 7,0) et 1,0 M NaOH en utilisant la valeur de pente extrapolée de la courbe linéaire la mieux ajustée.
  5. Déterminer le pKa des valeurs de 16 - 25 études utilisant la spectrophotométrie UV / Vis
    1. Dans une cuvette de quartz propre et sèche, transférer 1 900 μL du tampon PBS au niveau de pH choisi (préparé à l’étape 3.2) à l’aide d’une micropipette de 100 à 1000 μL.
      REMARQUE: Nous avons remarqué lors du stockage qu’un précipité blanc peut se former dans certains des tampons. Pour s’assurer que le tampon est complètement homogène et si un précipité est visible, utilisez une filtration par gravité pour éliminer tout précipité immédiatement avant l’utilisation. Voir la note après l’étape 3.3.1.
    2. À l’aide du spectrophotomètre UV/Vis, vider la solution tampon PBS sélectionnée pour une plage de 200 à 800 nm.
    3. Dans une deuxième cuvette de quartz propre et sèche, transférer 1 900 μL du tampon PBS sélectionné, puis ajouter 100 μL de la solution mère analogique sélectionnée à l’aide d’une micropipette de 5 à 50 μL. Placez un bouchon sur la cuvette et bien agiter en plus d’inverser la cuvette.
      Remarque : voir la note précédente après l’étape 3.3.3.
    4. À l’aide du spectrophotomètre UV/Vis, acquérir le spectre d’absorption de l’analogue de la dipyrrinone pour une plage de 200 à 800 nm.
    5. Répétez les étapes 3.5.1 à 3.5.4 pour 16 à 25 dans chacun des tampons PBS générés à l’étape 3.2.
  6. Déterminez les valeurs pKa pour 16 - 25 à l’aide d’une fonction d’ajustement de courbe sigmoïdale mieux ajustée.
    1. À l’aide d’un programme graphique, représenter graphiquement l’absorbance mesurée par rapport à la longueur d’onde (nm) pour 16 à 25 aux différents niveaux de pH.
    2. Choisissez une longueur d’onde comprise entre 380 et 415 nm où, à des niveaux de pH inférieurs (< 7,0), l’absorbance est faible (0 à 0,1 unité) et à un pH supérieur (> 12,0), l’absorbance est considérablement plus grande (0,8 à 1,0 unité). Tracer l’absorbance à la longueur d’onde choisie par rapport au pH.
    3. À l’aide d’une fonction de courbe sigmoïdale, générez une courbe le mieux ajustée pour chacun des analogues 16 - 25. Indiquez le pH extrapolé à mi-hauteur de la courbe. Il s’agit de la valeur pKa signalée.

4. Acquisition de rendement quantique et études de fluorescence

  1. Créer des solutions de stock d’étude de fluorescence pour les analogues de dipyrrinone 16 - 18 et 20 - 25.
    1. À l’aide d’une solution mère analogique de dipyrrinone créée à l’étape 3.1, effectuer une dilution de la solution mère en ajoutant 10 μL de la solution mère à une fiole jaugée de 1 mL à l’aide d’une micropipette de 2 à 20 μL, puis ajouter un tampon PBS (pH 7,0) à la marque de 1 mL. Placer un bouchon sur la fiole jaugée et bien mélanger en inversant et en secouant la fiole. Cette solution mère diluée sera utilisée pour générer les spectres de fluorescence et sera appelée solution mère de fluorescence.
    2. Répétez l’étape 4.1.1 pour les analogues 16 - 18 et 20 - 25.
  2. Acquérir des spectres d’émission de fluorescence à des concentrations variables, pour les analogues 16 - 18 et 20 - 25. Pour tous les analogues autres que 18,acquérir cinq spectres pour chaque analogue dans des solutions de pH 7 et 14 à des concentrations de: 19,96, 39,84, 59,64, 79,37 et 99,01 nM. Pour l’analogue 18, acquérir cinq spectres dans une solution de pH 7 à des concentrations de : 49,75, 99,01, 147,8, 196,1 et 243,9 nM. Dans une solution de pH 14, acquérir cinq spectres pour l’analogue 18 à des concentrations de: 99,01, 196,1, 291,3, 384,6, 476,2 nM.
    1. Dans une cuvette de quartz transparente à quatre faces, ajouter 3,00 mL de PBS (pH 7,0) ou 1,0 NaOH à l’aide d’une micropipette de 100 à 1 000 μL par trois incréments de 1 000 μL.
      NOTA: Voir la note après l’étape 3.3.1.
    2. À l’aide du fluoromètre et du logiciel de fluoromètre FluorEssence, acquérir un spectre d’émission pour la solution sélectionnée et l’étiqueter comme la solution « vierge ».
    3. À la même cuvette, ajouter 6 μL de solution mère de fluorescence pour l’analogue de dipyrrinone sélectionné (partie 4.1) à l’aide d’une micropipette de 0,5 à 10 μL. Placez le capuchon sur la cuvette et mélangez bien en inversant et en secouant doucement la cuvette.
      NOTA : Voir la note après l’étape 3.3.3.
    4. À l’aide du fluoromètre, acquérir un spectre d’émission pour la solution composée sélectionnée en utilisant λmax abs comme longueur d’onde d’excitation. L’intensité d’excitation a été mesurée sur une plage de 200 nm à partir de 15 nm au-delà de la longueur d’onde d’excitation (généralement une plage de 200 nm est nécessaire pour que l’intensité de fluorescence revienne à la ligne de base).
    5. Répéter les étapes 4.2.3 à 4.2.4 jusqu’à ce qu’un total de 30 μL de solution mère de fluorescence ait été ajouté à la cuvette.
    6. Répétez les étapes 4.2.1 - 4.2.5 pour les analogues 16 - 25 en PBS (pH 7.0) et NaOH 1,0 M.
      NOTA : Les concentrations de la cuvette ont été modifiées pour l’analogue 18 et les données ont été acquises en utilisant : 2,0 mL de PBS avec cinq incréments consécutifs de 10 μL de solution mère de fluorescence pour une solution neutre (protonée 18)et 2,0 mL de NaOH 1,0 M avec cinq incréments de 20 μL de solution mère composée ajoutée pour une solution basique (déprotonée 18).
  3. Déterminer le rendement quantique à l’aide de la méthode de Williams, A. T. et al.17
    1. À l’aide d’un tableur (c.-à-d. Microsoft Excel), importez les données (points de données sur l’intensité des émissions) des spectres d’émission d’un seul analogue de la dipyrrinone (prises dans du PBS [pH 7,0] ou du NaOH de 1,0 M) aux divers niveaux de concentration.
    2. Importer les points de données des spectres d’émission pour la solution « à blanc » (étapes 4.2.1 à 4.2.2) et soustraire les points de données d’intensité d’émission « à blanc » des points de données d’intensité d’émission, aux longueurs d’onde correspondantes, acquis à différents niveaux de concentration.
    3. Transférez les points de données d’intensité d’émission corrigés « vierges » dans un programme graphique, tel que GraphPad Prism 7, et tracez l’émission par rapport à la longueur d’onde. Calculer l’aire sous la courbe pour chacune des courbes obtenues aux différents niveaux de concentration de l’analogue de la dipyrrinone.
    4. Suivant la technique décrite par Williams, A. T. et coll., calculer une valeur d’absorbance extrapolée pour chacun des niveaux de concentration variables de l’analogue de la dipyrrinone. Ceci est accompli en multipliant la valeur d’absorptivité molaire calculée (de l’analyse de régression linéaire la mieux ajustée, voir l’étape 3.4) par chaque concentration d’analogue de dipyrrinone utilisée dans les étapes 4.2.3-4.2.5.
    5. À l’aide d’un programme graphique tel que GraphPad Prism 7, créez un tracé de l’absorbance extrapolée de l’analogue (axe des x) par rapport à la surface calculée sous chaque courbe de concentration (étape 4.3.4) pour la longueur d’onde d’émission correspondant à la plus grande valeur d’émission. Une relation linéaire avec unr2 ≥ 0,96 doit être observée.
    6. Effectuer des étapes analogues aux 3.1-3.4 et 4.1-4.3.5 pour la quinine dans 0,5MH2SO4(ΦF = 0,55)18 et l’anthracène dans l’éthanol (ΦF = 0,27) 18,19 afin d’obtenir des données pour les étalons.
    7. Obtenir les valeurs de rendement quantique pour 16 - 25 dans pbs (pH 7,0) et 1,0 M NaOH en utilisant les pentes extrapolées obtenues à partir des étapes 4.3.5 et 4.3.6 dans l’équation suivante:
      Φx =Φst(Gradx/Gradst)(η2x/η2st)
      où Φst représente le rendement quantique de l’étalon, Φx représente le rendement quantique de l’inconnu, Grad est la pente du meilleur ajustement linéaire, et η est l’indice de réfraction du solvant utilisé (le rapport d’indice de réfraction a été calculé en utilisant η = 1,36 pour l’éthanol et η = 1,35 pour 0,5 MH2SO4).
    8. Rapporter les rendements quantiques de 16 - 18 et 20 - 25 dans le PBS (pH 7,0) et le NaOH de 1,0 M en moyenne du Φx obtenu pour la quinine et l’anthracène.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La réaction de condensation de Claisen-Schmidt a donné accès à des analogues de dipyrrinone(16-25, figure 4)en utilisant la procédure à un pot décrite dans la section protocole (voir étape 1). Les analogues 16-25 ont tous été générés par condensation de la pyrrolinone 9,de la bromoisoindolone 10,ou de l’isoindolone 11 avec le 1 H-imidazole-2-carboxaldéhyde(1...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

L’approche de condensation de Claisen-Schmidt fournit un moyen assez robuste de générer des fluorophores de pyrazole, d’imidazole et d’isoindolone dipyrrinone grâce à un protocole relativement simpliste sur le plan opérationnel. Bien que la synthèse des analogues fluorescents de la dipyrrinone ait été au centre de cette étude, il convient de noter que des conditions similaires peuvent être appliquées pour accéder à d’autres systèmes cycliques liés à la méthine tels que les dipyrrinones23,

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Z.R.W. et N.B. remercient les NIH (2P20 GM103440-14A1) pour leur généreux financement ainsi que Jungjae Koh et l’Université du Nevada, Las Vegas pour leur aide dans l’acquisition de rmn 1H et 13C. De plus, nous tenons à remercier les étudiants en médias visuels de NSC, Arnold Placencia-Flores, Aubry Jacobs et Alistair Cooper pour leur aide dans les processus de tournage et d’animation dans les parties cinématographiques de ce manuscrit.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-éthyl-4-méthyl-3-pyrroline-2-oneCombi-blocs  ;[ 766-36-9]Réactif solide jaune
isoindolin-1-oneArkPharm  ;[ 480-91-1]Réactif solide blanc cassé
5-bromoisoindolin-1-oneCombi-Blocks  ;[ 552330-86-6]Réactif solide rose
2-formylimidazoleCombi-Blocks  ;[ 10111-08-7 ]Réactif solide blanc cassé
Imidazole-4-carbaldéhydeArkPharm  ;[ 3034-50-2]Réactif solide
1-H-pyrazole-4-carbaldéhydeOakwood Chemicals  ;[ 35344-95-7]Réactif solide
1-H-pyrazole-5-carbaldéhydeMatrix Scientific  ;[ 3920-50-1]Réactif solide
Pastilles solides KOHBeanTown Chemicals[1310-58-3]Pastilles solides blanches
Siliflash Gel de siliceScilicycleR12030BPoudre blanche fine
Saline tamponnée au phosphate (PBS) (x10)GrowcellsMRGF-6235Liquide translucide incolore
Beckman Coulter DU-800 Spectrophotomètre UV/Vis et logicielBeckman Coulter/AInstrument et logiciel de spectroscopie
Spectrofluorimètre Fluoromax-4Instrument de spectroscopieHoriba ScientificN/A
fluormétrie FluorEssence V3.5Horiba ScientificN/ALogiciel de spectroscopie
Finnpipette II Micropipette (tailles : 100-1 000, 20-200 et 0,5-10 & micro ; L)FischerbrandN/AEquipment
Wilmad-LabGlass Évaporateur rotatif (modèle : WG-EV311-V-PLUS)SP SciencewareN/AEquipment
Pompe à vide DuoSeal (numéro de modèle : 1405)WelchN/AEquipment
GraphPad Prism 4GraphPadN/ALogiciel d’analyse de données
SympHony pH Meter (modèle : Sb70P)VWRN/AÉquipement
N Logiciel de

Références

  1. Abbandonato, G., et al. Cis-trans photoisomerization properties of GFP chromophore analogs. European Biophysics Journal. 40 (11), 1205-1214 (2011).
  2. Funakoshi, H., et al. Spectroscopic studies on merocyanine photoisomers. IV. Catalytic isomerization of photoisomers of merocyanine derivatives in protic solvents. Nippon Kagaku Kaishi. (9), 1516-1522 (1989).
  3. Puzicha, G., Shrout, D. P., Lightner, D. A. Synthesis and properties of homomologated and contracted dipyrrinone analogs of xanthobilirubic acid. Journal of Heterocyclic Chemistry. 27 (7), 2117-2123 (1990).
  4. Bonnett, R., Hamzetash, D., Asuncion Valles, M. Propentdyopents [5-(2-oxo-2H-pyrrol-5-ylmethylene)pyrrol-2(5H)-ones] and related compounds. Part 2. The Z E photoisomerization of pyrromethenone systems. Journal of the Chemical Society, Perkins Transactions. 1 (6), 1383-1388 (1987).
  5. Tikhomirova, K., Anisimov, A., Khoroshutin, A. Biscyclohexane-Annulated Diethyl Dipyrrindicarboxylates: Observation of a Dipyrrin Form with Absent Visible Absorption. European Journal of Organic Chemistry. 2012 (11), 2201-2207 (2012).
  6. Brower, J. O., Lightner, D. A. Synthesis and spectroscopic properties of a new class of strongly fluorescent dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 67 (8), 2713-2716 (2002).
  7. Woydziak, Z. R., Boiadjiev, S. E., Norona, W. S., McDonagh, A. F., Lightner, D. A. Synthesis and Hepatic Transport of Strongly Fluorescent Cholephilic Dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 70 (21), 8417-8423 (2005).
  8. Jarvis, T., et al. Pyrrole β-amides: Synthesis and characterization of a dipyrrinone carboxylic acid and an N-Confused fluorescent dipyrrinone. Tetrahedron. 74 (14), 1698-1704 (2018).
  9. Bodio, E., Denat, F., Goze, C. BODIPYS and aza-BODIPY derivatives as promising fluorophores for in vivo molecular imaging and theranostic applications. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 23, 1159-1183 (2019).
  10. Acharya, A., et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing. Chemical Reviews. 117 (2), 758-795 (2017).
  11. Romei, M. G., Lin, C. -Y., Mathews, I. I., Boxer, S. G. Electrostatic control of photoisomerization pathways in proteins. Science. 367 (6473), 76-79 (2020).
  12. Benson, N., Suleiman, O., Odoh, S. O., Woydziak, Z. Ryrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Analogues: pH-Dependent Fluorophores That Red-Shift Emission Frequencies in a Basic Solution. Journal of Organic Chemistry. 84 (18), 11856-11862 (2019).
  13. Xie, P., Gao, G., Liu, J., Jin, Q., Yang, G. A New Turn on Fluorescent Probe for Selective Detection of Cysteine/Homocysteine. Journal of Fluorescence. 25 (5), 1315-1321 (2015).
  14. Alty, I. G., et al. Intramolecular Hydrogen-Bonding Effects on the Fluorescence of PRODAN Derivatives. Journal of Physical Chemistry A. 120 (20), 3518-3523 (2016).
  15. Yang, Y., Li, D., Li, C., Liu, Y. F., Jiang, K. Hydrogen bond strengthening induces fluorescence quenching of PRODAN derivative by turning on twisted intramolecular charge transfer. Spectrochimica Acta, Part A. 187, 68-74 (2017).
  16. Zhang, L., Liu, J., Gao, J., Zhang, F., Ding, L. High solid fluorescence of a pyrazoline derivative through hydrogen bonding. Molecules. 22 (8), 1(2017).
  17. Williams, A. T. R., Winfield, S. A., Miller, J. N. Relative fluorescence quantum yields using a computer-controlled luminescence spectrometer. Analyst. 108 (1290), 1067-1071 (1983).
  18. Eaton, D. F. Reference materials for fluorescence measurement. Pure and Applied Chemistry. 60 (7), 1107-1114 (1988).
  19. Dawson, W. R., Windsor, M. W. Fluorescence yields of aromatic compounds. Journal of Physical Chemistry. 72 (9), 3251-3260 (1968).
  20. Zhang, X. -F., Zhang, J., Lu, X. The Fluorescence Properties of Three Rhodamine Dye Analogues: Acridine Red, Pyronin Y and Pyronin B. Journal of Fluorescence. 25 (4), 1151-1158 (2015).
  21. Zanker, V., Rammensee, H., Haibach, T. Measurements of the relative quantum yields of the fluorescence of acridine and fluorescein dyes. Zeitschrift für Angewandte Physik. 10, 357-361 (1958).
  22. Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., Lewis, C. J., Waggoner, A. S. Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry. 4 (2), 105-111 (1993).
  23. Battersby, A. R., Dutton, C. J., Fookes, C. J. R. Synthetic studies relevant to biosynthetic research on vitamin B12. Part 7. Synthesis of (±)-bonellin dimethyl ester. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 1 (6), 1569-1576 (1988).
  24. Pfeiffer, W. P., Lightner, D. A. (m.n)-Homorubins: syntheses and structures. Monatschfte für Chemie. 145 (11), 1777-1801 (2014).
  25. Huggins, M. T., Musto, C., Munro, L., Catalano, V. J. Molecular recognition studies with a simple dipyrrinone. Tetrahedron. 63 (52), 12994-12999 (2007).
  26. Groselj, U., et al. Synthesis of Spiro-δ2-Pyrrolin-4-One Pseudo Enantiomers via an Organocatalyzed Sulfa-Michael/Aldol Domino Sequence. Advanced Synthesis & Catalyst. 361 (22), 5118-5126 (2019).
  27. El-Shwiniy, W. H., Shehab, W. S., Mohamed, S. F., Ibrahium, H. G. Synthesis and cytotoxic evaluation of some substituted pyrazole zirconium(IV) complexes and their biological assay. Applied Organometallic Chemistry. 32 (10), (2018).
  28. Murray, L., O'Farrell, A. -M., Abrams, T. Preparation of indolinone compounds for treatment of excessive osteolysis. US Patent. , US20040209937A1 (2004).
  29. Lozinskaya, N. A., et al. Synthesis and biological evaluation of 3-substituted 2-oxindole derivatives as new glycogen synthase kinase 3β inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 27 (9), 1804-1817 (2019).
  30. Montforts, F. P., Schwartz, U. M. A directed synthesis of the chlorin system. Liebigs Annalen der Chemie. (6), 1228-1253 (1985).
  31. Uddin, M. I., Thirumalairajan, S., Crawford, S. M., Cameron, T. S., Thompson, A. Improved synthetic route to C-ring ester-functionalized prodigiosenes. Synlett. (17), 2561-2564 (2010).
  32. Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Aromatic congeners of bilirubin: synthesis, stereochemistry, glucuronidation and hepatic transport. Tetrahedron. 57 (37), 7813-7827 (2001).
  33. Clift, M. D., Thomson, R. J. Development of a Merged Conjugate Addition/Oxidative Coupling Sequence. Application to the Enantioselective Total Synthesis of Metacycloprodigiosin and Prodigiosin R1. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14579-14583 (2009).
  34. Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Synthesis of a New Lipophilic Bilirubin. Conformation, Transhepatic Transport and Glucuronidation. Tetrahedron. 56 (40), 7869-7883 (2000).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Synth se de la dipyrrinonefluorophores d pendants du pHnolate vinylogueanalogues fluorescents de la dipyrrinonereflux d hydroxyde de potassiumchromatographie sur couche mincechromatographie sur colonne flashspectroscopie UV Visspectroscopie de fluorescence

Articles connexes