Préparation d’échantillons de plantes pour la mesure de la teneur en nucléosides/nucléotides avec une CLHP-MS/MS

Résumé

Une méthode précise et reproductible pour la quantification in vivo des nucléosides/nucléotides dans les plantes est décrite ici. Cette méthode utilise une CLHP-MS/MS.

Résumé

Les nucléosides/nucléotides sont des blocs de construction d’acides nucléiques, de parties de cosubstrates et de coenzymes, de molécules de signalisation cellulaire et de vecteurs d’énergie, qui sont impliqués dans de nombreuses activités cellulaires. Ici, nous décrivons une méthode rapide et fiable pour la qualification absolue des teneurs en nucléosides / nucléotides dans les plantes. En bref, 100 mg de matériel végétal homogénéisé ont été extraits avec 1 mL de tampon d’extraction (méthanol, acétonitrile et eau dans un rapport de 2:2:1). Plus tard, l’échantillon a été concentré cinq fois dans un lyophilisateur, puis injecté dans une CLHP-MS/MS. Les nucléotides ont été séparés sur une colonne poreuse de carbone graphitique (PGC) et les nucléosides ont été séparés sur une colonne C18. Les transitions de masse de chaque nucléoside et nucléotide ont été surveillées par spectrométrie de masse. Les teneurs des nucléosides et des nucléotides ont été quantifiées par rapport à leurs étalons externes (ESTD). En utilisant cette méthode, les chercheurs peuvent donc facilement quantifier les nucléosides / nucléotides dans différentes plantes.

Introduction

Les nucléosides/nucléotides sont des composants métaboliques centraux dans tous les organismes vivants, qui sont les précurseurs des acides nucléiques et de nombreux coenzymes, tels que le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), et importants dans la synthèse des macromolécules telles que les phospholipides, les glycolipides et les polysaccharides. Structurellement, le nucléoside contient une nucléobase, qui peut être une adénine, une guanine, un uracile, une cytosine ou une thymine, et une fraction sucrée, qui peut être un ribose ou un désoxyribose^1,2. Les nucléotides ont jusqu’à trois groupes phosphates se ....

Protocole

1 Croissance des plantes et collecte des matériaux

1. Assurez-vous que les graines d’Arabidopsis sont stérilisées dans de l’éthanol à 70% pendant 10 min et semées sur les plaques de gélose, qui ont été préparées avec des nutriments Murashige et Skoog d’une demi-force.
2. Incuber les plaques contenant des graines d’Arabidopsis sous l’obscurité à 4 °C pendant 48 h, puis les transférer dans une chambre de croissance contrôlée sous une lumière de 16 h de 55 μmol m^-2 s^-1 à 22 °C et 8 h d’obscurité à 20 °C.
3. Récolter 100 mg de semis de 2 semaines (poids frais) et congeler dans de l’azote liquide pour l’extractio....

Résultats

Ici, nous montrons l’identification et la quantification de N 1-méthyladénosine, un nucléoside modifié connu, dans des semis de type sauvage Arabidopsis (Col-0) âgés de 2 semaines à titre d’exemple. Le profil de spectrométrie de masse indiqueque les ions produits générés à partir de l’étalon N1-méthyladénosine sont de 150 m/z et 133 m/z(figure 2A),et le même profil est également observé dans l’extraction Col-0

Discussion

Les organismes contiennent divers nucléosides/nucléotides, y compris des nucléotides canoniques et aberrants. Cependant, l’origine et les paramètres métaboliques de ceux-ci, en particulier les nucléosides modifiés, sont encore obscurs. En outre, la compréhension actuelle de la fonction et de l’homéostasie du métabolisme des nucléosides/nucléotides reste à explorer et à élargir. Pour les étudier, il convient d’utiliser une méthode précise et de référence pour l’identification et la quantification de ces métabolites. Ici, .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
acétonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adénosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
acétate d'ammonium	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Colonne Hypercarb	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
méthanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-méthyladénosine	Carbosynth	NM03697
O6-méthylganosine	Carbosynth	NM02922
Milieu Murashige et Skoog	Duchefa Biochemie	M0255.005
Colonne Polaris 5 C18A	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G