Dans la présente étude, l’expression est réduite de deux composants de signalisation en aval de la voie PERK, la calcineurine cytoprotectrice et le CHOP pro-apoptotique, en utilisant des shRNAs spécifiques. De manière opposée, ceux-ci modulent la susceptibilité des neurones corticaux primaires à l’atrophie des neurites après induction d’un stress du réticulum endoplasmique.
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Article de méthode
Modulation moléculaire par des shRNAs spécifiques délivrés par lentivirus dans des neurones stressés par le réticulum endoplasmique
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’accumulation de protéines dépliées dans le réticulum endoplasmique (RE), causée par toute condition de stress, déclenche la réponse protéique dépliée (UPR) par l’activation de capteurs spécialisés. L’EPU tente d’abord de restaurer l’homéostasie; Mais si les dommages persistent, la signalisation induit l’apoptose.
Il est de plus en plus évident que le stress prolongé et non résolu des urgences contribue à de nombreuses pathologies, y compris les maladies neurodégénératives. Parce que l’UPR contrôle le devenir cellulaire en basculant entre les processus cytoprotecteurs et apoptotiques, il est essentiel de comprendre les événements définissant cette transition, ainsi que les éléments impliqués dans sa modulation.
Récemment, nous avons démontré que l’accumulation anormale de gangliosides GM2 provoque l’épuisement de la teneur en ER Ca2+ , qui à son tour active PERK (PKR-like-ER kinase), l’un des capteurs UPR. De plus, la signalisation PERK participe à l’atrophie des neurites et à l’apoptose induite par l’accumulation de GM2. À cet égard, nous avons mis en place un système expérimental qui nous permet de moduler moléculairement l’expression des composants PERK en aval et ainsi modifier la vulnérabilité des neurones à subir une atrophie neuritique.
Nous avons effectué l’élimination de l’expression de la calcineurine (cytoprotectrice) et CHOP (pro-apoptotique) dans des cultures neuronales corticales de rat. Les cellules ont été infectées par un shRNA spécifique délivré par lentivirus, puis traitées avec du GM2 à différents moments, fixées et immunocolorées avec un anticorps anti-MAP2 (protéine 2 associée aux microtubes). Plus tard, les images cellulaires ont été enregistrées à l’aide d’un microscope à fluorescence et la croissance totale des neurites a été évaluée à l’aide du logiciel de traitement d’images du domaine public ImageJ. L’inhibition de l’expression de ces composants de signalisation PERK a clairement permis d’accélérer ou de retarder l’atrophie neuritique induite par le stress ER.
Cette approche pourrait être utilisée dans les modèles du système cellulaire du stress ER pour évaluer la vulnérabilité des neurones à l’atrophie des neurites.
Introduction
Le stress du réticulum endoplasmique (RE) est défini comme toute perturbation qui compromet la capacité de repliement des protéines dans l’organite. L’accumulation de protéines dépliées dans la lumière ER active un signal en cascade de transduction appelé réponse protéique dépliée (UPR). Cette voie de signalisation complexe est orchestrée par trois capteurs de stress : PERK (protéine kinase ARN [PKR]-like ER kinase), IRE1 (enzyme 1 nécessitant de l’inositol) et ATF6 (facteur de transcription activé 6). Tous ensemble tentent de restaurer l’homéostasie. Mais si le stress persiste, l’UPR finit par induire la mort cellulaire par apoptose1.
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Protocole
Les procédures animales sont effectuées conformément aux protocoles approuvés du Guide de l’Institut national de la santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’autorisation de mener l’étude est accordée par le Comité de protection et d’éthique des animaux (CICUAL) de l’INIMEC-CONICET-UNC (Résolution numéros 014/2017 B et 006/2017 A).
1. Cultures de neurones corticaux primaires chez le rat
- Anesthésier les rates gravides E18 Wistar dans une chambre de CO 2 avec un mélange de 80% de CO2/20%O2 pendant 60 s d’exposition puis sacrifier ensuite en disloquant les vertèbres cervicales.....
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Résultats
Ici, nous abordons la question de savoir si le silence de deux composants PERK en aval affecte la phase de transition de l’UPR dans un modèle de cellule de contrainte ER. Pour ce faire, nous faisons taire le gène CN-Aα ainsi que le gène CHOP par deux séquences shRNA spécifiques pour chacune (Tableau 1) en culture cellulaire de neurones primaires pendant 1 jour10. L’expression est analysée par Western blot (Figure 1 et
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Discussion
Nous décrivons un système expérimental qui permet la modulation moléculaire de la transition des phases de survie aux phases UPR apoptotiques dans un modèle cellulaire neuronal.
Pour une analyse correcte de l’atrophie des neurites, il est essentiel d’obtenir des cultures de neurones primaires avec de nombreux processus longs et très ramifiés 9,11. Cela facilite l’examen de l’extension du processus neuronal, ce qui permet de détecter le.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous remercions le Dr Gonzalo Quasollo pour son aide inestimable en imagerie et le Dr Andrea Pellegrini pour son soutien technique en culture cellulaire.
Cette recherche a été financée par des subventions de: l’Institut national de la santé, États-Unis (#RO1AG058778-01A1, accord de sous-attribution n ° 165148/165147 entre UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) et de l’Agence nationale de promotion scientifique et technologique de l’Agencia Nacional, Argentine (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anti-souris | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-A&alpha ; | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-&beta ;-actine | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinine | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 microscope à épifluorescence | Zeiss | ||
| B27 supplément | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Pinces à pointes fines ; style #5 | Dumont | ||
| Forceps style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW Anticorps secondaire | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 Anticorps secondaire | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW Anticorps secondaire | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW Anticorps secondaire | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| plasmide d’enveloppe lentivirale pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| plasmide d’emballage lentiviral psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| vecteur lentiviral pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Hémisulfate de lupeptine | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (réactif de transfection plasmidique) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Membrane nitrocellulosique 0.45 & micro; m | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey Système d’imagerie infrarouge | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| pénicilline-streptomycine | Technologies | #15140122 | |
| Pepstatine A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| fluorure de phénylméthylsulfonyle | Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Petits ciseaux à ressort pointus droits | scientifiques | ||
| fins T4 ADN Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsine-EDTA 0,25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Processeur de liquide à ultrasons Vibra-Cell (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps Système de purification d’ADN | Promega | #A1330 |
Références
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its act....
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Réimpressions et autorisations
