Article de méthode

Analyse de la différenciation et de la maturation de criblage à haute teneur de cultures de cellules souches neurales fœtales et adultes dérivées de cellules souches oligodendrocytes

DOI :

10.3791/61988

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10 mars 2021

1Health Science and Technologies Interdepartmental Center for Industrial Research (HST-ICIR), University of Bologna

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons la production de cultures mixtes d’astrocytes et de cellules précurseurs d’oligodendrocytes dérivées de cellules souches neurales fœtales ou adultes se différenciant en oligodendrocytes matures, et la modélisation in vitro de stimuli nocifs. Le couplage avec une technique de dépistage à haute teneur à base de cellules permet de construire un système de dépistage de médicaments fiable et robuste.

Résumé

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Le principal obstacle au développement de techniques de dépistage des médicaments pour évaluer l’efficacité des stratégies thérapeutiques dans les maladies complexes est de trouver un équilibre entre la simplification in vitro et la recréation de l’environnement in vivo complexe, ainsi que l’objectif principal, partagé par toutes les stratégies de dépistage, d’obtenir des données robustes et fiables, hautement prédictives pour la traduction in vivo.

Dans le domaine des maladies démyélinisantes, la majorité des stratégies de dépistage des médicaments sont basées sur des lignées cellulaires immortalisées ou des cultures pures de cellules précurseurs d’oligodendrocytes primaires (OPC) isolées provenant d’animaux nouveau-nés, ce qui entraîne de forts biais en raison de l’absence de différences liées à l’âge et de toute condition ou complexité pathologique réelle.

Nous montrons ici la mise en place d’un système in vitro visant à modéliser la différenciation physiologique / maturation des OPC dérivés de cellules souches neurales (NSC), facilement manipulables pour imiter les conditions pathologiques typiques des maladies démyélinisantes. De plus, la méthode comprend l’isolement des cerveaux fœtaux et adultes, donnant un système qui se différencie dynamiquement des OPC aux oligodendrocytes matures (OL) dans une co-culture spontanée qui comprend également des astrocytes. Ce modèle ressemble physiologiquement à la myélinisation médiée par les hormones thyroïdiennes et au processus de réparation de la myéline, permettant l’ajout d’interférents pathologiques qui modélisent les mécanismes de la maladie. Nous montrons comment imiter les deux principaux composants des maladies démyélinisantes (c’est-à-dire l’hypoxie / ischémie et l’inflammation), en recréant leur effet sur la myélinisation développementale et la réparation de la myéline adulte et en tenant compte de tous les composants cellulaires du système tout au long, tout en nous concentrant sur la différenciation des OPC.

Ce modèle mixte spontané, couplé à des technologies de criblage cellulaire à haute teneur, permet le développement d’un système de dépistage médicamenteux robuste et fiable pour les stratégies thérapeutiques visant à lutter contre les processus pathologiques impliqués dans la démyélinisation et à induire la remyélinisation.

Introduction

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Dans le système nerveux central (SNC), les cellules formant la myéline (oligodendrocytes, LAL) et leurs précurseurs (cellules précurseurs des oligodendrocytes, OPC) sont responsables de la myélinisation développementale, un processus qui se produit pendant les périodes péri- et postnatale, et du renouvellement et de la réparation de la myéline (remyélinisation) à l’âge adulte1. Ces cellules sont hautement spécialisées, interagissant anatomiquement et fonctionnellement avec tous les autres composants gliaux et neuronaux, ce qui en fait une partie fondamentale de la structure et de la fonction du SNC.

Les événements dé....

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Protocole

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Tous les protocoles animaux décrits dans le présent document ont été mis en œuvre conformément aux directives du Conseil de la Communauté européenne (86/609/CEE) et sont conformes aux lignes directrices publiées dans le Guide des NIH pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Solutions et réactifs

  1. Préparer le support standard: DMEM / F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg de pénicilline/streptomycine (1 % P/S); 1x B27; 1x N-2.
  2. Préparer le milieu de la neurosphère: ajouter 10 ng / mL bFGF; 10 ng/mL EGF au milieu standard.
  3. Préparer le milieu oligosphère/OPC : ajouter 10 ng/mL d....

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Résultats

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La durée de la première phase de la culture peut varier en fonction de la densité d’ensemencement et du fait que les sphères soient d’origine fœtale ou adulte. De plus, les oligosphères affichent une population réduite doublant par rapport aux neurosphères(Figure 1B). De plus, la production de sphères à partir de tissus adultes est plus lente et il peut prendre 2 à 3 semaines pour générer des oligosphères par rapport au fœtus, ce qui peut prendre 1 à 2 semaines, selon la densité d’ensemencem.......

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Discussion

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La nature complexe des processus de myélinisation/remyélinisation et des événements démyélinisants rend le développement de systèmes prédictifs in vitro extrêmement difficile. Les systèmes de dépistage de médicaments in vitro les plus largement utilisés sont principalement des lignées cellulaires humaines ou des cultures PRIMAIRES d’OL pur, avec une utilisation croissante de co-cultures plus complexes ou de systèmes organotypiques15. Même si de tels systèmes sont couplés à des technologies à haut .......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Soutenu par MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744), et Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.

Un merci spécial à la Fondation IRET pour l’accueil du travail expérimental.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques à 96 puits -NUNC267313
B27 non traité (100x)GIBCO17504-044
facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)GIBCOPHG0024
BSASigma-AldrichA2153
Facteur neurotrope ciliaire (CNTF)GIBCOPHC7015
DMEM sans glucoseGIBCOA14430-01
DMEM/F12 GlutaMAXGIBCO31331-028
DNaseSigma-AldrichD5025-150KU
EBSSGIBCO14155-048
Facteur de croissance épidermique (EGF)GIBCOPHG6045
HBSSGIBCO14170-088
HEPESGIBCO15630-056
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884
IFN-&gamma ;OrigeneTP721239
IL-17AOrigeneTP723199
IL-1&beta ;OrigeneTP723210
IL-6OrigeneTP723240
laminineGIBCO23017-051
N-acétyl-L-cystéineSigma-AldrichA9165
Supplément N2 (50x)GIBCO17502-048
Tampon de dissociation non enzymatiqueGIBCO13150-016
PBSGIBCO70011-036
Pénicilline / StreptomycineSigma-AldrichP4333
Facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA)GIBCOPHG0035
poly-D,L-ornitineSigma-AldrichP4957
TGF-&beta ; 1OrigèneTP720760
TNF-&alpha ;OrigeneTP723451
TriiodothyronineSigma-AldrichT2752-1G
TrypsineSigma-AldrichT1426
supplément

Références

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  1. Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340(2015).
  2. Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional ....

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Mots-clés

Isolation de cellules souches neuralescellules pr curseurs des oligodendrocytescerveau f tal et adultediff renciation des oligodendrocytesprivation d oxyg ne et de glucoseblocage m di par l inflammationessais de culture cellulaireanalyse de la my linisation et de la remy linisationculture mixte spontan e

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