Ce protocole décrit la conversion des fibroblastes cutanés en myoblastes et leur différenciation en myotubes. Les lignées cellulaires sont dérivées de patients atteints de troubles neuromusculaires et peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes pathologiques et tester des stratégies thérapeutiques.
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Article de méthode
Reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les thérapies pour les troubles neuromusculaires
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les investigations sur la pathophysiologie et les cibles thérapeutiques dans les dystrophies musculaires ont été entravées par la capacité proliférative limitée des myoblastes humains. Plusieurs modèles muraux ont été créés, mais ils ne représentent pas vraiment la physiopathologie humaine de la maladie ou ne sont pas représentatifs du large spectre de mutations trouvées chez l’homme. L’immortalisation des myoblastes primaires humains est une alternative à cette limitation; cependant, il est toujours dépendant des biopsies musculaires, qui sont invasives et pas facilement disponibles. En revanche, les biopsies cutanées sont plus faciles à obtenir et moins invasives pour les patients. Les fibroblastes dérivés de biopsies cutanées peuvent être immortalisés et transdifférenciés en myoblastes, fournissant une source de cellules avec un excellent potentiel myogénique. Ici, nous décrivons une méthode de reprogrammation rapide et directe du fibroblaste en lignée myogénique. Les fibroblastes sont transduced avec deux lentivirus : hTERT pour immortaliser la culture primaire et un MYODtet-inducible, qui sur l’addition de la doxycycline, induit la conversion des fibroblastes en myoblastes et puis myotubes mûrs, qui expriment des marqueurs tardifs de différenciation. Ce protocole de transdifferentiation rapide représente un outil puissant pour étudier les mécanismes pathologiques et étudier les biothérapies innovantes basées sur les gènes ou pharmacologiques pour les troubles neuromusculaires.
Introduction
Les modèles cellulaires obtenus directement à partir de tissus humains sont utiles pour modéliser de nombreux troubles génétiques humains, avec l’avantage d’avoir le contexte génomique original et, dans de nombreux cas, de reproduire les mêmes caractéristiques moléculaires et cellulaires observées chez les patients. Dans le domaine des troubles neuromusculaires, les biopsies musculaires ont été une grande source de myoblastes humains et ont contribué à l’élucidation des mécanismes pathologiques. En outre, ils sont un outil important pour les tests in vivo des médicaments et des thérapies géniques. D’une part, la dérivation des myoblastes à partir de fragments....
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Protocole
Toutes les expériences et biopsies ont été réalisées selon les règles éthiques des institutions concernées sous l’approbation de la Commission nationale d’examen institutionnel des hôpitaux pour enfants.
1. Initiation de la culture cutanée des fibroblastes
- Établissement de la culture des fibroblastes
- Aliquot 10 mL de milieu fibroblaste (Tableau 1) en tubes coniques de 15 mL. La biopsie de la peau doit être placée et transportée dans ce milieu. La biopsie peut être stockée à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit traitée, de préférence le même jour.
REMARQUE : Utilisez la biopsie cutanée dans les 24 à 36 heures po....
- Aliquot 10 mL de milieu fibroblaste (Tableau 1) en tubes coniques de 15 mL. La biopsie de la peau doit être placée et transportée dans ce milieu. La biopsie peut être stockée à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit traitée, de préférence le même jour.
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Résultats
Ce protocole montre comment établir des cultures fibroblastes dérivées de la peau humaine et les convertir en myoblastes, puis en myotubes différenciés. Ce type de lignée cellulaire est extrêmement utile pour l’étude des troubles neuromusculaires et les tests in vitro de thérapies potentielles.
Une représentation schématique de la conversion fibroblaste est indiquée dans la figure 1. La figure 2A montre un fragment de peau et.......
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Discussion
Pour obtenir des lignes cellulaires FM de bonne qualité, certaines étapes sont critiques. Plus tôt la biopsie de la peau est traitée, plus les chances sont grandes d’obtenir des fibroblastes sains. Le nombre de cultures de passage de fibroblastes est également important. Les cellules primaires ont une capacité proliférative limitée et après de nombreux passages, elles entrent dans la sénescence réplicative. Ainsi, il est préférable d’avoir un stock de fibroblastes à un faible nombre de passage et de transformer les cellu.......
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Déclarations de divulgation
Nationwide Children’s Hospital a autorisé le programme de saut exon 2 décrit ci-dessus à Audentes Therapeutics. K.M.F. et N.W. ont reçu des redevances à la suite de cette licence.
Remerciements
Nous tenons à remercier le Dr Vincent Mouly d’avoir partagé ses connaissances dans le passé sur le modèle. Ces travaux ont été soutenus par le National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., et R.B.W.),les National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., et N.W.). N.W. a reçu le soutien de la Bourse de l’Université d’État de l’Ohio/Nationwide Children’s Hospital Muscle Group et de la Fondation Philippe. Ce travail a également été soutenu par des fonds discrétionnaires internes et une partie du travail de saut exo....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Antenne de 100 mm | Corning | 430167 | |
| 0,25 % de trypsine-EDTA, rouge de phénol | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Plaque 12 puits | Corning | 3513 | |
| 20X Tampon de transfert | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acétate SDS tampon courant | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8 % Tris-Acétate | gel Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flasque | Corning | 430641U | |
| Antibiotique-Antimicotique 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosine chaîne lourde, anticorps anti-sarcomère | Etudes développementales Banque d’hybridomes | MF20 surnageant | Dilution 1:50 |
| Antioxydant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Dosage des protéines | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroforme | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Diméthyl sulfoxyde | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, Glycémie élevée, supplément GlutaMAX, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Chlorhydrate de doxycycline | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 amorces humaines | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5 | ' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'Dystrophine | |
| anticorps Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 | |
| Sérum fœtal bovin | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Chèvre anti-souris, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Cocktail inhibiteur de protéase 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hémocytomètre | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycine B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD chèvre anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 système de lames à chambre | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Réactif de transfection | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel Matrice membranaire GFR | Corning | 354230 | |
| Méthanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Conteneur de congélation Mr. Frosty Thermo | Fisher | 51000001 | |
| Membrane nitrocellulosique 0,45 & micro ; m | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Contrôle du sérum de chèvre normal | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Buffer de blocage pour Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Master mix PCR | Thermo Fisher | K0172 | |
| Inhibiteur de la phosphatase | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Coloration protéique totale pour la normalisation Western Blot | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrateur-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation | Promocell | C23061 | |
| Muscle squelettique Muscle Cell | Stem | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reactive | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Congélateur ultra basse température | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield support de montage anti-décoloration | Vector Labs | H1000 |
Références
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological....
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Réimpressions et autorisations
