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Article de méthode

Reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les thérapies pour les troubles neuromusculaires

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DOI :

10.3791/61991

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3 avril 2021

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1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la conversion des fibroblastes cutanés en myoblastes et leur différenciation en myotubes. Les lignées cellulaires sont dérivées de patients atteints de troubles neuromusculaires et peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes pathologiques et tester des stratégies thérapeutiques.

Résumé

Les investigations sur la pathophysiologie et les cibles thérapeutiques dans les dystrophies musculaires ont été entravées par la capacité proliférative limitée des myoblastes humains. Plusieurs modèles muraux ont été créés, mais ils ne représentent pas vraiment la physiopathologie humaine de la maladie ou ne sont pas représentatifs du large spectre de mutations trouvées chez l’homme. L’immortalisation des myoblastes primaires humains est une alternative à cette limitation; cependant, il est toujours dépendant des biopsies musculaires, qui sont invasives et pas facilement disponibles. En revanche, les biopsies cutanées sont plus faciles à obtenir et moins invasives pour les patients. Les fibroblastes dérivés de biopsies cutanées peuvent être immortalisés et transdifférenciés en myoblastes, fournissant une source de cellules avec un excellent potentiel myogénique. Ici, nous décrivons une méthode de reprogrammation rapide et directe du fibroblaste en lignée myogénique. Les fibroblastes sont transduced avec deux lentivirus : hTERT pour immortaliser la culture primaire et un MYODtet-inducible, qui sur l’addition de la doxycycline, induit la conversion des fibroblastes en myoblastes et puis myotubes mûrs, qui expriment des marqueurs tardifs de différenciation. Ce protocole de transdifferentiation rapide représente un outil puissant pour étudier les mécanismes pathologiques et étudier les biothérapies innovantes basées sur les gènes ou pharmacologiques pour les troubles neuromusculaires.

Introduction

Les modèles cellulaires obtenus directement à partir de tissus humains sont utiles pour modéliser de nombreux troubles génétiques humains, avec l’avantage d’avoir le contexte génomique original et, dans de nombreux cas, de reproduire les mêmes caractéristiques moléculaires et cellulaires observées chez les patients. Dans le domaine des troubles neuromusculaires, les biopsies musculaires ont été une grande source de myoblastes humains et ont contribué à l’élucidation des mécanismes pathologiques. En outre, ils sont un outil important pour les tests in vivo des médicaments et des thérapies géniques. D’une part, la dérivation des myoblastes à partir de fragments musculaires est relativement facile. D’autre part, la culture et le maintien des myoblastes primaires sont difficiles, en raison de leur taux de prolifération limité et de leur sénescence réplicative in vitro1. Une alternative pour ces limitations est d’immortaliser les myoblastes avec l’insertion de la télomérase humaine (hTERT) et / ou kinase dépendante de la cycline 4 (CDK4) gènes2,3, avec la préservation des caractéristiques musculaires squelettiques4. Néanmoins, l’obtention des myoblastes primaires dépend toujours de la biopsie de muscle, une procédure chirurgicale avec des inconvénients aux patients, qui, dans beaucoup de cas, ont leurs muscles dans la dégénérescence avancée. Ainsi, le muscle de ces patients est composé d’une proportion significative de tissu fibrotique et/ou adipeux et donne moins de cellules musculaires, nécessitant la purification des cellules précédemment à l’immortalisation.

Contrairement aux biopsies musculaires, les biopsies cutanées sont plus accessibles et moins nocives pour les patients. Les fibroblastes primaires peuvent être dérivés de fragments de peau in vitro. Bien que les fibroblastes ne soient pas principalement affectés par des mutations causant des désordres neuromusculaires, ils peuvent être transdifferentiated dans les myoblastes. Ceci peut être réalisé par l’insertion du gène Myod, un facteur de transcription réglementaire myogénique5. Dans ce manuscrit, nous décrivons le protocole d’obtention des myoblastes transdifferentiated, de l’établissement des cultures de fibroblastes à l’obtention des myotubes différenciés (un résumé représentatif de la méthode est représenté dans la figure 1).

L’essai préclinique des stratégies thérapeutiques dépend des modèles cellulaires et animaux portant des mutations semblables aux mutations trouvées dans les patients humains. Bien que le développement de modèles animaux soit devenu plus réalisable avec l’avancée des technologies d’édition génétique telles que CRISPR/Cas96,il reste difficile et coûteux. Ainsi, les lignées cellulaires dérivées du patient sont une option accessible pour avoir des modèles, couvrant le large spectre de mutations de maladies telles que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’obtention et la création de modèles cellulaires sont cruciales pour le développement de thérapies personnalisées pour de telles pathologies.

Parmi les thérapies personnalisées qui ont été étudiées, les stratégies de saut d’exon sont l’une des prometteuses pour différentes dystrophiesmusculaires 7,8. Cette stratégie consiste à produire une protéine plus courte mais fonctionnelle. Ceci est effectué en cachant la définition d’exon à l’épissage, excluant ainsi l’exon muté du messager final. Il s’agit d’une technologie très prometteuse qui a été approuvé par la FDA pour le DMD. Ainsi, nous décrivons également dans ce protocole, des méthodes pour transfecter des myoblastes avec deux technologies liées de saut d’exon différentes : oligonucleotides antisens (AON) et virus U7snRNA-adeno-associés (AAV). La transfection AON est un bon outil pour le criblage initial de plusieurs séquences conçues pour favoriser le saut d’exon9. Toutefois, l’activité des OPN est transitoire. Afin d’obtenir une expression soutenue des séquences antisens, nous avons également exploré de petits ARN nucléaires (ARNR) combinés à l’AAV, permettant la localisation et l’inclusion nucléaires dans les machines d’épissage10. U7 est un ARNR impliqué dans le traitement de l’ARNm histone qui peut être conçu pour lier les protéines qui vont le rediriger vers le spliceosome et livrer des séquences antisens11. L’utilisation de snARN U7 modifiés en combinaison avec des vecteurs AAV surmonte les limites des ANO, ce qui entraîne une expression continue des ANO et une meilleure transduction des tissus d’intérêt12. Nous utilisons des cellules dérivées de patients atteints de DMD pour ce protocole pour illustrer la stratégie d’exon-saut.

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Protocole

Toutes les expériences et biopsies ont été réalisées selon les règles éthiques des institutions concernées sous l’approbation de la Commission nationale d’examen institutionnel des hôpitaux pour enfants.

1. Initiation de la culture cutanée des fibroblastes

  1. Établissement de la culture des fibroblastes
    1. Aliquot 10 mL de milieu fibroblaste (Tableau 1) en tubes coniques de 15 mL. La biopsie de la peau doit être placée et transportée dans ce milieu. La biopsie peut être stockée à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit traitée, de préférence le même jour.
      REMARQUE : Utilisez la biopsie cutanée dans les 24 à 36 heures pour éviter la croissance potentielle de la contamination.
    2. Aspirez le média du tube et rincez la biopsie à l’aide de 10 mL 1X PBS (température ambiante) trois fois. Après le troisième lavage, laisser le PBS dans le tube.
    3. Verser le PBS et la peau sur un plat de 10 cm2.
    4. À l’aide de scalpels stériles, couper la biopsie en fragments aussi petits que possible.
    5. À l’aide d’une pipette, transférer un fragment de peau individuel et le déposer dans un plat propre de 10 cm2. Placer de 10 à 12 fragments par plat.
    6. Aspirer l’excès de PBS autour de chaque fragment. Veillez à ne pas aspirer le fragment.
    7. Couvrir partiellement la vaisselle avec le couvercle et laisser sécher les fragments de peau pendant 5-20 min. Ne laissez pas les fragments sécher excessivement.
    8. Une fois les fragments secs, inclinez le plat à 45 degrés et ajoutez lentement 12 mL de milieu fibroblaste au coin. Abaissez le plat, en distribuant soigneusement les supports afin que les fragments ne se soulèvent pas par les médias.
    9. Placer les plats dans l’incubateur (37 °C, 5 % de CO2). Remplacez les médias en 5-7 jours, et une fois par semaine après.
    10. Observez les fibroblastes qui sortent du fragment (figure 2) et, une fois confluents, traversez les cellules en flacons de 75 cm2. Retirer le milieu, rincer les cellules avec PBS et ajouter 1 mL 0,25 % trypsine. Incuber à 37 °C pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que toutes les cellules soient levées. Ajouter 10 mL de milieu de croissance fibroblaste pour inhiber la trypsine et transférer les cellules dans un nouveau flacon.
      REMARQUE : Pour la nomenclature du numéro de passage, P1 est établi lorsque les premiers fibroblastes qui ont émergé de la biopsie cutanée sont transférés dans un nouveau flacon pour la prolifération.
  2. Cryopréservation des lignées fibroblastes primaires
    1. Une fois que le flacon de 75 cm2 est confluent, rincez-le avec 10 mL 1X PBS et aspirez PBS.
    2. Ajouter 3 mL de trypsine de 0,25 % à la surface de la cellule. Placer le flacon dans l’incubateur pendant 5 min. Vérifiez les flacons au microscope pour voir si les cellules sont levées. Si ce n’est pas le cas, remettre le flacon dans l’incubateur pendant 5 minutes supplémentaires.
    3. Une fois que les cellules sont détachées, ajouter 7 mL de médias fibroblastes à la fiole et pipette de haut en bas pour résusquer les cellules. Recueillir les cellules dans un tube conique de 50 mL.
    4. Préparer 100 μL aliquot de trypan bleu, et retirer 100 μL de l’échantillon en cours de cryopréservation, mélanger avec le bleu trypan. Charger le mélange sur l’hémocytomètre pour compter. Comptez les cellules dans quatre champs différents de l’hémocytomètre au microscope. Pour calculer le nombre total de cellules, utilisez la formule : (cellules comptées/100) * volume de culture.
    5. Faire tourner les tubes coniques à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante ou 4 °C.
    6. Aspirez le milieu et réutilisez les cellules dans le volume adéquat du milieu de congélation : 1 mL par 1 million de cellules/flacons. Pipette de haut en bas pour homogénéiser et distribuer 1 mL à chaque cryovial étiqueté.
    7. Placez les flacons dans la boîte de congélation et laissez les flacons geler à un taux de 1 °C/min au congélateur à -80 °C pendant la nuit.
    8. Le lendemain, transférez les flacons dans un réservoir d’azote liquide ou un congélateur à -150 °C.

2. Création de la ligne cellulaire FibroMyoblasts (FM)

  1. Semer des fibroblastes primaires à environ 30 % de la confluence dans deux puits d’une plaque de 12 puits (2 x10 4 cellules/puits) afin d’avoir environ 50 % de la confluence le lendemain.
  2. Pour la transduction lentiviral, ajouter 2 à 5 x 109 vg (particules virales du génome) du lentivirus hTERT-puromycine dans 400 μL de milieu fibroblaste. Au deuxième puits, ajouter seulement 400 μL de milieu fibroblaste. Ajouter 1 mL de médias le lendemain.
    REMARQUE : Des plasmides pour la production de lentivirus ont été obtenus du groupe qui a publié l’article Chaouch et coll.,2009. Ils sont également décrits individuellement dans Aure et coll.,200713 pour le plasmide hTERT et Barde et coll.,200614 pour le système Tet-on utilisé pour la conception du plasmide MyoD. Ils ont été obtenus grâce à un accord de transfert de matériel avec Genethon, France (s’il vous plaît contacter le Dr Vincent Mouly pour obtenir ces plasmides - vincent.mouly@upmc.fr). En bref, le hTERT se compose de la variante hTERT 1 entraînée par un promoteur CMV tandis que la puromycine est entraînée par un promoteur PGK. Le plasmide MyoD contient une variante MyoD 1 pilotée par un promoteur CMV sous le contrôle du répresseur rtTA2. Ce plasmide contient également la sélection d’hygromycine exprimée grâce au promoteur SV40.
    Les lentivirus ont été produits à l’aide d’une production régulière de lentiviral (voir protocole Wang et McManus JoVe15). En bref, MDL-helper, Rev-Helper, SVS-G-helper ont été transfectés par précipitation de chlorure de calcium également des plasmides de hTERT ou de MyoD. Après 48 h, le supernatant a été recueilli, puis pendant trois jours supplémentaires. Tous les supernatants étaient alors concentrés par ultracentrifugation. La pastille a ensuite été réutilisée dans le tampon Tris-HCL+NaCl+EDTA. L’estimation de titer a été évaluée par l’essai standard de qPCR de lentivirus.
  3. Un ou deux jours plus tard, transférer les cellules dans une plaque de 6 puits et les cultiver jusqu’à atteindre 60-70% confluent.
  4. Compléter le milieu fibroblaste avec 1 μg/mL de puromycine et ajouter 2 mL à chaque puits.
  5. Gardez les cellules sous sélection jusqu’à ce que toutes les cellules du puits de contrôle soient mortes (jusqu’à 12 jours), changeant les médias tous les 2-3 jours. Passer les cellules de l’assiette de 6 puits dans deux plats de 10 cm2 pour une prolifération ultérieure.
  6. Congeler les flacons de fibroblastes après sélection. Étiquette comme F(hTer).
  7. Graines hTERT exprimant fibroblastes (F(hTer)) à environ 30% confluent dans le milieu fibroblaste, dans deux puits d’une plaque de 12 puits, d’avoir environ 50% de confluence le lendemain.
  8. Pour la transduction du lentivirus, mélanger 2 à 5 x 109 vg de lentivirus MyoD-hygromycinB dans 400 μl de milieu fibroblaste et ajouter aux puits respectifs; au troisième puits ajouter 400 μl milieu fibroblaste. Ajouter 1 mL de milieu le lendemain.
  9. Un ou deux jours plus tard transférer les cellules dans une plaque de 6 puits et se développer jusqu’à 60-70% confluent.
  10. Compléter le milieu de croissance fibroblaste avec l’hygromycine B (400 μg/mL) et ajouter 2 mL à chaque puits.
  11. Gardez les cellules sous sélection jusqu’à ce que toutes les cellules du puits de contrôle soient mortes (jusqu’à 12 jours), changeant les médias tous les 2-3 jours.
  12. Congeler les flacons de fibroblastes après sélection. Étiquette comme FM suivie du numéro/nom d’identification cellulaire.

3. Protocole de transdifferentiation

  1. Graines transduced FM sur 10 cm2 plats avec 30-40% confluent. Dans une plaque de 12 puits, graine 6 x 104 cellules (cela dépend de la lignée cellulaire individuelle).
    REMARQUE : Pour l’immunostaining, les cellules de graine sur des couvertures en verre ou des glissières de chambre enduites de Matrigel. Diluer matrigel à 1:10 dans le milieu DMEM, ajouter un volume suffisant pour couvrir la surface, et laisser les diapositives s’asseoir à température ambiante pendant une heure. Aspirez juste avant d’ensemencer les cellules.
  2. Pour l’induction des myoblastes, lorsque les fibroblastes ont atteint 70% de confluence (Figure 3A), rincer la surface cellulaire avec PBS et ajouter des supports myoblastes frais complétés par de la doxycycline fraîche de 8 μg/mL.
    REMARQUE : Le succès de la différenciation est compromis au-delà de 80 % de confluence.
  3. Après deux à trois jours plus tard, les cellules sont confluentes à 90-95% et leur morphologie aura changé (Figure 3B). Rincez la surface cellulaire avec du PBS et ajoutez des supports de différenciation frais complétés par de la doxycycline fraîche de 8 μg/mL.
  4. Continuez à changer de média tous les 2-3 jours sans passer jusqu’à ce que les myotubes soient établis (confirmer par morphologie) (Figure 3C).
  5. Sept à dix jours après le début de la différenciation du myotube, les cellules doivent être complètement différenciées et peuvent commencer à se détacher ou à mourir. Avant que cela ne se produise, récoltez des myotubes pour une analyse plus approfondie.
    REMARQUE : Le cours du temps de la formation de myotube dépend de la ligne cellulaire. Les mutations dans les protéines liées aux muscles peuvent interférer dans le potentiel myogénique. Lorsque les myotubes commencent à apparaître lumineux et à regarder en blanc les bordures, c’est un signal qu’ils commencent à détacher (Figure 4).
  6. Pour récolter les myotubes, collecter des supports et les transférer dans un tube conique de 50 mL. Le milieu peut contenir des myotubes qui se sont détachés.
  7. Rincer les myotubes avec 5 mL PBS et transférer PBS sur le tube de 50 mL.
  8. Ajouter 3 mL de trypsine de 0,25 % à la surface de la cellule. Placer le plat dans l’incubateur pendant 5 min. Vérifiez le plat au microscope pour voir si les cellules sont levées. Si ce n’est pas le cas, placez-le dans l’incubateur pendant 5 minutes supplémentaires.
  9. Une fois que les cellules sont détachées, ajouter 7 mL de médias fibroblastes au plat et pipette de haut en bas pour résuspendre les cellules. Recueillir les cellules au tube conique de 50 mL.
  10. Centrifugeuse à 1 200 x g pendant 7 min à 4 °C.
  11. Aspirez soigneusement le liquide, sans déranger la pastille. Conserver les granulés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités plus avant.

4. Immunostaining des myotubes différenciés

REMARQUE : Pour l’immunostaining, cultivez les cellules dans des couvertures en verre ou des glissières de chambre comme indiqué ci-dessus.

  1. Une fois que les myotubes sont entièrement différenciés, aspirez les médias et rincez soigneusement les diapositives avec PBS. Aspirez PBS hors tension.
  2. Ajouter 4 % de PFA frais (500 μL par puits d’une assiette de 12 puits) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Aspirez PFA hors tension.
  3. Rincer à l’aide d’un PBS de 1 mL.
  4. Incuber avec 0,2 M de glycine à température ambiante, pendant 10 min. Aspirer la glycine.
  5. Perméabilize avec PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL/puits d’une plaque de 12 puits), pendant 10 min avec agitation douce.
  6. Bloc avec 300 μL/puits de solution de blocage, pendant 10 min avec agitation douce.
  7. Incuber avec un anticorps primaire dilué 1:50 dans 300 μL de solution de blocage, pendant 2 heures à température ambiante, avec des secousses douces.
  8. Rincer trois fois avec 1 mL/puits de PBS pendant 5 min, en secouant doucement.
  9. Incuber avec des anticorps secondaires dilués 1:500 dans 300 μL de solution de blocage, pendant 1 heure, à température ambiante, avec des secousses douces. Couvrir la plaque de papier d’aluminium.
  10. Rincer trois fois avec 1 mL/puits de PBS pendant 5 min, en secouant doucement.
  11. Incuber avec dapi dilué dans PBS pendant 10 minutes. Rincer trois fois avec 1 mL/puits de PBS.
  12. Ajouter une goutte de milieu de montage à une glissade en verre. Retirez le coverslip avec des forceps et placez-le face vers le bas sur la chute du milieu de montage.
  13. Inverser la glissade sur une serviette en papier et presser doucement pour enlever les bulles et l’excès de support de montage.
  14. Sceller les toboggans avec du vernis à ongles et les conserver à 4 °C jusqu’à l’imagerie.

5. Transfection oligonucléotide antisens

REMARQUE : Le protocole ci-dessous est pour la transfection d’une plaque de 6 puits. Ajustez les volumes en conséquence pour les plaques plus petites ou plus grandes. La transfection se fait en myoblastes 100% confluents lorsque les cellules sont prêtes pour l’étape de différenciation.

  1. Aspirer le média de croissance myoblaste et rincer les cellules avec 1 mL PBS.
  2. Ajouter 500 μL/puits de supports OptiMEM et incuber à 37 °C pendant 1 heure.
  3. Diluer l’oligonucléotide antisens (AON) dans 100 μL d’OptiMEM à la concentration finale désirée (c.-à-d. 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Incuber à température ambiante pendant 5 min.
    REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour les AONs 2'omethyl-phosphorothioate.
  4. Mélanger la lipofectamine avec OptiMEM (volume final de 100 μL) pour donner un rapport final de 1:1 (μg ADN: lipofectamine μL). Incuber à température ambiante pendant 5 min.
  5. Mélanger la lipofectamine diluée avec l’AON dilué. Mélanger délicatement au pipetage et incuber pendant 20 min à température ambiante pour permettre une formation complexe. Évitez les bulles d’air.
  6. Ajouter 200 μL de lipofectamine et mélanger aon aux puits respectifs. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 °C, 5 % de CO2.
  7. Le lendemain, retirer le mélange de transfection et ajouter 2 mL de différents supports de différenciation chaude complétés par de la doxycycline.
  8. Recueillir les cellules au moins trois jours plus tard pour l’extraction de l’ARN ou de sept à 21 jours en cas d’analyse des protéines.
    REMARQUE : Les jours de différenciation nécessaires pour détecter l’ARN et/ou l’expression des protéines peuvent varier en conséquence selon le gène d’intérêt ou la lignée cellulaire. Dans le cas du DMD,il est possible de détecter son ARNm dans les trois jours. La détection des protéines de dystrophine nécessite au moins sept jours. Cela varie en fonction de la lignée cellulaire. Des concentrations élevées d’AON et de réaccélément de transfection peuvent avoir un impact sur la transdifferentiation.

6. Transduction AAV1-U7

REMARQUE : Ce protocole a été optimisé pour les plaques de 6 puits. Ajuster les volumes proportionnellement à la surface de la culture. La transduction se fait en myoblastes 100% confluents lorsque les cellules sont prêtes pour l’étape de différenciation. AAV1 est le sérotype AAV avec la meilleure capacité de transduction des myoblastes cultivés.

  1. Aspirer le milieu de croissance du myoblaste et rincer les cellules avec 1 mL PBS.
  2. Diluer 0,5-1 x 1011 particules virales d’AAV1-U7 dans 700 μL de médias de différenciation chaude complétés par de la doxycycline.
    REMARQUE : Nous utilisons qPCR pour déterminer la concentration virale. La quantité de virus à utiliser peut varier en fonction de la méthode de quantification et doit être déterminée précédemment à l’aide d’un essai de journaliste.
  3. Ajouter le mélange viral au puits en le laissant tomber de façon homogène.
  4. Le lendemain, ajouter 1,3 mL de média de différenciation chaude complété par de la doxycycline.
  5. Recueillir les cellules au moins trois jours plus tard pour l’extraction de l’ARN ou sept à 21 jours en cas d’analyse des protéines.

7. Extraction d’ARN

REMARQUE : Tout le matériel utilisé au cours de cette étape doit être exempt de RNase.

  1. Ajouter 500 μL de TRIzol par granulé et pipet de haut en bas plusieurs fois pour s’assurer que les cellules sont homogènement lysées.
  2. Transférer la cellule lysate dans un tube de 1,5 mL et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  3. Ajouter 100 μL de chloroforme et agiter manuellement pendant 15 s. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  4. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Recueillir la phase aqueuse (supérieure) et la transférer dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  5. Pour 1 volume de la phase aqueuse, ajouter 1 volume d’éthanol à 100% et mélanger par pipetting.
    REMARQUE : Nous recommandons la purification et la concentration des colonnes.
  6. Transférer l’échantillon dans une colonne Zymo-Spin IC dans un tube de collecte et une centrifugeuse à 12 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux à travers.
  7. Pour la digestion dans la colonne DNase I, pré-laver la colonne avec 400 μL ARN Wash Buffer. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux à travers.
  8. Préparer 40 μL de mélange de réaction DNase par échantillon. Mélanger 5 μL DNase I avec 35 tampon de digestion de l’ADN de μL.
  9. Ajouter le mélange directement à la matrice de colonne. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
  10. Ajouter 400 tampons de préparation d’ARN μL à la colonne et centrifugeuse à 12 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux à travers.
  11. Ajouter un tampon de lavage d’ARN de 700 μL à la colonne et une centrifugeuse à 12 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux à travers.
  12. Ajouter 400 tampons de lavage d’ARN μL à la colonne et à la centrifugeuse à 12 000 x g pendant 2 min pour assurer l’enlèvement complet du tampon de lavage. Transférez soigneusement la colonne dans un tube de 1,5 mL sans RNase.
  13. Ajouter 15 μL d’eau sans nucléase directement à la matrice de colonne. Incuber pendant 5 min et centrifugeuse à 12 000 x g pendant 1 minute.
    REMARQUE : Recueillir l’ARN éluqué et l’appliquer à nouveau à la colonne pour augmenter le rendement. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 1 minute.
  14. Placez des échantillons sur la glace et quantifiez les échantillons dans un Nanodrop.
  15. Conserver les échantillons à -80 °C.

8. Analyse RT-PCR

REMARQUE: Dans cette étape, nous présentons une suggestion de réaignants pour détecter l’expression de l’ARNm dystrophine, mais il peut être facilement adapté à d’autres reagents de choix.

  1. Transcription inversée
    1. Décongeler tous les reagents et les garder sur la glace.
    2. Préparer un mélange avec 4 μL de tampon de réaction 5x, 2 μL de mélange dNTP (10 mM), 1 μL d’inhibiteur ribolock rnase et 1 μL de RevertAid RT.
    3. Mélanger délicatement le tube et la centrifugeuse brièvement.
    4. Dans les tubes PCR de 0,2 mL, ajouter le volume adéquat d’ARN afin d’avoir 1 μg par réaction. Ajouter l’eau sans nucléase q.s.p 12 μL. Inclure un tube sans transcriptase inverse comme un contrôle négatif et un tube avec de l’eau sans nucléase au lieu de l’ARN.
    5. Distribuer 8 μL de mélange de réaction par tube. Le volume total est de 20 μL.
    6. Placer les tubes dans un thermocyclre et incuber pendant 5 min à 25 °C, puis 60 min à 42 °C. Arrêter la réaction en chauffant à 70 °C pendant 5 minutes.
    7. Placez les tubes sur la glace ou à -20 °C pour un stockage plus long.
  2. PCR (PCR)
    REMARQUE : Concevoir des amorces aux jonctions d’exons de préférence.
    1. Réaccents vortex et tourner vers le bas avant utilisation.
    2. Préparer un mélange principal à l’aide d’amorce avant de 0,5 μL (25 μM), d’une amorce inversée de 0,5 μL (25 μM), d’un mélange principal 2x PCR de 12,5 μL et de 8,5 μL d’eau sans nucléase par échantillon.
    3. Aliquot 22 μL de master mix dans un tube pour chaque échantillon.
    4. Ajouter 3 μL de cDNA (150 ng) à son tube PCR respectif. Ajouter 3 μL d’eau sans nucléase au tube de commande négatif PCR.
    5. Vortex et tourner vers le bas les tubes PCR.
    6. Incuber les tubes dans un thermocycleur à 95 °C pendant 3 min, 95 °C pendant 30 s(Tm-5) °C pendant 30 s, 72 °C pour (1 min/kb) 34 fois, 72 °C pendant 5 min.
      REMARQUE : La température optimale d’annealage peut être déterminée empiriquement. Pour le mélange maître suggéré, soustrayez 5 °C de la température de fusion de l’amorce.
    7. Chargez 12 μL de la réaction PCR sur un gel d’agarose et congelez les échantillons à -20 °C.

9. Détection de l’expression de la dystrophine par blotting occidental

REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour la dystrophine, une protéine membranaire importante. Des conditions spécifiques peuvent être nécessaires pour différentes protéines.

  1. Extraction de protéines
    1. Après 7-21 jours de différenciation, recueillir des cellules avec 5 mL de PBS avec 100 μL 0,5 M EDTA, et 50 inhibiteurs de protéase μL. Incuber à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent. Centrifugeuse à 1 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Casser le gel de la pastille en trempant le tube dans de l’azote liquide. Conserver la pastille à -80 °C ou passer à l’étape de la lyse.
    2. Préparez le tampon de lyse en ajoutant 1 % de digitonine, 1 % d’inhibiteur de la protéase, 10 % d’inhibiteur de la phosphatase et un tampon de base au volume total (60 μL par granule cellulaire).
    3. Ajouter 60 μL de tampon de lyse à la pastille cellulaire, sur la glace. Sonicate pour 5 s. Laisser reposer sur la glace pendant 8 s. Répétez la sonication et reposez-vous deux fois.
    4. Incuber des échantillons sur la glace pendant 30 min.
    5. Centrifugeuse à 14 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
    6. Transférer le supernatant dans des tubes propres.
    7. Quantifier les échantillons à l’acide bicinchoninique (BCA), en suivant les instructions du fabricant.
    8. Mélanger la solution protéique avec le volume approprié de tampon Laemmli. Faire des aliquots de 100 μg. Si nécessaire, réglez le volume à 25 μl avec tampon de lyse de base. Conserver les échantillons à -80 °C.
  2. Ballonnement occidental
    1. Décongeler les échantillons sur la glace.
    2. Dénominatez les échantillons à 100 °C pendant 5 min, puis refroidissez-les dans la glace, tournez vers le bas.
    3. Diluer le tampon de fonctionnement 20X Tris-acétate SDS en 200 mL dH2O et ajouter 500 μL antioxydant.
    4. Préparer le gel polyacrylamide tris-acétate à 3-8 % en enlevant le peigne et le rinçage avec le dH2O. Assembler le gel dans l’appareil électrophoresis. Remplissez la chambre intérieure d’un tampon en cours d’exécution.
    5. Chargez 5 μL d’échelle protéique et 25 μL d’échantillon dans le gel. Remplissez la chambre extérieure d’un tampon en cours d’exécution.
    6. Courir à 80 V pendant 1 h à 4 °C. Puis, à 120 V pour 2 h à 4 °C.
    7. Préparez 3 L de tampon de transfert 1X avec 150 mL de méthanol 20X, 150 mL de tampon de transfert 20X et 2 700 mL de dH2O. Refroidissez-le jusqu’à 4 °C.
    8. Couper 4 morceaux de papier filtre et un morceau de membrane nitrocellulose. Faire tremper le filtre à papier et la membrane dans un plateau avec tampon de transfert.
    9. Retirer délicatement le gel du boîtier et l’assembler dans l’appareil de transfert avec du papier filtre, de la membrane et des éponges. Le gel est placé sur le côté négatif et la membrane sur le côté positif.
    10. Exécuter le transfert à 300 mA, en remuant, à 4 °C, pendant la nuit.
    11. Bloquez la membrane dans 10 mL de tampon de blocage pendant 1 h avec agitation douce, à température ambiante.
    12. Préparez la solution primaire d’anticorps avec 10 mL de tampon de blocage et 50 μL d’anticorps de dystrophine (1:200).
    13. Jetez le tampon de blocage et ajoutez la solution d’anticorps primaire. Incuber avec une agitation douce pendant au moins 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
    14. Rincer la membrane trois fois avec 0,1% de Tween PBS, pendant 5 min avec une agitation douce.
    15. Préparez une solution d’anticorps secondaire à l’aide de 10 mL de solution de blocage, de 2 μL d’anticorps anti lapin (1:5000) et de 20 μL de 0,2 % de tween.
    16. Ajouter la solution d’anticorps secondaire à la membrane. Incuber pendant 1 h avec une agitation douce, recouverte de papier d’aluminium pour se protéger de la lumière.
    17. Jetez la solution d’anticorps et rincez la membrane 3 fois avec 0,1% de Tween PBS, pendant 5 min avec agitation douce, à l’abri de la lumière.
    18. Exposition et image de la membrane sur un appareil d’imagerie.
    19. Tacher la membrane pour la protéine totale avec revert 700 tache totale de protéine, suivant des instructions de fabricant.
      REMARQUE : La détection de la dystrophine par ballonnement occidental dépend de l’âge/mutation du patient et de la capacité de la cellule à fusionner et à rester attachée suffisamment de temps pour accumuler suffisamment de dystrophine.

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Résultats

Ce protocole montre comment établir des cultures fibroblastes dérivées de la peau humaine et les convertir en myoblastes, puis en myotubes différenciés. Ce type de lignée cellulaire est extrêmement utile pour l’étude des troubles neuromusculaires et les tests in vitro de thérapies potentielles.

Une représentation schématique de la conversion fibroblaste est indiquée dans la figure 1. La figure 2A montre un fragment de peau et...

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Discussion

Pour obtenir des lignes cellulaires FM de bonne qualité, certaines étapes sont critiques. Plus tôt la biopsie de la peau est traitée, plus les chances sont grandes d’obtenir des fibroblastes sains. Le nombre de cultures de passage de fibroblastes est également important. Les cellules primaires ont une capacité proliférative limitée et après de nombreux passages, elles entrent dans la sénescence réplicative. Ainsi, il est préférable d’avoir un stock de fibroblastes à un faible nombre de passage et de transformer les cellu...

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Déclarations de divulgation

Nationwide Children’s Hospital a autorisé le programme de saut exon 2 décrit ci-dessus à Audentes Therapeutics. K.M.F. et N.W. ont reçu des redevances à la suite de cette licence.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Vincent Mouly d’avoir partagé ses connaissances dans le passé sur le modèle. Ces travaux ont été soutenus par le National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., et R.B.W.),les National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., et N.W.). N.W. a reçu le soutien de la Bourse de l’Université d’État de l’Ohio/Nationwide Children’s Hospital Muscle Group et de la Fondation Philippe. Ce travail a également été soutenu par des fonds discrétionnaires internes et une partie du travail de saut exon 2 a également été soutenue par CureDuchenne (K.M.F.) et l’Association Française Contre Les Myopathies. Numéro de la CISR : CISR #: IRB10-00358/ CR00005138 et IBCSC#: IBS00000123.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Antenne de 100 mmCorning430167
0,25 % de trypsine-EDTA, rouge de phénolThermo Fisher2500056
10X Saline tamponnée au phosphate (PBS)Fisher ScientificBP3994
Plaque 12 puitsCorning3513
20X Tampon de transfertThermo FisherNP00061
20X Tris-acétate SDS tampon courantThermo FisherLA0041
3-8 % Tris-Acétategel Thermo FisherEA0378BOX
75 cm2 flasqueCorning430641U
Antibiotique-Antimicotique 100XThermo Fisher15240062
Anti-myosine chaîne lourde, anticorps anti-sarcomèreEtudes développementales Banque d’hybridomesMF20 surnageantDilution 1:50
AntioxydantThermo FisherNP0005
BCA Dosage des protéinesThermo Fisher23227
ChloroformeSigma-AldrichC2432
DAPIThermo FisherD3571Dilution 1:1000
DigitoninMillipore Sigma300410250MG
Diméthyl sulfoxydeSigma-AldrichD2438
DMEM, Glycémie élevée, supplément GlutaMAX, PyruvateThermo Fisher10569044
DNAse I set (250U)Zymo Research CorporationE1010
Chlorhydrate de doxycyclineFisher ScientificBP2653-5
Dup2 amorces humainesFw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG
TTTCTC 3'Rv_5		' CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'Dystrophine
anticorps Abcamab15277Dilution 1:200
Sérum fœtal bovinThermo Fisher16000
GlycineSigma-AldrichG8898
Chèvre anti-souris, Alexa Fluor 488Thermo FisherA11001Dilution 1:1000
Halt Cocktail inhibiteur de protéase 100XThermo Fisher78430
HémocytomètreHausser Scientific3100
Hygromycine BThermo Fisher10687010
IRDye 680RD chèvre anti-Rabbit IgG (H+L)Li-Cor926-68071Dilution 1:5000
Lab-Tek II CC2 système de lames à chambreThermo Fisher15852
LaemmliBioworld105700201
Lipofectamine 3000 Réactif de transfectionThermo FisherL3000008
Matrigel Matrice membranaire GFRCorning354230
MéthanolFisher ScientificA412P-4
Conteneur de congélation Mr. Frosty ThermoFisher51000001
Membrane nitrocellulosique 0,45 & micro ; mGE Healthcare Life Sciences10600002
Contrôle du sérum de chèvre normalThermo Fisher10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)Li-Cor927-40003Buffer de blocage pour Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher11058021
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Master mix PCRThermo FisherK0172
Inhibiteur de la phosphataseThermo FisherA32957
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio Rad1610374
PuromycinThermo FisherA1113803
Revert 700 Coloration protéique totale pour la normalisation Western BlotLi-Cor926-11021
RevertAid kitThermo FisherK1691
RNA Clean & Concentrateur-25Zymo Research CorporationR1018
ScalpelsAspen Surgical372611
Skeletal Muscle Cell DifferentiationPromocellC23061
Muscle squelettique Muscle CellStemC23060
Triton X-100Acros Organics215682500
TRIzol reactiveThermo Fisher15596026
Tween 20Fisher ScientificBP337500
Congélateur ultra basse températureThermo Scientific7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
Vectashield support de montage anti-décolorationVector LabsH1000
medium

Références

  1. Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
  2. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
  3. Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
  4. Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).
  5. Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
  6. Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
  7. Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
  8. Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).
  9. Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
  10. De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
  11. Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
  12. Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
  13. Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
  14. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  15. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).
  16. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).

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