Utilisation de Grafix pour la détection des interacteurs transitoires des sous-complexes de Spliceosomes de Saccharomyces cerevisiae

Résumé

Ici, nous décrivons l’utilisation de Grafix (Gradient Fixation), une centrifugation de gradient de glycérol en présence d’un réticulateur, pour identifier les interactions entre les facteurs d’épissage qui se lient transitoirement au complexe d’épissage.

Résumé

L’épissage pré-ARNm est un processus très dynamique qui implique de nombreux réarrangements moléculaires des sous-complexes spliceosomes lors de l’assemblage, du traitement de l’ARN et de la libération des composants complexes. La centrifugation du gradient de glycérol a été utilisée pour la séparation de complexes protéiques ou RNP (RiboNucleoProtein) pour des études fonctionnelles et structurelles. Ici, nous décrivons l’utilisation de Grafix (Gradient Fixation), qui a d’abord été développé pour purifier et stabiliser les complexes macromoléculaires pour la cryo-microscopie électronique à particule unique, afin d’identifier les interactions entre les facteurs d’épissage qui se lient transitoirement au complexe spliceosome. Cette méthode est basée sur la centrifugation d’échantillons en une concentration croissante d’un réactif de fixation pour stabiliser les complexes. Après centrifugation d’extraits totaux de levure chargés sur des gradients de glycérol, les fractions récupérées sont analysées par transfert de points pour l’identification des sous-complexes de spliceosomes et la détermination de la présence de facteurs d’épissage individuels.

Introduction

L’épissage est un processus très dynamique qui nécessite la liaison et la libération d’une multitude de facteurs de manière coordonnée. Ces facteurs d’épissage comprennent les protéines de liaison à l’ARN, les ATPases, les hélicases, les protéines kinases et les phosphatases, les ligas d’ubiquitine, entre autres^1,2,3; et pour permettre aux réarrangements moléculaires d’avoir lieu, certains de ces facteurs se lient très transitoirement aux sous-complexes spliceosomes, ce qui rend l’isolement et l’identification de ces complexes intermédiaires RNP très difficiles.

Ici, nous avons utilisé la méthode Grafix^4,5 pour stabiliser l’interaction du facteur d’épissage de levure Cwc24 avec le complexe^d’acte B⁶ afin de permettre l’identification d’autres facteurs liés concomitamment à ce sous-complexe et de déterminer si l’ubiquitine ligase Prp19 joue un rôle dans la liaison ou la libération de Cwc24 au complexe Nineteen (NTC) et à l’extrémité 5' de l’intron avant l’activation et la première réaction de transestérification prend lieu. L’avantage d’exposer les macromolécules à une concentration croissante du réticulant le long du gradient de glycérol est qu’il évite les réticulations inter-complexes^4,5, et donc, la formation d’agrégats.

Cette méthode a été utilisée en complément de la coimmunoprécipitation des protéines et des essais de traction vers le bas, qui, bien que permettant l’isolement de grands complexes, peuvent ne pas être fiables pour maintenir les interactions transitoires au sein de grands complexes dynamiques^7,8. L’utilisation de réactifs de fixation dans le gradient de glycérol stabilise la liaison de ces facteurs, permettant la confirmation des interactions de protéines spécifiques avec des sous-complexes d’épissage. Parce que le réticulateur choisi était chimiquement irréversible, les protéines présentes dans les fractions récupérées ont été analysées par transfert de points après la centrifugation du gradient.

Protocole

1. Préparation de l’extrait total de levure

1. Cultiver les cellules de levure exprimant l’un des facteurs d’épissage fusionnés à la balise TAP⁹ dans un milieu YNB-glu de 1 L (base d’azote de levure complétée par 2% m/v de glucose) avec les acides aminés ou les bases nucléiques appropriés, dans ce cas, l’adénine (20 μg/mL), la leucine (30 μg/mL), le tryptophane (30 μg/mL), jusqu’à OD₆₀₀ = 1,0.
2. Prélever les cellules de la culture 1 L en centrifugant dans trois flacons de centrifugeuse de 500 mL à 17 000 x g pendant 10 min à 4 °C et laver deux fois avec 10 mL d’eau stérile froide.
3. Resuspendez les cellules de levure collectées dans 1/10 du volume cellulaire du tampon froid A (10 mmol L^-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L^-1 MgCl_2,50 mmol L^-1 KCl, 5% v / v glycérol, 0,5 mmol L^-1 DTT, cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA).
4. Congeler de petites gouttes de suspension cellulaire dans de l’azote liquide. Les petites gouttes peuvent être obtenues en pipetant la solution cellulaire remise enssantée et en laissant tomber 50 μL directement dans l’azote liquide.
   ATTENTION : L’azote liquide peut causer des blessures au contact de la peau ou des yeux. Manipuler à l’aide d’un équipement de sécurité approprié.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les gouttes congelées de suspension cellulaire peuvent être conservées à -80 °C.
5. Préparer les lysates des cellules de levure en les broyant dans un appareil de broyage à billes pendant six cycles à 20 Hz / s pendant 3 min.
   REMARQUE: Après chaque cycle, immergez le récipient abritant les cellules congelées dans de l’azote liquide pour éviter de fondre. Le protocole peut être mis en pause ici. Les extraits congelés peuvent être conservés à -80 °C. Les extraits d’épissage de levure peuvent également être préparés à l’aide d’homogénéisateurs pour lyser les sphéroplastes¹⁰, ou à l’aide de mortier et de pilon^11,12.
6. Faire fondre l’extrait en plaçant les tubes qui les contiennent dans de l’eau à température ambiante, en agitant de temps en temps.
7. Extraits de centrifugeuse à 45 000 x g pendant 1 h à 4 °C.
8. Quantifier la teneur en protéines du surnageant éliminé par la méthode BCA¹³.
9. Préparer les aliquotes des extraits, les congeler rapidement dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Préparation du gradient de glycérol

1. Préparer deux solutions de glycérol dans le tampon A, l’une contenant 10% v/v et l’autre contenant 30% v/v de glycérol.
2. Ajouter l’agent de réticulation glutaraldéhyde à 0,1 % v/v dans la solution de glycérol à 30 % v/v et mélanger pour homogénéiser.
   ATTENTION : Manipulez le glutaraldéhyde à l’intérieur de la hotte à l’aide de l’équipement de sécurité approprié.
3. Ajouter 6 mL de la solution froide de glycérol à 10 % v/v au fond du tube centrifuge de 12 mL (14 x 89 mm).
4. Ajouter 6 mL de la solution froide de glycérol à 30 % v/v complétée par du glutaraldéhyde avec une seringue attachée à une longue aiguille fournie avec le dispositif Gradient Master au fond du tube, juste en dessous de la solution de glycérol à 10 % v/v.
   REMARQUE: Alternativement, la solution de glycérol à 10% v / v peut être soigneusement pipetée sur le dessus de la solution de glycérol / glutaraldéhyde à 30% v / v.
5. Utilisez le dispositif Gradient Master pour générer un gradient de densité continu.
   REMARQUE: Dans le dispositif Gradient Master, les tubes sont placés dans un rack approprié et pivotés brièvement, conformément aux recommandations du fabricant pour déterminer les paramètres (temps / angle / vitesse). Dans ce travail, nous avons utilisé: 2:25 min / 81.5 ° / 11 tr / min.
6. Ajouter soigneusement 200 μL d’un coussin de glycérol/tampon A à 7 % v/v sur le dessus juste avant l’ajout des extraits cellulaires.
   REMARQUE: La concentration de glycérol du coussin doit être inférieure à la solution de glycérol moins concentrée utilisée pour créer le gradient linéaire.

3. Extraits centrifugation

1. Chargez environ 2 mg de protéines totales sur le dessus de chaque gradient linéaire de glycérol de 12 mL à 10% de glutaraldéhyde avec coussin.
2. Placez les tubes dans un rotor à godet oscillant pré-refroidi.
   REMARQUE: Manipulez les tubes doucement pour éviter de mélanger avant l’ultracentrifugation.
3. Centrifuger à 194 000 x g pendant 16 h à 4 °C.
4. Aliquoter chaque tube de 12 mL en vingt-quatre fractions de 500 μL à l’aide d’un EconoSystem adapté ou en pipetant soigneusement.
   REMARQUE: Un EconoSystem adapté se compose d’une pompe péristaltique, du détecteur UV et du collecteur de fraction connecté au dispositif de perforation de tubes. Le profil de sédimentation peut être surveillé par la mesure de l’absorbance à 280 nm.
5. Utilisez une solution de glycérol à 40 % v/v à travers la pompe péristaltique pour pousser le gradient de glycérol de 10 % à 30 % du tube au collecteur de fractions.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver les fractions à -80 °C jusqu’à utilisation.
6. Chargez 50 μL de chaque fraction directement sur des membranes de nitrocellulose sur un dispositif de transfert de points ou de fente. Détecter la protéine par immunoblot en utilisant un anticorps contre le CBP (1:6 000, pour détecter la partie CBP de la balise TAP) et des IgG anti-lapin conjuguées avec la peroxydase de raifort (1:15 000) comme anticorps secondaire.

Résultats

Pour analyser le profil de sédimentation de Cwc24-TAP et déterminer si la méthode Grafix était efficace pour stabiliser sa liaison aux sous-complexes d’épissage, nous avons séparé des extraits de levure totaux de cellules exprimant Cwc24-TAP par centrifugation sur des gradients de glycérol, en présence ou en l’absence de glutaraldéhyde comme agent de réticulation. Des échantillons de vingt-quatre fractions de 500 μL ont ensuite été analysés par transfert de fente avec anticorps contre la partie CBP de l’étiquette TAP. Le...

Discussion

Les interactions protéine-protéine et acides ribonucléiques-protéines peuvent être stabilisées à l’aide d’agents de réticulation. Il est important que le complexe résultant soit stable pour résister à l’ultracentrifugation sur le gradient de glycérol. De plus, les conditions de tampon doivent permettre l’interaction, mais être suffisamment strictes pour éviter une liaison non spécifique. Dans les expériences présentées ici, nous avons utilisé une solution tampon déjà établie pour les réactions d’épissage in vitro

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Protéine de liaison anti-calmoduline Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parties de l’EconoSystem utilisées : pompe péristaltique, détecteur UV et collecteur de fractions
Inhibiteur de protéase sans EDTA Cocktail	Roche	11873580001
Système de récupération de fractions	Beckman Coulter	270-331580	Dispositif de perforation de tubes qui a été connecté aux pièces de l’EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mélangeur MM 200	Retsch	207460001	Broyeur à boulets
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Centrifugeuse	Sorvall RC 6 PlusThermo Scientific	36-101-0816
Rotor à godet oscillant P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Tubes à centrifuger ultra-clairs (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059