Préparation d’échantillons pour le profilage métabolique à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI

Les métabolites, les intermédiaires ou les produits finaux du métabolisme, y compris les nucléotides, les acides aminés ou organiques, les lipides, sont des composants clés des fonctions et des processus biologiques. La métabolomique, l’étude des métabolites, permet d’explorer leurs interactions biochimiques et de comprendre leurs rôles dans le contexte de la recherche fondamentale, translationnelle et clinique. Les métabolites sont fortement associés aux phénotypes des organismes et fournissent des informations sur les activités biochimiques qui se produisent au cours du métabolisme cellulaire¹. Par conséquent, en plus de la génomique et de la protéomique, la métabolomique est devenue un outil important pour comprendre les conditions physiologiques et pathologiques. Par exemple, la métabolomique est utilisée pour élucider les mécanismes derrière les médicaments existants ainsi que leur tolérance. Dans le développement de médicaments, le métabolisme xénobiotique est utile pour évaluer l’activité ou la toxicité des métabolites d’une espèce à l’autre, ce qui se traduit plus tard par un soutien à la médecine personnalisée². Malgré la large application de la métabolomique, l’imagerie des métabolites peut être difficile en raison de la réactivité chimique des métabolites, de leur hétérogénéité structurelle et de leur large plage de concentration^3. Cependant, les concentrations de métabolites labiles, y compris les composés à haute énergie, le glucose, le lactate, le glycolytique, la voie de dérivation du pentose et les intermédiaires du cycle TCA, les phospholipides, les neurotransmetteurs, les composés de signalisation, peuvent changer en quelques secondes et progresser en quelques minutes lorsque les enzymes tissulaires sont actives pendant les procédures de prélèvement tissulaire, telles que l’ischémie post-mortem dans la récolte du cerveau^4,5,6 . Pour assurer une acquisition précise des données métabolomiques, une préparation appropriée et minutieuse des échantillons est essentielle^7,8. Les plates-formes actuellement établies pour mesurer les métabolites comprennent la RMN, les essais enzymatiques et la spectrométrie de masse (y compris la chromatographie liquide et gazeuse), dont la dernière est discutée plus en détail ci-dessous.

MALDI-MSI est une technique de pointe qui permet l’analyse d’échantillons complexes grâce à la détection d’espèces moléculaires individuelles. MALDI MSI offre l’avantage de pouvoir mesurer rapidement et de manière reproductible divers composés moléculaires dans des échantillons biologiques. L’imagerie par spectrométrie de masse permet en outre la production d’images qui représentent la biologie tissulaire basée sur ses métabolites composites, tout en préservant la distribution spatiale des métabolites dans l’échantillon⁹. La capacité de MALDI à détecter des analytes dans un échantillon sans l’utilisation de marquage d’anticorps, de modifications structurelles ou d’autres réactifs spécialisés, tels que ceux utilisés dans l’immunocoloration, associée à sa capacité à surveiller des centaines de molécules au sein d’une seule expérience ne comprend que quelques-uns des avantages accordés par l’imagerie MS en matière de profilage métabolique^{10, 11}. En plus de la matrice couramment utilisée telle que l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) et la 9-aminoacridine (9-AA), récemment découverte d’une nouvelle matrice N-(1-Naphtyl) Dichlorhydrate d’éthylènediamine (NEDC), qui convient bien à l’analyse de divers métabolites de faible poids moléculaire, a encore amélioré l’application de MALDI MSI dans le profilage métabolique¹².

Malgré la large application de MALDI MSI, le coût élevé de l’instrument et la complexité de la procédure expérimentale empêchent sa mise en œuvre plus large dans les laboratoires de recherche individuels. Par conséquent, la plupart des études MALDI MSI sont soutenues par des installations de base partagées. La préparation de l’échantillon, y compris la préparation des lames et le revêtement matriciel, est l’étape la plus critique de MALDI MSI. Cependant, la préparation des lames est normalement effectuée dans le laboratoire de chaque chercheur, ce qui crée des variations potentielles dans l’acquisition ultérieure de MALDI MSI. Ici, nous visons à fournir un protocole détaillé pour la préparation d’échantillons biologiques avant de procéder aux mesures MALDI MSI, et utilisons un profilage métabolomique du cerveau de souris développementale comme exemple.

Le protocole suit les directives du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre de recherche scientifique avancée de la City University of New York (CUNY).

1. Récoltez le tissu

1. Préparez le bateau en aluminium. Préparez un rectangle en aluminium de 10 cm x 20 cm, pliez au milieu pour faire 10 cm de carré double couche. Étiquetez les informations de l’échantillon d’un côté et pliez l’autre côté pour former un bateau avec une surface inférieure d’environ 4 cm x 4 cm.
2. Prérefroidir le bateau sur l’azote liquide (LN₂₎dans une boîte en polystyrène.
   REMARQUE: Si le bateau est trop petit, l’échantillon peut tomber du bateau et se figer en contactant directement LN₂, ce qui peut entraîner une fragmentation pendant la cryosection.
3. Euthanasier l’animal par luxation cervicale en suivant les directives institutionnelles de l’IACUC, disséquer immédiatement le tissu d’intérêt.
   1. Gardez l’intervalle entre l’anesthésie animale et la congélation instantanée aussi court que possible, afin de minimiser l’altération des métabolites pendant la récolte des tissus, en particulier les métabolites labiaux dans le cerveau en raison de l’ischémie post-mortem.
      REMARQUE: La perfusion de l’animal avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) augmentera la durée de l’ischémie, modifiant davantage les concentrations de métabolites labiles et exagérant les résultats artéfactuels. Par conséquent, la perfusion ou le lavage des tissus avec du PBS n’est pas recommandé, sauf si la contamination du sang ou des fluides corporels est plus importante que la détérioration des métabolites ou le lavage pour un projet individuel.
4. Placez immédiatement le tissu dans le bateau en aluminium flottant sur de l’azote liquide, fermez le couvercle de la boîte en polystyrène et congelez pendant 2 à 10 minutes en fonction de la taille du tissu: 2 min, 5 min, 7 min pour le jour postnatal 1 (P1), P21, P60 cerveau de souris, respectivement, et 10 min pour le cerveau de rat P60.
   REMARQUE: Ne congelez pas le tissu pendant une période prolongée (par exemple, 5 minutes pour le cerveau de souris P1), car le surgelé pourrait entraîner une fragmentation des tissus pendant la cryosection.
5. Retirez le bateau à l’érêque, pliez le papier d’aluminium pour envelopper le tissu, transportez-le sur de la glace carbonique et conservez-le à -80 °C pour une utilisation ultérieure. S’il est suivi d’une section immédiate, transporter les échantillons sur de la glace carbonique jusqu’au cryostat.
   REMARQUE: Pour mieux préserver les métabolites, il est préférable de stocker l’échantillon dans des tissus intacts et de le sectionner juste avant de procéder à l’imagerie MALDI. Le tissu peut être conservé à -80 °C jusqu’à 24 mois.

2. Cryosection du tissu

REMARQUE: Portez des gants en tout temps lorsque vous manipulez les lames à l’indium-tinoxide (ITO). Évitez de respirer directement sur la glissière ou portez des masques (facultatif) pour éviter la contamination de la salive humaine sur la section des tissus.

1. Avant de sectionner le tissu, rassemblez le nombre souhaité de lames de verre revêtues d’ITO compatibles MALDI.
2. Testez la conductivité de la glissière à l’aide d’un voltmètre réglé sur la résistance. Étiquetez le côté où une mesure de résistance est lue: ce sera le côté auquel les sections de tissu adhèrent. Placez toujours la glissière sur une serviette en papier propre pour éviter toute contamination.
3. Pré-refroidir les lames dans un cryostat réglé à -20 °C.
4. Si des échantillons de tissus ont été prélevés à -80 °C, laissez le tissu s’équilibrer dans la chambre de cryostat pendant environ 45 à 60 minutes en fonction de la taille du tissu. Si des échantillons sont prélevés de la glace carbonique, équilibrez-les pendant environ 30 minutes.
5. Nettoyez soigneusement le cryostat avec 70% d’éthanol. Pré-refroidissez tous les outils nécessaires, y compris le pinceau d’artiste à pointe mince et les pinces dans la chambre de cryostat.
6. Régler la température de la chambre de cryostat et de la tête de l’échantillon en fonction du type de tissu: -14 °C pour le foie, -20 °C pour les muscles et -25 °C pour la peau⁹.
7. Montez le tissu sur le mandrin à l’aide d’oct oct d’incorporation de tissu cryogénique, en évitant l’OCT de la région d’intérêt.
8. Placez une lame propre dans la scène et verrouillez. Ajustez la position de la scène et l’angle de l’échantillon pour obtenir l’angle de coupe souhaité.
   REMARQUE: Si différents types / génotypes de tissu doivent être coupés, assurez-vous de repositionner l’échantillon de manière à ce qu’une partie propre de la lame soit utilisée , ou de passer à une nouvelle lame avant de couper l’échantillon suivant pour éviter la contamination croisée.
9. Continuez à couper jusqu’à ce que la région d’intérêt (p. ex. le corps calleux dans le cerveau) soit trouvée. Assurez-vous de garder la scène propre en brossant les pièces supplémentaires avec un pinceau d’artiste qui a été équilibré dans le cryostat.
10. Une fois que la région souhaitée est révélée, coupez de plus petites sections de 10 à 12 μm d’épaisseur. Si la section a tendance à s’écailler ou à s’effondrer facilement, augmentez la température du cryostat en restant dans la plage de -22 °C à -11 °C. Nous avons constaté que la température de coupe optimale pour le tissu cérébral est de -15 ° C à - 18 ° C.
11. Une fois qu’une bonne section a été coupée, collez-la à la glissière ITO (opérez dans la chambre de cryostat).
12. Transférez une section du tissu sur des lames ITO à l’aide de la pointe du pinceau d’artiste.
13. Réchauffez la section avec les doigts en plaçant un doigt sous la glissière pour réchauffer la section afin d’assurer un montage sûr. La section de tissu deviendra d’abord transparente en 5-10 s, puis deviendra opaque en environ 30-60 s.
14. Mettez soigneusement la glissière de côté dans le cryostat.
15. Répétez les étapes pour d’autres échantillons de tissus, en vous assurant que chaque section du tissu est placée uniformément sur la lame et est aussi alignée que possible.
16. Étant donné que la cible MALDI peut contenir jusqu’à deux diapositives, placez les sections de plusieurs échantillons de la même cohorte sur une seule diapositive ou sur deux lames, pour vous assurer qu’elles peuvent être analysées en même temps.
17. Lorsque vous avez terminé, placez les glissières ITO dans une boîte à vide et transférez-les dans un dessiccateur avec un dessiccant. Séchez la lame sous vide pendant 45 à 60 min.
    REMARQUE: Si un dessiccateur sous vide n’est pas disponible en laboratoire, maintenez les lames sous -20 ° C tout le temps pour éviter la détérioration des métabolites.
18. Stockage et expédition des lames : à moins que l’échantillon ne soit préparé par les installations centrales d’imagerie MALDI pour passer directement à l’imagerie MALDI, stocker les lames à -80 °C ou les expédier aux installations centrales ou à d’autres laboratoires de recherche MALDI sur de la glace carbonique.
19. Pour préserver au mieux les échantillons, placez les glissières dans le transporteur de diapositives, remplissez-les d’azote (facultatif), scellez-les avec un parafilm, placez-les dans un sac zippé, qui est ensuite placé dans un autre sac zippé contenant du dessiccant. Étiquetez le sac zippé extérieur.
20. Procéder à l’entreposage à -80 °C (jusqu’à 6 mois) ou à l’expédition avec de la glace carbonique adéquate.

3. Préparation de la matrice

1. Préparez la matrice.
   REMARQUE: Tous les réactifs doivent être de qualité HPLC.
   1. Préparer le NEDC à une concentration de 10 mg/mL. Préparer 10 mL de matrice dissoute dans un solvant de méthanol à 70 % (100 mg de NEDC, 7 mL de méthanol, 3 mL de_H2O).
   2. En outre, préparez une solution supplémentaire de 10 mL de méthanol:eau à 70% pour rincer le système de pulvérisation avant de remplir la matrice.
2. Une fois les lames déshydratées à l’étape 2.17, placez des marques « X » sur l’espace vide de la lame de verre à l’extérieur des sections de tissu à l’aide d’un marqueur argenté à pointe audacieuse, puis placez un deuxième « x » avec un marqueur noir à point fin sur le « X » argenté. Le « X » noir avec un contraste net sur le fond argenté (le « X » argenté gras) servira plus tard de marqueur fiduciaire pour l’acquisition ultérieure de spectres de masse dans l’instrument MALDI.
3. Chargez la glissière dans la cible métallique de la glissière MALDI. Utilisez un couvercle en plastique et dessinez/dessinez/contourez l’endroit où se trouvent les échantillons sur le couvercle en plastique. Réserver.
4. Numérisez l’image de la diapositive avec la cible MALDI à l’aide d’un scanner à plat. Les vis à la surface de la cible serviront d’espacement pour éviter l’endommagement ou la contamination de la section tissulaire par le scanner. Prévisualisez et analysez la zone de diapositive sélectionnée en niveaux de gris 16 bits et 2400 ppp. Enregistrez l’image pour une utilisation ultérieure dans MALDI MSI.

4. Dépôt matriciel

REMARQUE: Il existe plusieurs méthodes pour appliquer une couche uniforme de matrice de taille cristalline fine sur la lame MALDI, y compris la sublimation, l’impression jet d’encre par gouttelettes, le pulvérisateur automatique de matrice et la pulvérisation manuelle à l’aide de l’artiste airbush⁹. Nous utiliserons le pulvérisateur à matrice automatique comme exemple dans ce protocole pour sa haute reproductibilité.

1. Démarrage : Allumez l’unité de pulvérisation matricielle, en vous assurant que la vanne est positionnée à LOAD et lancez le logiciel de pulvérisation. Vérifiez que le ventilateur d’extraction fonctionne bien. Ne démarrez pas la pompe à solvant si la ventilation active ne fonctionne pas correctement.
2. Vérifiez dans l’onglet Comms que tout communique, puis démarrez la pompe à solvant à 0,1 mL/min, avec une contre-pression d’environ 500 psi (ou 3,4 MPa).
3. Démarrez le flux d’air comprimé vers le pulvérisateur matriciel en réglant le réservoir d’azote sur 30 psi. Ensuite, réglez le régulateur de pression à l’avant du pulvérisateur à 10 psi et réglez la température de la buse du pulvérisateur comme vous le souhaitez.
   REMARQUE: Si la pression de l’air dans la prière est inférieure à 5 psi, la buse du pulvérisateur ne pourra pas chauffer pour se protéger.
4. Avec la valve toujours en position LOAD, utilisez une seringue pour rincer la boucle avec 7 mL de méthanol à 70%, puis remplissez la boucle avec 6 mL de matrice.
5. Placez les tissus glissés dans les supports du pulvérisateur, en scotchant les deux extrémités pour empêcher tout mouvement et pour préserver un bord sans matrice afin d’éviter la contamination de la pince métallique sur la cible MALDI par la matrice.
   REMARQUE: Il est fortement recommandé de tester d’abord la pulvérisation matricielle sur une lame de microscope vierge avant de procéder à de précieuses lames d’échantillon.
6. Vérifiez que le débit et la température sont stables pour commencer la pulvérisation.
7. Sélectionnez la méthode souhaitée pré-testée à l’aide d’une lame en verre vierge.
8. Appuyez sur Démarrer. Cela réglera la température de la buse et ajustera le débit de la pompe pour qu’il corresponde à la méthode sélectionnée. Basculez la vanne de la position Charge à la position Pulvérisation, puis confirmez en cliquant sur Continuer.
9. Laissez le système fonctionner, ce qui prendra 5 à 20 minutes par diapositive selon la méthode. Basculez la vanne de la position De pulvérisation à la position de chargement, puis confirmez en cliquant sur Continuer lorsque vous avez terminé.
10. Retirez la ou les lames du pulvérisateur, examinez le motif du revêtement matriciel au microscope pour assurer une couche uniforme de cristal à matrice fine.
11. Après le dépôt de la matrice, placez la ou les lames dans le support MALDI métallique pour une utilisation immédiate. S’il n’y a qu’une seule diapositive d’échantillon, ajoutez une autre diapositive vierge pour remplir les deux espaces du support MALDI.
12. Nettoyez le système immédiatement après l’utilisation en suivant les instructions du fabricant, afin d’éviter le colmatage de la buse du pulvérisateur.
13. Une fois que la lame d’échantillon est recouverte de matrice, passez immédiatement à l’instrument d’imagerie MALDI ou expédiez-la avec de la glace carbonique en utilisant la même préparation de sac à double fermeture à glissière décrite à l’étape 2.19.
    REMARQUE: Dans des circonstances d’urgence telles que l’instrument MALDI n’est pas disponible pour une utilisation immédiate, stocker la lame revêtue sous vide ou à -20 ° C pendant 24 heures, bien que la détérioration de certains métabolites puisse se produire pendant le stockage, ce qui n’a pas été soigneusement étudié.

L’expérience représentative a été réalisée selon le flux de travail illustré à la figure 1. Les cerveaux de souris de type sauvage C57BL de développement des jours postnatals 1, 21, 60 (adulte) ont été récoltés comme décrit ci-dessus en suivant les directives CUNY IACUC et ont été congelés pendant 2, 5 et 7 minutes, respectivement, sur un bateau en aluminium flottant sur de l’azote liquide. Les tissus congelés ont été cryosectionnés à des sections de 10 μm d’épaisseur à −15 °C fixées à la fois pour la tête de l’échantillon et la chambre. Les cryosections tissulaires ont ensuite été doucement transférées sur le côté conducteur pré-refroidi des lames de verre revêtues d’ITO pour l’imagerie MALDI. Les cryosections montées sur des lames ITO ont été desséchées sous vide pendant 45 minutes à température ambiante, suivies d’un dépôt matriciel à l’aide d’un pulvérisateur automatique. Matrix NEDC a été utilisé pour détecter les métabolites, et une solution matricielle de 10 mg/mL dans du méthanol/eau (70/30, v/v) a été déposée à un débit de 0,1 mL/min et à une température de buse de 75 °C pendant 12 cycles avec un séchage de 5 s entre chaque cycle. Une vitesse de pulvérisation de 1300 mm/min, un espacement des voies de 2 mm, une pression de gazN2 de 10 psi et un débit de 3 L/min et une hauteur de buse de 40 mm ont été utilisés.

Les spectres de masse MALDI ont été acquis en mode ion négatif par l’instrument MSI à temps de vol MALDI (TOF). 0,5-1 μL d’émulsion de phosphore rouge (grappes de Pn avec n = 1 - 90) dans le méthanol a été déposé sur les lames ITO, à côté des tissus montés, et utilisé pour calibrer l’instrument dans la gamme de masse 100 - 1000 m/z en appliquant la courbe d’étalonnage quadratique13. Les diamètres des points laser ont été focalis sur un profil de faisceau modulé « Medium » pour une largeur raster de 50 μm. Des spectres dans la plage de masse de m/z 50 à 1000 ont été acquis à 1000 Hz pour 500 prises de vue. Les données du spectre de masse ont été enregistrées et l’imagerie a été analysée plus en détail à l’aide du logiciel avancé d’analyse de données MALDI MSI. Les images ioniques ont été générées avec une normalisation rmS (root-mean square) à une largeur de bac de ±0,25 Da.

Les résultats de la figure 2 montrent des images de sortie du logiciel d’analyse de données MALDI MSI de spectres m/z sélectionnés dans tous les intervalles de 100 Dalton, illustrant clairement l’utilité pour l’identification des spectres des métabolites de petites molécules aux lipides de poids moléculaire élevé. Chaque rangée représente des cartes thermiques ioniques respectives contenant des informations spatiales et spectrales d’une certaine espèce de métabolite sur trois tissus collectés aux jours postnatals 1, 21 et 60. Pour chaque m/z représentatif, l’analyse de la répartition régionale et de l’abondance des ions peut être utilisée pour comparer les quantités relatives d’espèces correspondantes entre différents âges. L’une des forces de la méthodologie MALDI MSI est la capacité de discerner la spécificité de certaines espèces identifiées par m/z à des jalons de développement ou à des structures anatomiques spécifiques. On observe que certains métabolites sont enrichis chez les nouveau-nés P1 (m/z 320,1), enrichis chez les adultes P60 (m/z 846,5) ou uniformément répartis entre les âges (m/z 480,3); d’autres espèces moléculaires sont spécifiquement enrichies en matière grise (m/z 117,1; 524,3; 765,1), en substance blanche (m/z 673,4; 846,5) ou en LCR/ventricules (m/z 239,0)(figure 2A). La distribution spatiale des métabolites représentatifs, y compris l’hypoxanthine (m/z 135,0), l’acide N-acétyl-L-aspartique (m/z 174,0), l’acide arachidonique (m/z 303,2) et plusieurs lipides tels que la lysophosphatidyléthanolamine LPE (18:1) (m/z 478,3), le LPE(20:4) (m/z 500,3), le LPE (22:6) (m/z 524,3), la phosphatidyléthanolamine PE (44:10) (m/z 838,5), le phosphatidylinositol PI(38:4) (m/z 885,6) sont également représentés (Figure 2B).

Graphique 1. Flux de travail de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI-temps de vol (TOF). Le tissu congelé est cryrosectionné dans du cryostat et monté sur une lame ITO. → La lame avec des sections de tissu est recouverte d’une fine couche de matrice à l’aide d’un pulvérisateur à matrice automatique. → spectres de masse est collecté par l’instrument MALDI-TOF MSI à un raster de 20-200um. → Les données sont analysées et les images sont générées à l’aide du logiciel avancé d’analyse de données MALDI MSI. Barre d’échelle: 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Graphique 2. Sortie représentative avec des spectres m/z sélectionnés de spectrométrie de masse acquis à une résolution latérale de 50 μm. (A) Une carte thermique illustre la distribution spatiale d’espèces de métabolites spécifiques sélectionnées dans chaque intervalle de 100 Dalton m/z à travers les trois étapes de développement identifiées à P1, P21 et P60. (B) La distribution spatiale des métabolites représentatifs à P1, P21 et P60, y compris: l’hypoxanthine, l’acide N-acétyl-L-aspartique, l’acide arachidonique et différentes espèces lipidiques telles que la lysophosphatidyléthanolamine (LPE), la phosphatidyléthanolamine (PE), le phosphatidylinositol (PI). Barre d’échelle, 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.