Étiquetage et visualisation des produits d'expression du génome mitochondrial dans Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Summary

Le génome mitochondrial de levure de Baker code huit polypeptides. Le but du protocole actuel est de les étiqueter tous et de les visualiser par la suite comme des bandes distinctes.

Abstract

Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Ils contiennent un génome circulaire et un appareil d'expression génique. Un génome mitochondrial de levure de boulanger code huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l'enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p. Le but de la méthode décrite ici est d'étiqueter spécifiquement ces protéines avec de la méthionine ³⁵S, de les séparer par électrophoresis et de visualiser les signaux comme des bandes discrètes à l'écran. La procédure comporte plusieurs étapes. Tout d'abord, les cellules de levure sont cultivés dans un milieu contenant de la galactose jusqu'à ce qu'elles atteignent le stade de croissance logarithmique tardive. Ensuite, le traitement cycloheximide bloque la traduction cytoplasmique et ^{ne permet l'incorporation de 35}S de méthionine que dans les produits de traduction mitochondrique. Ensuite, toutes les protéines sont extraites des cellules de levure et séparées par électrophoresis gel polyacrylamide. Enfin, le gel est séché et incubé avec l'écran de phosphore de stockage. L'écran est scanné sur un phosphorimager révélant les bandes. La méthode peut être appliquée pour comparer le taux de biosynthèse d'un seul polypeptide dans les mitochondries d'une souche de levure mutante par rapport au type sauvage, ce qui est utile pour étudier les défauts d'expression des gènes mitochondriaux. Ce protocole donne des informations précieuses sur le taux de traduction de tous les ARNm mitochondriaux de levure. Toutefois, il faut plusieurs contrôles et des expériences supplémentaires pour tirer des conclusions appropriées.

Introduction

Les mitochondries sont les organites profondément impliqués dans le métabolisme d'une cellule eucaryotique. Leur chaîne de transfert d'électrons fournit à la cellule de l'ATP, la principale monnaie énergétique utilisée dans de multiples voies biochimiques. En outre, ils sont impliqués dans l'apoptose, l'acide gras et la synthèse de l'hème, et d'autres processus. Le dysfonctionnement des mitochondries est une source bien connue de maladie humaine^1. Il peut résulter de mutations dans des gènes nucléaires ou mitochondriques codant des composants structurels ou réglementaires des organites². La levure saccharomyces cerevisiae de Baker est un excellent organisme modèle pour étudier l'expression des gènes mitochondriaux pour plusieurs raisons. Tout d'abord, leur génome est^{complètement séquencé 3}, bien annoté, et une grande somme de données est déjà disponible dans la littérature grâce à la longue histoire des enquêtes menées avec cet organisme. Deuxièmement, les manipulations avec leur génome nucléaire sont relativement rapides et faciles en raison de leur taux de croissance rapide et de leur système de recombinaison homologue très efficace. Troisièmement, la levure de boulanger S. cerevisiae est l'un des rares organismes pour lesquels les manipulations avec des génomes mitochondriaux sont développées. Enfin, la levure de boulanger est un organisme de faculté d'aérobe-anaérobie, qui permet l'isolement et l'étude des mutants respiratoires défectueux, car ils peuvent se développer dans des médias contenant des sources de carbone fermentescibles.

Nous décrivons la méthode pour étudier l'expression mitochondrique de gène de la levure de boulanger S. cerevisiae au niveau translationnel^4. Son principe principal provient de plusieurs observations. Tout d'abord, le génome mitochondrial de levure ne code que huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l'enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p⁵. Ce nombre est faible, et tous peuvent être séparés par électrophoresis sur un seul gel dans les conditions appropriées. Deuxièmement, les ribosomes mitochondriques appartiennent à la classe procaryotique plutôt qu'à l'eucaryotique⁶, et donc, la sensibilité aux antibiotiques est différente pour les ribosomes cytoplasmiques et mitochondriques de levure. Il permet l'inhibition de la traduction cytoplasmique avec le cycloheximide, fournissant les conditions où l'acide aminé étiqueté⁽³⁵S-méthionine) est incorporé seulement dans les produits de traduction mitochondrial. En conséquence, l'expérience donne des informations sur le taux d'incorporation d'acides aminés dans les protéines mitochondriales synthétisées de novo, reflétant l'efficacité globale de la traduction mitochondriale pour chacun des huit produits

Protocol

1. Préparation de culture de levure

1. Streak levure des cultures de bouillon congelés sur des assiettes fraîches avec le milieu approprié. Mettez les assiettes dans un incubateur de culture à 30 °C pendant 24-48 h.
   REMARQUE : Laissez pousser les mutants sensibles à la température à la température permissive.
2. Inoculer les cultures de levure dans 2 mL de milieu YPGal (2% de peptone, 1% d'extrait de levure, 2% de galactose) de la strie fraîche dans des tubes de 15 mL et les incuber toute la nuit agitant à 200 rpm à 30 °C.
3. Mesurer la densité optique de la culture à une longueur d'onde de 600 nm (OD₆₀₀).
4. Prenez le volume correspondant à 0,2 unités d'absorption dans les tubes stériles, les cellules de levure de granulés à 9.000 x g pendant 30 s à température ambiante, et jetez le supernatant.
5. Laver les cellules avec 0,5 mL d'eau stérile en tourbillonnant pendant 5 s. Pelleter les cellules de levure à 9000 x g pendant 30 s à température ambiante et jeter le supernatant. Diluer les cellules dans 2 mL de milieu YPGal frais.
6. Incuber l'agitation à 200 rpm et 30 °C jusqu'à ce que l'OD₆₀₀ atteigne 1,5 à 1,9 valeur.
   REMARQUE: Les taux de croissance de levure varient, alors soyez prêt à attendre. Il est raisonnable de faire des pas 1.3-1.6 tôt le matin. Il faut généralement 4-5 h, mais peut prendre plus de temps.

2. Incorporation d'isotopes radioactifs

1. Transférer le volume de culture équivalent à une unité optique dans un tube de microcentrifugeuse. Faire tourner les tubes à 3 000 x g pendant 1 min et jeter le supernatant. Laver avec 0,5 mL d'eau stérile en tourbillonnant pendant 5 s.
   1. Pelleter les cellules de levure à 9000 x g pendant 30 s à température ambiante et jeter le supernatant. Resuspendez les cellules de levure dans 0,5 mL de tampon de traduction stérile. Placer la suspension dans un tube de 15 mL.
      REMARQUE : Le tampon de traduction est une solution contenant 2 % de galactose (w/v) et 50 mM de phosphate de potassium avec pH 6,0.
2. Ajouter le cycloheximide à la suspension cellulaire jusqu'à une concentration finale de 0,2 mg/mL. Incuber pendant 5 min agitant à 200 rpm et 30 °C pour inhiber la traduction cytosolique.
   REMARQUE : La solution cycloheximide (20 mg/mL, en éthanol) doit être préparée fraîchement avant l'expérience. Le chloramphénicol peut être remplacé avec succès par de l'anisomycine dans la même concentration^7.
3. Ajouter 25-30 μCi ^{de 35}S-méthionine à la suspension cellulaire et incuber pendant 30 min agitant à 200 tours et 30 °C.
   REMARQUE : Le mélange de ³⁵S-méthionine et ^{de 35}S-cystéine peut également être utilisé. Pure ³⁵S-methionine se traduit par le signal le plus fort et le meilleur rapport signal-bruit. Généralement, la méthionine est plus efficace que la cystéine parce que la teneur de cet acide aminé dans les protéines mitochondriques est plus élevée. Cependant, le mélange EasyTag de ³⁵S-méthionine et cystéine est moins cher et donne des résultats comparables⁷.
   ATTENTION: ³⁵S-méthionine est radioactif. Suivez les pratiques de sécurité habituelles pour la manipulation des matières radioactives.
   REMARQUE : Il est bien connu que l'incorporation de la radioactivité atteint une limite en raison de laquelle le total des signaux se nivelle au fil du temps. Une fois cette limite atteinte, il est presque impossible de déterminer les taux de synthèse des différents produits de traduction. Pour analyser le taux de traduction mitochondrique, il est impératif d'être dans un état dans lequel l'intensité du signal augmente avec le temps d'incubation ^{avec 35}S-méthionine d'une manière linéaire. Pour les souches courantes de type sauvage de laboratoire, le signal est déjà saturé pour des temps d'incubation beaucoup plus courts que les 30 min. Les mutants translationnels peuvent se comporter très différemment. Un cours du temps devrait être effectué pour établir la cinétique de l'incorporation de radioactivité et donc le taux de traduction, au moins lorsque vous travaillez avec une nouvelle souche. Pour cela, nous suggérons de prélever des échantillons avec un intervalle de plusieurs minutes (p. ex., 2,5, 5,0, 7,5, 10 et 20 min).
4. Ajouter la méthionine « froide » non étiquetée (la concentration finale devrait être de 20 mM) et la puromycine (la concentration finale devrait être de 1 à 10 μg/mL) pour arrêter l'étiquetage. Incuber pendant 10 min agitant à 200 rpm et 30 °C.
   REMARQUE : Cette étape est essentielle pour donner aux ribosomes le temps de finir de traduire les peptides. Dans le cas contraire, tous les polypeptides plus courts que la pleine longueur seront détectés à une taille différente. Une expérience de cours du temps (pulse-chase) peut être faite à cette étape pour déterminer la stabilité des produits de traduction mitochondrial. Pour cela, poursuivre l'incubation en prélevant des échantillons avec un intervalle de 30 min (p. ex., 30, 60, 90 et 120 min).

3. Lyse de cellules de levure et extraction des protéines

1. Recueillir les cellules de levure par centrifugation à 9 000 x g pendant 30 s. Laver les cellules avec 0,5 mL d'eau stérile en tourbillonnant pendant 5 s. Cellules de levure de granulés à 9.000 x g pour 30 s à température ambiante. Jeter le surnatant.
   note. Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver les échantillons à -20 °C.
2. Ajouter 75 μL de tampon de lyse à la pastille et au vortex pendant 5 à 10 s.
   REMARQUE : Le tampon de lyse est une solution de 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoéthanol et 1 MM PMSF dans l'eau. Évitez l'incubation excessive avec tampon de lyse menant à l'hydrolyse alcaline des protéines. Passez immédiatement à l'étape 3.3.
3. Ajouter 500 μL de tampon Tris-HCl de 0,5 M avec pH 6,8. Vortex brièvement.

4. Précipitation de protéines

ATTENTION : Le méthanol et le chloroforme sont des solvants organiques. Suivez les pratiques de sécurité habituelles pour la manipulation des substances organiques.

1. Ajouter 600 μL de méthanol à l'échantillon. Vortex pour 5 s.
2. Ajouter 150 μL de chloroforme à l'échantillon. Vortex pour 5 s.
3. Centrifugeuse les échantillons pendant 2 min à 12.000 x g. Jetez soigneusement la phase supérieure à l'avec un échantillonneur.
4. Ajouter 600 μL de méthanol à l'échantillon. Mélanger soigneusement en inversant le tube plusieurs fois.
5. Centrifugeuse les échantillons pendant 2 min à 12.000 x g. Jeter le surnatant.
6. Sécher à l'air le granulé pendant 2 min à 80 °C.
   REMARQUE : Tout le liquide doit s'évaporer. Il y a un risque d'avoir une séparation aberrante des protéines dans le gel si la pastille a été séchée insuffisamment. Cependant, il n'est pas possible de trop sécher la pastille, de sorte qu'elle peut même être stockée pendant la nuit à 4 °C.
7. Dissoudre les protéines précipitées dans 60 μL de tampon échantillon 1x Laemmli.
8. Chauffer pendant 10 min à 40 °C.
   REMARQUE : Évitez de faire bouillir les échantillons à 95 °C, car cela provoque une agrégation. Si les agrégats se forment encore, faites tourner les échantillons à 12 000 x g pendant 2 min et recueillez le supernatant. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C. Le protocole peut être mis en pause ici.

5. SDS-PAGE

1. Jetez le gel Laemmli SDS-polyacrylamide 17,5%.
   NOTE: 6 M d'urée peuvent être ajoutés au gel pour résoudre mieux atp8 et atp9. Gradient 15%-20% gels peuvent également donner une meilleure résolution.
2. Chargez 15 μL (40-50 μg) de chaque échantillon dans les poches.
   REMARQUE : Il n'est pas nécessaire de mesurer la concentration en protéines si les valeurs de_{l'OD 600} étaient proches à l'étape 1.6. Si ce n'est pas le cas, mesurez les concentrations de protéines à l'aide de l'analyse avec des réacompteurs compatibles avec le détergent.
3. Faire fonctionner le gel dans une pièce froide jusqu'à ce que le colorant bleu atteigne environ 65% de la longueur du gel.
   REMARQUE : Pour le système utilisé (p. ex., protéien II xi cell), nous utilisons l'un ou l'autre des deux modes : 16-17 h à 5 V/cm ou 5 h à 15 V/cm. Aucune protéine ne court plus vite que le colorant bleu bromophénol, mais de longues courses peuvent entraîner un brouillage des signaux atp8 et atp9.
4. Tacher le gel avec coomassie bleu brillant et faire un scan ou une photo, qui est nécessaire comme un contrôle de chargement.
   REMARQUE : Une autre façon de faire un contrôle de chargement est l'immunoblotting avec un anticorps au gène mitochondrique de « ménage », par exemple, porine 1.

6. Autoradiographie

1. Sécher le gel dans un séchoir à gel. Gardez-le dans la cassette avec un écran de phosphore de stockage pendant 3-5 jours.
   REMARQUE : Une alternative au criblage du gel séché est le transfert de protéines à une membrane de nitrocellulose par électroblotting et criblage par la suite. Il en résulte des signaux plus forts et des bandes plus nettes.
2. Scannez l'écran sur un phosphorimager.
   REMARQUE : Comme alternative à l'imagerie au phosphore, le film à rayons X peut également être utilisé pour révéler les signaux.

Results

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons attribué des produits de traduction mitochondrique à partir de deux souches de S. cerevisiae : le type sauvage (WT) et une suppression mutante du gène AIM23 (AIM23Δ), codant le facteur d'initiation à la traduction mitochondrique 3 (tableau 1)⁸. Les produits de traduction mitochondrial ont été étiquetés et séparés radioactivement dans SDS-PAAG9. Les échantillons ont été prélevés toutes les 2,5 min...

Discussion

Les études de l'expression des gènes occupent une place centrale dans les sciences de la vie modernes. De nombreuses méthodes donnant un aperçu de ce processus complexe ont été développées. Ici, nous avons décrit la méthode permettant d'accéder à la biosynthèse protéique dans la levure de boulanger S. cerevisiae mitochondries. Il est généralement appliqué pour comparer l'efficacité de traduction des ARNH dans les mitochondries de souche de levure mutante par rapport au type sauvage pour accéder aux conséquences ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Persulfate d’ammonium	Sigma-Aldrich	A3678
Gélose bactériologique	Sigma-Aldrich	A5306  ;
Densimètre à cellules Biowave CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
MARQUE cuvettes jetables standard	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroforme	Sigma-Aldrich	288306  ;
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988  ;
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388  ;
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021  ;
chauffe-moteur numérique	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Méthionine, 500µ ; Ci (18.5MBq), Solution aqueuse stabilisée	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Centrifugeuse Eppendorf 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Filtres au phosphore de stockage	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-méthionine	Sigma-Aldrich	M9625  ;
méthanol	Sigma-Aldrich	34860  ;
N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyléthylènediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N&prime ;-Méthylènebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
Nouveau-Brunswick Innova 44/44R Agitateur	Incubateur Nouveau-Brunswick Scientific
Peptone de viande, bactériologique	Millipore	91249  ;
Fluorure de phénylméthanesulfonyle	Sigma-Aldrich	P7626²626² ;
Pierce 660nm Kit de dosage des protéines	Thermo Scientific	22662
Alimentation de base PowerPac	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Dichlorhydrate de puromycine de Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 imageur phosphore	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352  ;
Séchoir à gel chauffé sous vide	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Extrait	de levure Sigma-Aldrich	Y1625  ;