Étiquetage et visualisation des produits d'expression du génome mitochondrial dans Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Résumé

Le génome mitochondrial de levure de Baker code huit polypeptides. Le but du protocole actuel est de les étiqueter tous et de les visualiser par la suite comme des bandes distinctes.

Résumé

Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Ils contiennent un génome circulaire et un appareil d'expression génique. Un génome mitochondrial de levure de boulanger code huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l'enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p. Le but de la méthode décrite ici est d'étiqueter spécifiquement ces protéines avec de la méthionine ³⁵S, de les séparer par électrophoresis et de visualiser les signaux comme des bandes discrètes à l'écran. La procédure comporte plusieurs étapes. Tout d'abord, les cellules de levure sont cultivés dans un milieu contenant de la galactose jusqu'à ce qu'elles atteignent le stade de croissance logarithmique tardive. Ensuite, le traitement cycloheximide bloque la traduction cytoplasmique et ^{ne permet l'incorporation de 35}S de méthionine que dans les produits de traduction mitochondrique. Ensuite, toutes les protéines sont extraites des cellules de levure et séparées par électrophoresis gel polyacrylamide. Enfin, le gel est séché et incubé avec l'écran de phosphore de stockage. L'écran est scanné sur un phosphorimager révélant les bandes. La méthode peut être appliquée pour comparer le taux de biosynthèse d'un seul polypeptide dans les mitochondries d'une souche de levure mutante par rapport au type sauvage, ce qui est utile pour étudier les défauts d'expression des gènes mitochondriaux. Ce protocole donne des informations précieuses sur le taux de traduction de tous les ARNm mitochondriaux de levure. Toutefois, il faut plusieurs contrôles et des expériences supplémentaires pour tirer des conclusions appropriées.

Introduction

Les mitochondries sont les organites profondément impliqués dans le métabolisme d'une cellule eucaryotique. Leur chaîne de transfert d'électrons fournit à la cellule de l'ATP, la principale monnaie énergétique utilisée dans de multiples voies biochimiques. En outre, ils sont impliqués dans l'apoptose, l'acide gras et la synthèse de l'hème, et d'autres processus. Le dysfonctionnement des mitochondries est une source bien connue de maladie humaine^1. Il peut résulter de mutations dans des gènes nucléaires ou mitochondriques codant des composants structurels ou réglementaires des organites². La levure saccharomyces cerev....

Protocole

1. Préparation de culture de levure

1. Streak levure des cultures de bouillon congelés sur des assiettes fraîches avec le milieu approprié. Mettez les assiettes dans un incubateur de culture à 30 °C pendant 24-48 h.
   REMARQUE : Laissez pousser les mutants sensibles à la température à la température permissive.
2. Inoculer les cultures de levure dans 2 mL de milieu YPGal (2% de peptone, 1% d'extrait de levure, 2% de galactose) de la strie fraîche dans des tubes de 15 mL et les incuber toute la nuit agitant à 200 rpm à 30 °C.
3. Mesurer la densité optique de la culture à une longueur d'onde de 600 nm (OD₆₀₀).
4. Prenez le volume ....

Résultats

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons attribué des produits de traduction mitochondrique à partir de deux souches de S. cerevisiae : le type sauvage (WT) et une suppression mutante du gène AIM23 (AIM23Δ), codant le facteur d'initiation à la traduction mitochondrique 3 (tableau 1)⁸. Les produits de traduction mitochondrial ont été étiquetés et séparés radioactivement dans SDS-PAAG9. Les échantillons ont été prélevés toutes les 2,5 min.......

Discussion

Les études de l'expression des gènes occupent une place centrale dans les sciences de la vie modernes. De nombreuses méthodes donnant un aperçu de ce processus complexe ont été développées. Ici, nous avons décrit la méthode permettant d'accéder à la biosynthèse protéique dans la levure de boulanger S. cerevisiae mitochondries. Il est généralement appliqué pour comparer l'efficacité de traduction des ARNH dans les mitochondries de souche de levure mutante par rapport au type sauvage pour accéder aux conséquences .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Persulfate d’ammonium	Sigma-Aldrich	A3678
Gélose bactériologique	Sigma-Aldrich	A5306  ;
Densimètre à cellules Biowave CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
MARQUE cuvettes jetables standard	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroforme	Sigma-Aldrich	288306  ;
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988  ;
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388  ;
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021  ;
chauffe-moteur numérique	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Méthionine, 500µ ; Ci (18.5MBq), Solution aqueuse stabilisée	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Centrifugeuse Eppendorf 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Filtres au phosphore de stockage	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-méthionine	Sigma-Aldrich	M9625  ;
méthanol	Sigma-Aldrich	34860  ;
N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyléthylènediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N&prime ;-Méthylènebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
Nouveau-Brunswick Innova 44/44R Agitateur	Incubateur Nouveau-Brunswick Scientific
Peptone de viande, bactériologique	Millipore	91249  ;
Fluorure de phénylméthanesulfonyle	Sigma-Aldrich	P7626²626² ;
Pierce 660nm Kit de dosage des protéines	Thermo Scientific	22662
Alimentation de base PowerPac	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Dichlorhydrate de puromycine de Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 imageur phosphore	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352  ;
Séchoir à gel chauffé sous vide	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Extrait	de levure Sigma-Aldrich	Y1625  ;