Utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre

Résumé

Ce protocole utilise un test d’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM_2,5dans les cœurs disséqués des embryons de poisson-zèbre.

Résumé

L’exposition aux particules fines ambiantes (PM_2,5)peut entraîner une toxicité pour le développement cardiaque, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas encore clairs. La 8-hydroxy-2'désoxygénase (8-OHdG) est un marqueur des dommages oxydatifs à l’ADN et γH2AX est un marqueur sensible pour les cassures double brin de l’ADN. Dans cette étude, nous avons cherché à détecter les changements 8-OHdG et_γH2AXinduits par les PM 2,5 au cœur des embryons de poisson-zèbre à l’aide d’un test d’immunofluorescence. Les embryons de poisson-zèbre ont été traités avec des matières organiques extractibles (EOM) de PM_2,5 à 5 μg/mL en présence ou en l’absence d’antioxydant n-acétyl-L-cystéine (NAC, 0,25 μM) à 2 h après la fécondation (HPF). Le DMSO a été utilisé comme contrôle du véhicule. À 72 hpf, les cœurs ont été disséqués à partir d’embryons à l’aide d’une aiguille de seringue et fixés et perméabilisés. Après avoir été bloqués, les échantillons ont été sondés avec des anticorps primaires contre le 8-OHdG et l’γH2AX. Les échantillons ont ensuite été lavés et incubés avec des anticorps secondaires. Les images résultantes ont été observées en microscopie à fluorescence et quantifiées à l’aide d’ImageJ. Les résultats montrent que la MOE des PM_2,5 a significativement amélioré les signaux 8-OHdG et γH2AX au cœur des embryons de poissons-zèbres. Cependant, le NAC, agissant comme un piégeur d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), a partiellement contrecarré les dommages à l’ADN induits par la MOE. Ici, nous présentons un protocole d’immunofluorescence pour étudier le rôle des dommages à l’ADN dans les malformations cardiaques induites par les PM_2,5qui peuvent être appliqués à la détection des changements d’expression protéique induits par des produits chimiques environnementaux dans le cœur des embryons de poisson-zèbre.

Introduction

La pollution de l’air est aujourd’hui un grave problème environnemental auquel le monde est confronté. Les particules fines ambiantes (PM_2,5),qui sont l’un des indicateurs les plus importants de la qualité de l’air, peuvent transporter un grand nombre de substances nocives et pénétrer dans le système circulatoire sanguin, causant de graves dommages à la santé humaine¹. Des études épidémiologiques ont démontré que l’exposition aux PM_2,5 peut entraîner un risque accru de malformations cardiaques congénitales (CHD)^2,3. Les preuves provenant d’expériences animales ont ....

Protocole

Le poisson-zèbre de type sauvage (AB) utilisé dans cette étude a été obtenu auprès du National Zebrafish Resource Center de Wuhan, en Chine. Toutes les procédures animales décrites ici ont été examinées et approuvées par l’Établissement de soins aux animaux du Comité d’éthique de l’Université Soochow.

1. Échantillonnage des PM_2,5 et extraction des composés organiques

REMARQUE : Les PM_2,5 ont été collectées dans une zone urbaine à Suzhou, en Chine, du 1er au 7 août 2015, comme décrit précédemment⁵.

1. Cuire des filtres à membrane de quartz de 47 mm dans un four ....

Résultats

Ce test d’immunofluorescence est une méthode sensible et spécifique pour mesurer les changements d’expression des protéines dans le cœur des embryons de poisson-zèbre exposés à des produits chimiques environnementaux.

Dans cette analyse représentative, les embryons exposés aux PM_2,5 en l’absence ou en présence de l’antioxydant NAC ont été évalués pour la présence de malformations cardiaques (Figur.......

Discussion

Bien que le poisson-zèbre soit un excellent modèle de vertébrés pour étudier la toxicité pour le développement cardiaque des produits chimiques environnementaux, en raison de la petite taille du cœur embryonnaire, il est difficile d’obtenir suffisamment de protéines pour l’analyse par transfert de Western. Par conséquent, nous présentons une méthode d’immunofluorescence sensible pour quantifier les niveaux d’expression protéique des biomarqueurs de dommages à l’ADN dans le cœur des embryons de poisson-zèbre exposés aux P.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps 8-OHdG	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-66036	Anticorps primaire
Balance analytique	Sartorius, Chine	BSA124S
BSA	Solarbio, Pékin, Chine	SW3015	Pour bloquer
DAPI	Abcam, USA	ab104139	Pour contre-coloration nucléaire.
DMSO	Solarbio, Pékin, Chine	D8371
Microscope à fluorescence	Olympus, Japon	IX73	Pour l’imagerie des signaux de fluorescence
Chèvre Anti-Lapin IgG Cy3	Carlsbad, USA	CW0159	Anticorps secondaire
Chèvre Anti-Lapin IgG FITC	Carlsbad, USA	RS0003	Anticorps secondaire
N-Acétyl-L-cystéine (NAC)	Adamas-Beta, Shanghai, Chine	616-91-1
Agitateur orbital	QILINBEIER, Chine	TS-1
Paraformaldéhyde	Sigma, Chine	P6148	Fabriquer 4 % de paraformaldéhyde pour la fixation.
Saline tamponnée au phosphate	HyClone, États-Unis	SH30256.01	Préparez 0,1 % de Tween dans PBS pour le lavage.
Échantillonneur PM2.5	TianHong, Wuhan, Chine	TH-150C	Pour un échantillonnage ininterrompu des PM2.5 24 heures sur 24.
Système d’aquaculture en recirculation	HaiSheng, Shanghai, Chine		Le poisson zèbre y a été maintenu.
Extracteur Soxhlet	ZhengQiao, Shanghai, Chine	BSXT-02	Pour l’extraction de composants organiques.
Stéréomicroscope	Nikon, Canada	SMZ645	Pour la dissection cardiaque à partir d’embryons de poisson-zèbre.
Méthanesulfonate de tricaïne (MS222)	Sigma,Chine	E10521	Pour anesthésier les embryons de poisson-zèbre
Tween 20	Sigma,Chine	P1379
&gamma ; Anticorps H2AX	Abcam, États-Unis	ab26350	Anticorps primaire