Imagerie à cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA) - une technique polyvalente pour quantifier la cinétique cellulaire

Résumé

Nous présentons une méthode pour l’acquisition des cours de temps de rapporteur de fluorescence à partir de cellules simples utilisant des réseaux micropatterned. Le protocole décrit la préparation de réseaux unicellulaires, la mise en place et le fonctionnement de la microscopie time-lapse à balayage de cellules vivantes et un outil d’analyse d’image open source pour la présélection automatisée, le contrôle visuel et le suivi des cours de temps de fluorescence intégrés aux cellules par site d’adhésion.

Résumé

L’imagerie par cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA) est une méthode polyvalente pour collecter des cours temporels de signaux de fluorescence à partir de cellules individuelles à haut débit. En général, l’acquisition de cours de temps unicellulaires à partir de cellules cultivées est entravée par la motilité cellulaire et la diversité des formes cellulaires. Les microréseaux adhésifs standardisent les conditions unicellulaires et facilitent l’analyse d’images. LISCA combine des puces à ADN unicellulaires avec une microscopie time-lapse à balayage et un traitement d’image automatisé. Ici, nous décrivons les étapes expérimentales de la prise de cours de temps de fluorescence unicellulaire dans un format LISCA. Nous transfectons les cellules adhérentes à un réseau micropatterned utilisant le codage d’ARNm pour la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et surveillons la cinétique d’expression eGFP de centaines de cellules en parallèle via la microscopie time-lapse de balayage. Les piles de données d’image sont automatiquement traitées par un logiciel nouvellement développé qui intègre l’intensité de fluorescence sur les contours cellulaires sélectionnés pour générer des cours de temps de fluorescence unicellulaires. Nous démontrons que les cours de temps d’expression d’eGFP après transfection d’ADN messagère sont bien décrits par un modèle de traduction cinétique simple qui révèle des taux d’expression et de dégradation de l’ARNm. D’autres applications de LISCA pour des corrélations de temps d’événement des marqueurs multiples dans le cadre de l’apoptosis de signalisation sont discutées.

Introduction

Ces dernières années, l’importance des expériences unicellulaires est devenue évidente. Les données des cellules individuelles permettent d’enquêter sur la variabilité de cellule à cellule, la résolution des corrélations de paramètres intracellulaires et la détection de la cinétique cellulaire qui reste cachée dans les mesures d’ensemble^1,2,3. Afin d’étudier la cinétique cellulaire de milliers de cellules individuelles en parallèle, de nouvelles approches sont nécessaires qui permettent de surveiller les cellules dans des conditions normalisées sur une période de temps de plusieurs heures à plusieurs jours suivie d’une analyse quantitative des données ⁴. Ici, nous présentons l’imagerie à cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA), qui combine l’utilisation de réseaux microstructurés avec la microscopie time-lapse et l’analyse automatisée d’images.

Plusieurs méthodes de génération de réseaux unicellulaires microstructurés ont été établies et publiées dans la littérature^5,6. Ici, nous décrivons brièvement le modelage des protéines initiées par plasma à micro-échelle (μPIPP). Un protocole détaillé de la fabrication de réseaux unicellulaires à l’aide de μPIPP se trouve également dans la référence^7. L’utilisation de réseaux unicellulaires permet l’alignement de milliers de cellules sur des points d’adhésion standardisés présentant des microenvironnements définis pour chaque cellule et réduit ainsi une source de variabilité expérimentale (Figure 1A). Les réseaux unicellulaires sont utilisés pour surveiller les cours de temps des marqueurs fluorescents destinés à indiquer une variété de processus cellulaires. La microscopie à long terme en mode time-lapse à balayage permet de surveiller une grande partie des réseaux unicellulaires et donc d’échantillonner des données unicellulaires à haut débit sur un temps d’observation de plusieurs heures, voire plusieurs jours. Cela génère des piles de lignes de temps d’images à partir de chaque position du tableau(Figure 1B). Afin de réduire la grande quantité de données d’image et d’extraire les cours de temps de fluorescence unicellulaire souhaités de manière efficace, un traitement d’image automatisé est nécessaire qui tire parti du positionnement des cellules(Figure 1C).

Le défi de LISCA est d’adapter les protocoles expérimentaux et les outils de calcul pour former un test à haut débit qui génère des données quantitatives et reproductibles de la cinétique cellulaire. Dans cet article, nous fournissons une description étape par étape des méthodes individuelles et de la façon dont elles sont combinées dans un test LISCA. À titre d’exemple, nous discutons le cours de temps de l’expression verte augmentée de la protéine fluorescente (eGFP) après la livraison artificielle d’ADN messagère. L’expression de l’eGFP après l’administration de l’ARNm est décrite par des équations de vitesse de réaction modélisant la traduction et la dégradation de l’ARNm. L’ajustement de la fonction du modèle pour l’évolution dans le temps de la concentration eGFP à la lecture LISCA de l’intensité de fluorescence pour chaque cellule individuelle au fil du temps donne les meilleures estimations des paramètres du modèle tels que le taux de dégradation de l’ARNm. Comme résultat représentatif nous discutons l’efficacité de livraison d’ADN messagère de deux agents lipide-basés différents de transfection et comment leurs distributions de paramètre diffèrent.

Figure 1: Représentation du flux de travail LISCA combinant (A) des réseaux unicellulaires micro-modelés (B) une microscopie time-lapse à balayage et (C) une analyse d’image automatisée de séries d’images enregistrées. Les réseaux unicellulaires sont constitués d’un motif bidimensionnel de carrés adhésifs cellulaires avec un interespace répulsif pour les cellules conduisant à un arrangement des cellules sur le micropattern, comme on peut le voir dans l’image à contraste de phase ainsi que l’image de fluorescence des cellules exprimant l’eGFP (A). L’ensemble de la zone microstructurée est entité en mode time-lapse de numérisation à plusieurs reprises en prenant des images à une séquence de positions(B). Les séries d’images enregistrées sont traitées pour lire l’intensité de fluorescence par cellule au fil du temps (C). Barres d’échelle: 500 μm(A),200 μm (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocole

Figure 2: Acquisition de données combinant des puces à ADN unicellulaires (A) avec une microscopie time-lapse à balayage (B). Dans le cadre de la préparation de l’expérience time-lapse, un réseau unicellulaire avec un micropattern 2D de carrés d’adhésion est préparé (1), suivi de l’ensemencement cellulaire et de l’alignement des cellules sur le micropattern (2) ainsi que de la connexion d’un système de perfusion à la lame à six canaux, ce qui permet la manipulation du liquide lors de la mesure time-lapse (3). Une expérience time-lapse à balayage est mise en place (4) et les cellules sont transfectées au microscope en injectant une solution lipoplexe d’ARNm à travers le système de perfusion pendant l’expérience time-lapse (5). Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Fabrication de réseaux unicellulaires microstructurés (Figure 2A)

1. Préparer les matériaux nécessaires à la fabrication des matrices μPIPP.
   1. Préparer une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à un pH de 7,4.
   2. Préparer de l’eau ultrapure stérile avec une résistivité d’au moins 18 MΩcm à 25 °C.
   3. Préparer la solution de travail PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) avec une concentration de 2 mg/mL de PLL-PEG dans de l’eau ultrapure contenant 150 mM de NaCl et 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES).
   4. Préparer une solution de protéines à matrice extracellulaire pour le revêtement de surface : 1 mg/mL de fibronectine (FN) dans du PBS.
   5. Préparez une plaquette de silicium avec un micropattern fabriqué par photolithographie⁸ qui fonctionne comme un maître réutilisable. Le micropattern se compose de carrés d’une longueur de bord de 30 μm, d’une profondeur de 12 μm et d’une distance inter-carrée de 60 μm, disposés en six bandes ayant chacune une largeur de 6 mm et une hauteur de 18 mm.
2. Mélanger un monomère de polydiméthylsiloxane (PDMS) avec un réticulation à 9% (masse %) à l’aide d’un kit d’élastomère en silicone et dégazez-le pendant environ 30 min jusqu’à ce qu’il soit sans bulles à l’aide d’un dessécateur. Faites couler la plaquette de silicium avec une couche PDMS d’environ 3 à 5 mm d’épaisseur et dégazez-la à nouveau pendant environ 30 minutes jusqu’à ce qu’elle soit sans bulles.
   1. Mettez la plaquette de silicium avec le PDMS dans un four à cuisson à 50 °C pour durcir le PDMS pendant au moins 4 h.
3. Coupez les tampons PDMS.
   1. Utilisez un scalpel et découpez dans la couche PDMS un chef-d’œuvre PDMS qui contient les six bandes micropattern.
   2. Placez le chef-d’œuvre PDMS sur un banc avec le micropattern tourné vers le haut.
   3. Coupez chacune des six bandes micropattern du chef-d’œuvre PDMS avec une lame de rasoir dans un timbre PDMS. Veillez à ce que les bords des tampons PDMS soient ouverts en coupant une partie de la zone à motifs.
4. Placez les tampons PDMS sur une lame de couverture d’une glissière à six canaux(Figure 3-1).
   1. Utilisez une lame de couverture non revêtue et marquez les positions des canaux de la glissière à six canaux en rayant soigneusement la feuille de protection de la lame de couverture. Ensuite, placez la lamelle sur le banc avec la feuille de protection orientée vers le bas.
   2. Placez les tampons PDMS avec le micropattern orienté vers le bas sur la lamelle de couverture aux positions de canal marquées à l’aide d’une pince à épiler.
   3. Vérifiez la fixation des tampons PDMS au microscope. Si un tampon PDMS est entièrement attaché à la lamelle de couverture, les carrés en contact apparaissent plus sombres que l’interespace. La fixation du tampon PDMS à la lamelle de couverture est cruciale pour la qualité du micropattern.
5. Placez la lamelle de couverture avec les six tampons PDMS dessus dans un nettoyant au plasma et traitez-la avec du plasma d’oxygène (pression de 0,2 mbar, ~ 40 W pendant 3 min) pour rendre les surfaces entre les tampons PDMS et la lamelle hydrophile(Figure3-2).
6. Effectuez toutes les étapes ultérieures de la fabrication du micropattern dans une armoire de biosécurité. Utilisez 15 μL de la solution PLL-PEG et pipettez-en une goutte à côté de chaque tampon PDMS afin que la solution PLL-PEG soit absorbée dans le motif hydrophile du tampon PDMS(Figure3-3). Laisser incuber le PLL-PEG pendant 20 min à température ambiante.
7. Rincez 1 mL d’eau ultrapure sur la lamelle de couverture avec les tampons PDMS dessus et retirez les tampons PDMS à l’aide d’une pince à épiler(Figure3-4). Rincez ensuite la lame de couverture une deuxième fois avec 1 mL d’eau ultrapure et laissez sécher.
8. Lorsque la lame de couverture a complètement séché, collez une glissière collante à six canaux sur la lame de couverture(Figure 3-4). Veillez à ce que les zones micropatternées s’alignent sur le bas des canaux.
9. Fonctionnaliser les carrés d’adhésion avec FN.
   1. Remplissez 40 μL de PBS dans chaque canal.
   2. Préparer une solution FN de 100 μg/mL dans du PBS.
   3. Ajouter 40 μL de la solution FN à chaque canal(Figure 3-5). Mélanger soigneusement la solution FN avec le PBS dans le canal en enlevant 40 μL d’un réservoir et en l’ajoutant au réservoir opposé du même canal pendant 3 fois pour générer une solution homogène. Incuber la solution FN pendant 45 min à température ambiante.
   4. Laver chaque canal trois fois avec 120 μL de PBS(figure3-6).
10. Afin de vérifier la qualité du motif, utilisez un FN marqué par fluorescence à l’étape 9.2. (Figure 4A).
    REMARQUE: Nous recommandons de préparer le réseau de μPIPP pas plus d’un jour avant l’ensemencement cellulaire, car le PLL-PEG et le FN ne sont pas liés de manière covalente au substrat et la qualité du motif peut diminuer avec le temps. Conservez le réseau de μPIPP préparé au réfrigérateur.

Figure 3: Fabrication de microréseaux unicellulaires par μPIPP. (1) Les tampons PDMS avec une structure micropattern tridimensionnelle à la surface sont disposés sur une lame de couverture d’une lame à six canaux. (2) La lamelle de couverture avec les tampons PDMS dessus est traitée avec du plasma d’oxygène pour rendre les surfaces hydrophiles. (3) Pll-PEG est ajouté. Il est absorbé dans la microstructure par des forces capillaires et rend les surfaces non couvertes par le répulsif cellulaire d’estampille PDMS. (4) La lamelle est rincée à l’eau pour éliminer le PLL-PEG restant. Ensuite, les tampons PDMS sont retirés et une glissière collante à six canaux est collée à la lame de couverture. (5) La fibronectine, une protéine de la matrice extracellulaire, est ajoutée pour rendre les zones sans adhésif cellulaire PLL-PEG. (6) La lame à six canaux est lavée avec une solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Ensemencement cellulaire( Figure 2A)

REMARQUE: Pour les étapes de lavage suivantes, ajoutez le liquide respectif à un réservoir, puis retirez un volume égal de liquide du réservoir opposé d’un canal.

1. Laver chaque canal avec 120 μL de milieu de croissance cellulaire entièrement complété à 37 °C. Avant d’ajouter la suspension cellulaire, assurez-vous que seuls les canaux sont remplis de milieu, mais pas les réservoirs.
2. Détachez les cellules HuH7 d’une fiole de culture cellulaire en suivant votre protocole standard pour le passaging cellulaire et ajustez la concentration de la suspension cellulaire à 4 x 10⁵ cellules/mL.
3. Ajouter 40 μL de suspension cellulaire et mélanger le milieu de croissance cellulaire avec la suspension cellulaire en retirant 40 μL d’un réservoir et en l’ajoutant au réservoir opposé du même canal pendant 3 fois pour atteindre une distribution cellulaire homogène(figure 4B).
4. Retirez 40 μL de suspension du canal afin que seul le canal soit rempli de suspension cellulaire.
5. Mettez la lame dans un incubateur et vérifiez l’adhérence cellulaire 1 h après l’ensemencement à l’aide d’un microscope à contraste de phase.
6. Ajouter 120 μL de milieu de croissance des cellules chaudes à 37 °C.
7. Mais la glissade dans l’incubateur pour encore 3 h pour permettre l’auto-organisation cellulaire sur le micropattern (Figure 4C).

Figure 4: Auto-organisation cellulaire et contrôle de la qualité du réseau μPIPP. (A) La surface microstructurée est constituée de taches d’adhérence carrées revêtues de FN représentées en rouge entourées d’un polymère anticellulaire. (B) Après l’ensemencement cellulaire, les cellules HuH7 sont distribuées aléatoirement et (C) adhèrent principalement sur les taches d’adhésion sur une période de temps de 4 h. Réimprimé avec permission ⁷. Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Système de perfusion (Figure 2A)

REMARQUE: L’utilisation d’un système de perfusion n’est requise que si des réactifs ou des marqueurs fluorescents doivent être ajoutés au cours de la mesure du laps de temps. Selon vos besoins, vous pouvez connecter chaque canal à un système de perfusion séparé ou connecter plusieurs canaux en série au même système de perfusion. Le nombre de systèmes de perfusion correspond au nombre de conditions expérimentales indépendantes. Connectez les tubes dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité et évitez l’inclusion de bulles d’air dans le système de perfusion. Si aucun système de perfusion n’est utilisé, ajouter les réactifs/marqueurs dans une armoire de biosécurité avant la mesure du time-lapse. Le système de perfusion est fabriqué en interne, le matériau utilisé est répertorié dans la table des matériaux. L’assemblage du système de perfusion a été décrit précédemment^9.

1. Utilisez une seringue de 1 mL (avec sporn de remplacement) et remplissez la seringue avec 1 mL de milieu de croissance cellulaire à 37 °C.
2. Connectez la seringue au tube d’entrée à l’aide de la valve et remplissez le tube de milieu.
3. Connectez le tube d’entrée à un réservoir d’un canal et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée.
4. Pour connecter un autre canal en série à ce système de perfusion, connectez un connecteur série au réservoir opposé au tube d’entrée du canal de courant. Passez au canal suivant et connectez l’extrémité libre du connecteur série à l’un de ses réservoirs.
5. Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que le nombre requis de canaux soit connecté en série.
6. Connectez le tube de sortie directement au réservoir libre du canal de courant. Remplissez le tube connecté avec un milieu afin de vérifier que le système de perfusion ne fuit pas.
7. Répétez les étapes précédentes jusqu’à ce que les six canaux de la lame soient connectés à un système de perfusion.
8. Replacez la lame avec le ou les systèmes de perfusion connectés dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ou placez-la directement dans la chambre chauffante du microscope préchauffé à 37 °C pour la mesure du time-lapse.

4. Microscopie time-lapse (Figure 2B)

NOTA : Pour les mesures à long terme, maintenir une température stable de 37 °C et un niveau stable de CO_2. Comme alternative au milieu de croissance cellulaire dépendant du CO_2,utilisez le milieu L15 pour lequel aucun système d’incubation de gaz n’est requis.

REMARQUE: Pour l’imagerie quantitative, utilisez un milieu de croissance cellulaire sans rouge de phénol pendant la mesure time-lapse pour réduire la fluorescence de fond et utilisez les mêmes paramètres du protocole time-lapse ainsi que le même microscope pour les répétitions techniques.

1. Mettre en place un protocole time-lapse pour enregistrer une image à contraste de phase et une image de fluorescence avec des temps d’exposition de 750 ms (selon la caméra), un intervalle de temps de 10 minutes entre les boucles consécutives à travers la liste de positions et un temps d’observation de 30 h, en utilisant un objectif 10x et des filtres de fluorescence appropriés.
2. Placez la lame à six canaux avec les cellules sur les réseaux unicellulaires dans le porte-échantillon de la chambre chauffante chaude à 37 °C. Si les systèmes de perfusion sont connectés à la lame à six canaux, fixez les tubes à la scène à l’aide de ruban adhésif pour vous assurer que la lame à six canaux n’est pas déplacée pendant l’échange de liquide. Insérer les extrémités libres des tubes de sortie à travers un trou d’un tube de réaction de 15 mL pour recueillir les déchets liquides.
3. Définissez la liste de positions pour la mesure time-lapse d’analyse. Assurez-vous que le nombre de positions peut être analysé dans l’intervalle de temps défini entre les boucles consécutives via la liste des positions. Avec un objectif 10x, 10-30 positions par canal peuvent être réglées pour scanner la surface totale du micropattern en fonction de la taille de la puce de la caméra.
4. Démarrez la mesure time-lapse. Pour une meilleure qualité d’image des mesures à long terme, utilisez un système automatisé de correction de la mise au point.

5. Marqueur fluorescent - transfection de l’ARNm (Figure 2B)

REMARQUE: Pour une transfection dans deux canaux reliés par un système de tubes, un volume total de 600 μL de mélange de transfection est nécessaire (300 μL pour un canal). Les volumes indiqués se réfèrent à une transfection en deux canaux connectés.

1. Préparer une solution d’agent de transfection en diluant 1 μL d’agent de transfection dans 200 μL de milieu sérique réduit et laisser la solution incuber pendant 5 min à température ambiante.
2. Préparer une solution d’ARNm en diluant 300 ng d’ARNm codant pour l’eGFP dans 150 μL de milieu sérique réduit.
3. Préparer le mélange de transfection en ajoutant 150 μL de la solution d’agent de transfection à la solution d’ARNm et bien le mélanger. Laisser le mélange de transfection incuber pendant 20 min à température ambiante.
4. Rincer le système de tubes avec 1 mL de PBS chaud à 37 °C à l’aide d’une seringue pendant l’incubation du mélange de transfection. Lorsque vous rincez les tubes, assurez-vous que l’étage du microscope ne bouge pas. Suspendez la mesure time-lapse si nécessaire.
5. Diluer le mélange de transfection à la concentration finale d’ARNm de 0,5 ng/μL en ajoutant 300 μL de milieu sérique réduit.
6. Rincer le système de tubes avec le mélange de transfection à l’aide d’une seringue et laisser les lipoplexes à ARNm incuber pendant 1 h (suspendre la mesure du time-lapse si nécessaire).
7. Arrêtez l’incubation de la transfection et éliminez les lipoplexes d’ARNm non liés en les lavant avec 1 mL de milieu de croissance cellulaire chaud entièrement complété à 37 °C à l’aide d’une seringue (suspendez la mesure du time-lapse si nécessaire).

6. Analyse d’image et lecture de fluorescence

1. Lors de la première exécution de l’analyse d’image, installez la version 0.1.6 du logiciel open source « Automated Microstructure Analysis in Python » (PyAMA) à partir de l’emplacement^{cité 10} selon les instructions qui y sont fournies.
2. Assurez-vous que les canaux d’image (contraste de phase et fluorescence) sont disponibles sous forme de fichiers TIFF 16 bits multi-images. Si nécessaire, convertissez-les en conséquence.
3. Démarrez PyAMA et cliquez sur Ouvrir la pile ... pour ouvrir les images pour l’analyse.
4. Pour chaque fichier TIFF multi-image à ouvrir, cliquez sur Ouvrir et sélectionnez le fichier afin qu’il s’affiche dans la liste des fichiers chargés sur le côté gauche de la boîte de dialogue (Figure 5-1).
5. Marquez les canaux à inclure dans l’analyse. Pour chaque canal, procédez comme suit.
   1. Sélectionnez dans la liste des fichiers chargés le fichier TIFF contenant le canal.
   2. Dans la section Ajouter un nouveau canal, sélectionnez l’index du canal dans le fichier TIFF. L’indexation est de base zéro ; le premier canal a l’index 0, le deuxième canal a l’index 1 et ainsi de suite.
   3. Sélectionnez le type de canal. Sélectionnez Contraste de phase ou Fluorescence pour les canaux d’image correspondants et Segmentation pour un canal binaire indiquant les contours de cellule.
   4. Éventuellement, entrez une étiquette du canal pour distinguer les différents canaux de fluorescence: eGFP et DAPI.
   5. Après avoir configuré le canal, cliquez sur Ajouter.
6. Lorsque tous les canaux ajoutés sont affichés dans la liste des canaux sur le côté droit de la boîte de dialogue, cliquez sur OK pour charger la pile.
7. Pour effectuer une segmentation à l’aide de l’algorithme de segmentation intégré de PyAMA pour la reconnaissance de cellules basée sur les images à contraste de phase(Figure 5-2),accédez à Outils | Binariser... et entrez un nom de fichier pour le fichier NumPy avec le canal binarisé.
   Remarque : dans la version actuelle, le chargement du canal binarisé nécessite le rechargement de tous les canaux.
8. Pour effectuer une correction de fond¹¹ sur un canal de fluorescence(figure 5-3), assurez-vousque le canal de fluorescence et un canal de segmentation sont chargés. Si aucun canal de segmentation n’est chargé, assurez-vous qu’un canal à contraste de phase est chargé pour la segmentation automatique. Allez dans « Outils > correction d’arrière-plan... » et sélectionnez un nom de fichier pour le fichier TIFF résultant avec le canal de fluorescence corrigé.
   Remarque : dans la version actuelle, le chargement du canal corrigé en arrière-plan nécessite le rechargement de tous les canaux.
9. Inspectez les cellules présélectionnées(Figure 5-4)et leur signal de fluorescence intégré(Figure 5-5)en faisant défiler les délais, en affichant les canaux répertoriés dans le menu des canaux sur le côté gauche et en cliquant sur les cellules pour mettre en évidence leurs cours de temps de fluorescence(Figure 1C). Utilisez la sélection cellulaire pour exclure de l’analyse ultérieure les cellules qui ne sont pas viables, qui ne sont pas confinées à un point d’adhésion ou qui ne sont pas attachées à une autre cellule. Basculez la sélection des cellules pour la lecture en appuyant sur Maj et en cliquant sur la cellule, ou en mettant la cellule en surbrillance et en appuyant sur Entrée.
10. Enregistrez les cours de temps unicellulaires pour la zone cellulaire et la fluorescence intégrée (Figure 5-6) en cliquant sur Fichier | Enregistrez et sélectionnez un répertoire dans lequel enregistrer.

Figure 5: Traitement automatisé des images en accéléré à l’aide de PyAMA. (1) Des séries d’images à contraste de phase et à fluorescence sont importées pour chaque position d’imagerie. (2) Les contours des cellules sont déterminés par segmentation sur la pile d’images à contraste de phase. (3) Une correction de fond est appliquée aux images de fluorescence. (4) Les contours des cellules sont suivis au fil du temps et présélectionnés pour l’exportation. (5) L’intensité de fluorescence est intégrée en fonction des contours des cellules suivies. (6) Les zones cellulaires unicellulaires et les intensités de fluorescence intégrées sont évaluées et les cours de temps pour chaque cellule sont exportés. Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Pour analyser la cinétique de traduction après transfection d’ARNm, ajuster un modèle de translation basé sur des équations de taux biochimiques à chaque cours de temps unicellulaire comme décrit précédemment par Reiser et al.^12. Les données et le code utilisés dans cette étude sont accessibles au public¹³.
2. Pour chaque cours de temps unicellulaire, récupérez les paramètres d’ajustement estimés du modèle de translation qui représentent le taux de dégradation de l’ARNm et le point temporel du début de la translation. Un exemple d’ensemble de données est abordé dans la section des résultats représentatifs.
3. Effectuer une analyse plus approfondie des distributions des meilleures estimations des paramètres pour diverses conditions expérimentales afin d’étudier la variabilité de cellule à cellule au sein des populations cellulaires.

Résultats

L’approche LISCA permet de collecter efficacement les cours de temps de fluorescence à partir de cellules individuelles. À titre d’exemple représentatif, nous décrivons comment la méthode LISCA est appliquée pour mesurer l’expression eGFP unicellulaire après transfection. Les données de l’expérience LISCA sont utilisées pour évaluer la cinétique d’administration de l’ARNm, ce qui est important pour le développement de médicaments à ARNm efficaces.

En particulier, nous démontrons l’impact diffé...

Discussion

Ici nous avons décrit LISCA comme technique polyvalente pour suivre la cinétique cellulaire des étiquettes fluorescentes intracellulaires au niveau unicellulaire. Afin d’effectuer une expérience LISCA réussie, chacune des étapes décrites de la section de protocole doit être établie individuellement, puis toutes les étapes doivent être combinées. Chacun des trois aspects majeurs de LISCA comporte des étapes cruciales.

Fabrication de puces à ADN unicellulaires
La qualité du microrése...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Adtech Polymer Engineering Microtubes PTFE  ;	Fisher Scientific	10178071
four de cuisson	Binder	9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x	Nikon	MRH20100
Desiccatateur	Roth	NX07.1
Eclipse Ti-E	Nikon
eGFP mRNA	Trilink	L-7601
Connecteur Luer à Tube femelle	MEDNET	FTL210-6005
Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher	10270106
Fibronectine	Yo Proteins	663
Jeu de filtres eGFP	AHF	F46-002
Fisherbrand  ; Tube en silicone translucide durci au platine	Fisher Scientific	11768088
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
Boîte d’incubation	Okolab	OKO-H201
Liant		9040-0012
L-15 sans rouge de phénol	Thermo Fisher	21083027
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher
Luer			fabriqué en interne composé d’un
connecteur Luer mâle en	MEDNET	MTLS210-6005	alternative aux Luers mâles fabriqués en interne
NaCl (5 M)	Thermo Fisher	AM9760G
Valve sans aiguille à connecteur Luer mâle	MEDNET	NVFMLLPC
NIS Elements	Nikon		Logiciel d’imagerie Version 5.02.00
NOA81	Thorlabs	NOA81	Adhésif optique à durcissement rapide pour l’assemblage de systèmes de tubes
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO	pco
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)			préparé en interne
	Diener Femto	Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)	SuSoS AG
plaquette de silicium mit mircorstructures			fabriqué en interne
Sola Light Engine	Lumencor
sticky slide VI 0.4  ;	ibidi	80608
Sylgard 184 Kit Élastomère Silicone	Dow Corning	1673921
Tango 2	Mä ; rzhä ; utilisateur	00-24-626-0000
Eau			préparée en interne
lamelles non couchées	ibidi	10813
Injekt-F Solo, 1 mL	Omilab	9166017V	avec sporn de remplacement