Nous présentons une méthode pour l’acquisition des cours de temps de rapporteur de fluorescence à partir de cellules simples utilisant des réseaux micropatterned. Le protocole décrit la préparation de réseaux unicellulaires, la mise en place et le fonctionnement de la microscopie time-lapse à balayage de cellules vivantes et un outil d’analyse d’image open source pour la présélection automatisée, le contrôle visuel et le suivi des cours de temps de fluorescence intégrés aux cellules par site d’adhésion.
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Article de méthode
Imagerie à cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA) - une technique polyvalente pour quantifier la cinétique cellulaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’imagerie par cellules vivantes de réseaux unicellulaires (LISCA) est une méthode polyvalente pour collecter des cours temporels de signaux de fluorescence à partir de cellules individuelles à haut débit. En général, l’acquisition de cours de temps unicellulaires à partir de cellules cultivées est entravée par la motilité cellulaire et la diversité des formes cellulaires. Les microréseaux adhésifs standardisent les conditions unicellulaires et facilitent l’analyse d’images. LISCA combine des puces à ADN unicellulaires avec une microscopie time-lapse à balayage et un traitement d’image automatisé. Ici, nous décrivons les étapes expérimentales de la prise de cours de temps de fluorescence unicellulaire dans un format LISCA. Nous transfectons les cellules adhérentes à un réseau micropatterned utilisant le codage d’ARNm pour la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et surveillons la cinétique d’expression eGFP de centaines de cellules en parallèle via la microscopie time-lapse de balayage. Les piles de données d’image sont automatiquement traitées par un logiciel nouvellement développé qui intègre l’intensité de fluorescence sur les contours cellulaires sélectionnés pour générer des cours de temps de fluorescence unicellulaires. Nous démontrons que les cours de temps d’expression d’eGFP après transfection d’ADN messagère sont bien décrits par un modèle de traduction cinétique simple qui révèle des taux d’expression et de dégradation de l’ARNm. D’autres applications de LISCA pour des corrélations de temps d’événement des marqueurs multiples dans le cadre de l’apoptosis de signalisation sont discutées.
Introduction
Ces dernières années, l’importance des expériences unicellulaires est devenue évidente. Les données des cellules individuelles permettent d’enquêter sur la variabilité de cellule à cellule, la résolution des corrélations de paramètres intracellulaires et la détection de la cinétique cellulaire qui reste cachée dans les mesures d’ensemble1,2,3. Afin d’étudier la cinétique cellulaire de milliers de cellules individuelles en parallèle, de nouvelles approches sont nécessaires qui permettent de surveiller les cellules dans des conditions normalisées sur une période de temps de plu....
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Protocole
Figure 2: Acquisition de données combinant des puces à ADN unicellulaires (A) avec une microscopie time-lapse à balayage (B). Dans le cadre de la préparation de l’expérience time-lapse, un réseau unicellulaire avec un micropattern 2D de carrés d’adhésion est préparé (1), suivi de l’ensemencement cellulaire et de l’alignement des cellules sur le micropattern (2) ainsi que de la connexion d’un système de perfusion à la lame à six canaux, ce qui permet la manipulation du liquide lors de la mesure time-lapse....
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Résultats
L’approche LISCA permet de collecter efficacement les cours de temps de fluorescence à partir de cellules individuelles. À titre d’exemple représentatif, nous décrivons comment la méthode LISCA est appliquée pour mesurer l’expression eGFP unicellulaire après transfection. Les données de l’expérience LISCA sont utilisées pour évaluer la cinétique d’administration de l’ARNm, ce qui est important pour le développement de médicaments à ARNm efficaces.
En particulier, nous démontrons l’impact diffé.......
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Discussion
Ici nous avons décrit LISCA comme technique polyvalente pour suivre la cinétique cellulaire des étiquettes fluorescentes intracellulaires au niveau unicellulaire. Afin d’effectuer une expérience LISCA réussie, chacune des étapes décrites de la section de protocole doit être établie individuellement, puis toutes les étapes doivent être combinées. Chacun des trois aspects majeurs de LISCA comporte des étapes cruciales.
Fabrication de puces à ADN unicellulaires
La qualité du microrése.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation allemande pour la science (DFG) au Centre de recherche collaborative (SFB) 1032. Le soutien du ministère fédéral allemand de l’Éducation, de la Recherche et de la Technologie (BMBF) dans le cadre du projet coopératif 05K2018-2017-06716 Medisoft ainsi qu’une subvention de la Bayerische Forschungsstiftung sont vivement appréciés. Anita Reiser a été soutenue par une bourse DFG de la Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Adtech Polymer Engineering Microtubes PTFE ; | Fisher Scientific | 10178071 | |
| four de cuisson | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Desiccatateur | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Connecteur Luer à Tube femelle | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Sérum fœtal bovin | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectine | Yo Proteins | 663 | |
| Jeu de filtres eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand ; Tube en silicone translucide durci au platine | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Boîte d’incubation | Okolab | OKO-H201 | |
| Liant | 9040-0012 | ||
| L-15 sans rouge de phénol | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | ||
| Luer | fabriqué en interne composé d’un | ||
| connecteur Luer mâle en | MEDNET | MTLS210-6005 | alternative aux Luers mâles fabriqués en interne |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Valve sans aiguille à connecteur Luer mâle | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Logiciel d’imagerie Version 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Adhésif optique à durcissement rapide pour l’assemblage de systèmes de tubes |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | préparé en interne | ||
| Diener Femto | Pico-BRS | ||
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| plaquette de silicium mit mircorstructures | fabriqué en interne | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 ; | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Kit Élastomère Silicone | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Mä ; rzhä ; utilisateur | 00-24-626-0000 | |
| Eau | préparée en interne | ||
| lamelles non couchées | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | avec sporn de remplacement |
Références
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).....
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Réimpressions et autorisations
