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Article de méthode

Emplacement, dissection et analyse du ganglion radié murin

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DOI :

10.3791/62026

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22 décembre 2020

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1Division of Cardiology, EVK Düsseldorf, cNEP, cardiac Neuro- and Electrophysiology Research Consortium, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 3Institute of Neural and Sensory Physiology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 4Clinic for Cardiology, University Heart & Vascular Centre, University Hospital Hamburg-Eppendorf, 5Department of Cardiology, Leiden University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Les changements pathophysiologiques du système nerveux autonome cardiaque, particulièrement dans sa branche sympathique, contribuent au début et à l’entretien des arythmies ventriculaires. Dans le protocole actuel, nous montrons comment caractériser les ganglions radiés murins pour améliorer la compréhension des processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.

Résumé

Le système nerveux autonome est un moteur important de l’électrophysiologie cardiaque. Particulièrement le rôle de sa branche sympathique est une question continue de recherche dans la pathophysiologie des arythmies ventriculaires (VA). Les neurones dans les ganglions étoilés (SG)   – structures bilatérales en forme d’étoile de la chaîne sympathique –   sont une composante importante de l’infrastructure sympathique. Le SG sont une cible identifiée pour le traitement par l’intermédiaire de l’énervation sympathique cardiaque dans les patients présentant le VA thérapie-réfractaire. Tandis que la retouche neuronale et l’activation glial dans le SG ont été décrites dans les patients présentant le VA, les processus cellulaires et moléculaires fondamentaux qui précèdent potentiellement le début de l’arythmie sont seulement insuffisamment compris et devraient être élucisés pour améliorer la modulation autonome. Les modèles murins nous permettent d’étudier le remodelage neuronal sympathique, mais l’identification du SG murin est difficile pour l’investigateur inexpérimenté. Ainsi, les études biologiques cellulaires et moléculaires approfondies du SG murin font défaut pour beaucoup de maladies cardiaques communes. Ici, nous décrivons un répertoire de base pour disséquer et étudier le SG chez les souris adultes pour des analyses au niveau de l’ARN (isolement de l’ARN pour les analyses d’expression génique, hybridation in situ), au niveau des protéines (coloration immunofluorescente de monture entière) et au niveau cellulaire (morphologie de base, mesure de la taille cellulaire). Nous présentons des solutions potentielles pour surmonter des défis dans la technique de préparation, et comment améliorer la souillure par trempe de l’autofluorescence. Cela permet la visualisation des neurones ainsi que des cellules gliales via des marqueurs établis afin de déterminer la composition cellulaire et les processus de remodelage. Les méthodes présentées ici permettent de caractériser le SG pour obtenir davantage d’informations sur le dysfonctionnement autonome chez les souris sujettes à VA et peuvent être complétées par des techniques supplémentaires étudiant les composants neuronaux et glial du système nerveux autonome dans le coeur.

Introduction

Le système nerveux autonome cardiaque est un équilibre étroitement régulé de composants sympathiques, parasympathiques et sensoriels qui permet au cœur de s’adapter aux changements environnementaux avec la réponse physiologique appropriée1,2. Des perturbations dans cet équilibre, par exemple, une augmentation de l’activité sympathique, ont été établies comme un facteur clé pour l’apparition ainsi que le maintien des arythmies ventriculaires (VA)3,4. Par conséquent, la modulation autonome, réalisée par l’intermédiaire de la réduction pharmacologique de l’activité sympathique avec des bêta-bloquants, a été une pierre angulaire dans le traitement des patients avec VA pendant des décennies5,6. Mais malgré les interventions pharmacologiques et à base de cathéter, un nombre pertinent de patients souffre toujours de VA7récurrent.

L’entrée sympathique au cœur est principalement médiée par l’intermédiaire de corps cellulaires neuronaux dans les ganglions étoilés (SG), structures bilatérales en forme d’étoile de la chaîne sympathique, qui relaient l’information via de nombreux nerfs intrathoraciques du tronc cérébral au cœur8,9,10. Le nerf germant du SG après blessure est associé à va et à la mort cardiaque subite11,12,soulignant le SG comme cible pour la modulation autonome13,14. Une réduction de l’apport sympathique au coeur peut être réalisée temporairement par injection percutanée d’anesthésiques locaux ou de façon permanente par retrait partiel du SG par thoracoscopie vidéo-assistée15,16. L’énervation sympathique cardiaque présente une option pour des patients présentant le VA thérapie-réfractaire avec des résultats prometteurs14,16,17. Nous avons appris de SG explanted de ces patients que le remodelage neuronal et neurochimique, la neuro-inflammation et l’activation glial sont des cachets du remodelage sympathique qui pourrait contribuer ou aggraver le dysfonctionnement autonome18,19. Pourtant, les processus cellulaires et moléculaires sous-jacents dans ces neurones restent obscurs à ce jour, par exemple, le rôle de la transdifférenciation neuronale dans un phénotype cholinergique20,21. Les études expérimentales présentent des approches nouvelles pour traiter l’AV, par exemple, la réduction de l’activité nerveuse sympathique via l’optogénétique22, mais la caractérisation en profondeur du SG fait encore défaut dans de nombreuses pathologies cardiaques qui vont de pair avec l’AV. Des modèles murins imitant ces pathologies permettent d’étudier le remodelage neuronal qui précède potentiellement l’apparition d’arythmies12,23. Ceux-ci peuvent être complétés par d’autres analyses morphologiques et fonctionnelles pour la caractérisation autonome du coeur et du système nerveux. Dans le protocole actuel, nous fournissons un répertoire de base des méthodes permettant de disséquer et de caractériser le SG murin pour améliorer l’entente de VA.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’État de Hambourg (ORG870, 959) et l’Agence d’État de Rhénanie-du-Nord-Westphalie pour la protection de la nature, de l’environnement et des consommateurs (LANUV, 07/11) et sont conformes au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (2011) des National Institutes of Health. Les études ont été réalisées sur des souris C57BL/6 mâles et femelles (âgées de 10 à 24 semaines) (numéro de stock 000664, Jackson Laboratories) et des souris homozygotes (db/db) ou hétérozygotes (db/het; contrôle) pour la mutation spontanée du diabète (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, numéro de stock 000642, Jackson Laboratories). Les auteurs ont utilisé les protocoles à portée de main sans variations pour les souris âgées jusqu’à 60 semaines.

1. Emplacement et dissection des ganglions radiés murins

REMARQUE: Même si les descriptions et les dessins sont principalement disponibles chez les espèces plus grandes, certaines publications ont déjà décrit l’emplacement du SG chez les rats24 et les souris25 en utilisant des méthodes anatomiques et des lignes rapporteurs fluorescentes, respectivement.

  1. Préparer 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) héparinisée (3-4 °C) (20 unités/mL, voir la table des matières)tamponnée au phosphate (PBS). Effectuer la dissection du SG à température ambiante (TA).
  2. Anesthésier profondément la souris par inhalation de 3%-5% d’isoflurane selon les directives institutionnelles et locales. Vérifier une anesthésie adéquate par perte de réflexe de retrait de la pédale. Décapiter les souris ou effectuer une luxation cervicale.
    REMARQUE: Une luxation cervicale incorrecte peut entraîner une rupture de la colonne vertébrale et des dommages aux vaisseaux thoraciques conduisant à des saignements qui entravent la préparation ou la section de la chaîne sympathique, de sorte que les SG ne sont pas dans leur position correcte. Par conséquent, il est essentiel que le personnel expérimenté effectue une luxation cervicale ou décapite des animaux sous sédation profonde.
  3. Vaporisez la peau avec de l’éthanol et ouvrez le thorax avec deux incisions le long des lignes axillaires antérieures à l’aide de ciseaux Mayo et de pinces à motif étroit. Coupez le diaphragme et retirez l’avant de la cage thoracique.
  4. Retirez l’emballage cœur-poumon en saisissant l’aorte et la veine cave juste au-dessus du diaphragme à l’aide de pinces de Londres et en coupant tous les vaisseaux et le tissu conjonctif près de la colonne vertébrale ci-dessous avec les ciseaux de strabisme.
  5. Rincer soigneusement le thorax avec du PBS héparinisé à l’aide d’une pipette jetable en plastique jusqu’à ce que toutes les traces de sang soient enlevées.
  6. Placez le torse sous des jumelles de préparation de stéréomicroscope et assurez un bon éclairage dans le thorax avec des sources de lumière externes.
  7. Localisez la première côte et les muscles du longus colli.
    NOTE : Les SG sont situés bilatéralement, parallèlement à la colonne vertébrale au niveau de la branche entre la première côte et la colonne vertébrale, dans une rainure latérale aux muscles longus colli24. Le côté plat du SG est situé à côté des muscles longus colli. Selon la préparation, des parties de la chaîne sympathique peuvent déjà être visibles sous forme de fibres blanches et obliques parallèles à la colonne vertébrale. Ceux-ci peuvent être tracés le long du SG.
  8. Utilisez doucement la pointe de la pince Dumont #5/45 pour exposer le tissu conjonctif latéral au muscle longus colli.
  9. Tournez la pince de 180 ° et utilisez le côté plat pour saisir le SG et le retirer avec une pression minimale.
  10. Répétez l’opération avec le deuxième SG.
  11. Placez les deux SG dans une capsule (6 cm de diamètre) remplie de PBS froid et inspectez avec le grossissement approprié. Si nécessaire, enlevez les vaisseaux en excès, le tissu adipeux et les nerfs plus gros.
    NOTE: Les ganglions autonomes sont entourés d’une capsule de tissu conjonctif constituée de fibres de collagène et de fibroblastes26,27. La perméabilité de ces capsules semble varier selon les espèces, différents types de ganglions26 et âge28. Retirez autant de tissu conjonctif que possible à l’aide de pinces Dumont #5/45 et, si nécessaire, de ciseaux à ressort.
  12. Selon l’objectif de l’expérience, passez à la section 2, 3 ou 5 de ce protocole.

2. Protocole d’immunohistochimie de montage entier

NOTE : Ce protocole est adapté des colorations cardiaques de montage entier4,29. Effectuer des étapes d’incubation pour chaque SG dans un puits d’une plaque de 96 puits et utiliser 100 μL (pour les solutions contenant des anticorps) à 200 μL (pour toutes les autres solutions) de la solution pour assurer une couverture complète. Vérifiez régulièrement la couverture et l’immersion correcte du SG avec des jumelles. Retirez les liquides manuellement à l’munis d’une pipette de 200 μL avec une pointe supplémentaire de 10 μL au-dessus de la pointe de 200 μL. Cela empêchera l’aspiration du SG dans la pointe de la pipette. Utilisez des solutions fraîchement préparées et des liquides stériles pour prévenir la croissance bactérienne.

  1. Fixer SG pour l’histologie pendant 2 h à droite dans le paraformaldéhyde sans méthanol à 4% (PFA)/PBS.
  2. Traiter les SG le plus rapidement possible, mais ils peuvent être conservés pendant 2-4 semaines à 4-6 °C dans du PBS avec 0,02% (p / v) d’azide de sodium à ce stade.
  3. Préparer la solution mère noire du Soudan (1% de noir du Soudan p / v dans 100% d’éthanol) pour la réduction de l’autofluorescence et l’amélioration du rapport signal / fond30. Dissoudre pendant 2-3 h sur un agitateur magnétique à TA.
    REMARQUE: Utilisez la solution mère pendant un maximum de 6 à 8 semaines, jetez-la plus tôt lorsque la sédimentation apparaît.
  4. Préparer la solution de travail noir du Soudan en centrifugant la solution mère pendant 30 min à pleine vitesse (13 000 x g)pour éliminer les débris et diluer le stock dans de l’éthanol à 70 % jusqu’à une concentration finale de 0,25 % de noir soudanais.
  5. Traiter sg avec l’eau de Javel de Dent pour améliorer la perméabilisation des anticorps31. Préparer fraîchement l’eau de Javel de Dent en mélangeant du méthanol (MeOH), une solution de peroxyde d’hydrogène à 30% (p/p) dansH2Oet du diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un rapport de 4:1:1. Ajouter 200 μL par SG et placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 1 h à TA.
  6. Effectuer une série meOH descendante pour la réhydratation en incubant pendant 10 min chacune sur un agitateur orbital : 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
  7. Effectuer la perméabilisation en incubant SG deux fois pendant 60 minutes chacune dans PBS/1% Triton-X-100 à droite.
  8. Retirez la solution de perméabilisation du SG et ajoutez la solution de travail noir du Soudan. Incuber pendant 2 h à droite sur un agitateur orbital.
  9. En attendant, préparer une solution bloquante en ajoutant 5% d’albumine sérique bovine (BSA) de qualité récepteur et 0,1% de Triton-X-100 dans du PBS un récipient de 15 mL et laisser dissoudre sur un agitateur à rouleaux pendant environ 5-10 min. Décanter à travers un filtre en papier pré-plissé pour enlever les débris.
  10. Retirez le noir soudan très soigneusement en inclinant la plaque et en pipetant soigneusement du côté droit.
    REMARQUE: Il n’est pas possible de voir le SG en noir soudan. Utilisez une source de lumière forte et travaillez lentement. À partir de cette étape, les SG sont tachés de noir, ce qui améliore la visibilité. Si un tissu conjonctif supplémentaire est vu entourant SG à ce stade, retirez-le à l’aide de dumont #5/45 pinces et ciseaux à ressort.
  11. Ajouter 200 μL de PBS/0,1 % de Triton-X-100 (PBS-T) et laver pendant 5 min à TA sur un agitateur orbital.
  12. Retirez PBS-T en l’aspirant avec une pipette et répétez 2 fois.
  13. Supprimer pbs; ajouter 200 μL de solution de blocage et incuber à 4 °C pendant la nuit sur un agitateur orbital.
  14. Le lendemain, préparez des solutions en ajoutant des anticorps primaires dans la solution bloquante. Adapter les concentrations d’anticorps des protocoles établis.
    REMARQUE : Inclure un SG comme témoin d’anticorps sans anticorps primaire (inubpé avec de l’anticorps préabsorbé par l’antigène ou des IgG, s’il est disponible, ou un tampon bloquant).
  15. Effectuer une incubation d’anticorps primaires pendant 36-48 h à 4 °C sur un agitateur orbital. Pour les mesures de la taille des cellules et la coloration des neurones sympathiques, utilisez des anticorps contre la tyrosine hydroxylase (voir le tableau des matériaux pour les recommandations d’anticorps).
    NOTA : Placez la plaque de 96 puits dans une chambre humide (p. ex., boîte en plastique doublée d’essuie-tout mouillés ddH2O) pour éviter l’évaporation à ce stade.
  16. Retirer soigneusement la solution d’anticorps et ajouter 200 μL de PBS-T. Placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 30 min.
  17. Retirez PBS-T et répétez l’étape de lavage 5 fois supplémentaires.
  18. Préparer la solution de travail d’anticorps secondaires en centrifugant des anticorps secondaires fluorescents marqués par Alexa pendant 1 min à pleine vitesse (13 000 x g)avant utilisation. Diluer les anticorps secondaires appropriés selon les anticorps primaires 1:500 dans la solution bloquante et ajouter à SG. Ajouter 1 μg/mL de bisbenzimide H33342 trichlorhydrate (coloration de Hoechst) si une coloration nucléaire est souhaitée. Incuber pendant 12-24 h à 4 °C sur un agitateur orbital.
  19. Retirer soigneusement la solution d’anticorps et ajouter 200 μL de PBS-T. Placer la plaque sur un agitateur orbital pendant 30 min.
  20. Retirez PBS-T et répétez l’étape de lavage 5 fois supplémentaires. Pour la dernière étape, utilisez PBS sans Triton.
  21. Pour l’encastrement, étaler 50-100 μL de milieu de montage fluorescent (voir la table des matériaux)sur une lame de verre et placer sous préparation des jumelles. Utilisez la pince Dumont #5/45 pour ramasser le SG de la plaque de 96 puits et éliminer l’excès de liquide en trempant une extrémité sur un papier filtre (p. ex. tampon de séchage Whatman) et placez-le sur la goutte.
  22. Utilisez la pince Dumont #5/45 pour corriger le positionnement avec le grossissement approprié.
  23. Placez doucement une lamelle de verre (20 mm x 20 mm) à côté du SG et descendez lentement.
    REMARQUE: L’utilisation d’un support de montage trop important entraînera un mouvement du SG ou un enchevêtrement des nerfs. Si cela se produit, retirez rapidement la lamelle et répétez les étapes 2.9-2.21.
  24. Laisser sécher les lames dans l’obscurité pendant la nuit à RT. Le stockage de l’échantillon taché est possible pendant au moins 4-6 semaines à 4 °C.

3. Hybridation in situ à montage entier

NOTE : L’hybridation in situ à montage entier du SG est adaptée de l’organe du corti32 et du protocole commercial de fluorescence in situ de l’ARN (voir tableau des matériaux). Obtenir des sondes pour les gènes d’intérêt et les tampons et solutions du fournisseur. Toutes les étapes d’incubation sont effectuées à RT, sauf mention contraire. Utilisez du PBS stérile. Si vous souhaitez colorer plusieurs SG dans un puits, utilisez au moins 150 μL de tampons et de solutions.

  1. Effectuez la dissection du SG comme décrit dans les étapes 1.1-1.13.
  2. Fixer SG pendant 1 h dans 200 μL de PFA/PBS sans MeOH à 4 % dans un puits d’une plaque de 96 puits placée sur un agitateur orbital.
  3. Laver SG trois fois pendant 30 min chacune dans 0,1% Tween-20/PBS sur un agitateur orbital.
  4. Déshydratez SG dans la série de MeOH/PBS par incubation suivante dans 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS, et 100% MeOH pendant 10 minutes chacun sur un agitateur orbital.
  5. Conservez SG à -20 °C dans 100% MeOH pendant la nuit.
  6. Le lendemain, préchauffez l’incubateur à 40 °C. Vérifiez la température avec un thermomètre.
  7. Réhydrater SG en série MeOH/PBS inverse (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) pendant 10 min chacun.
  8. Laver SG trois fois pendant 5 min chacune dans du PBS.
  9. En attendant, commencez à préchauffer les sondes par incubation à 40 °C pendant 10 min, puis par refroidissement pendant 10 min.
  10. Incuber sg dans 200 μL de protéase III pendant 15 min.
  11. Facultatif : Effectuer un traitement au noir du Soudan pour éteindre l’autofluorescence conformément aux sections 2.3, 2.4 et 2.8 de ce protocole si une coloration par immunofluorescence ultérieure est prévue.
  12. Laver sg dans 200 μL de 0,1% Tween-20/PBS 3x pendant 5 min chacun sur un agitateur orbital.
  13. Facultatif : Si une co-coloration avec plusieurs sondes est souhaitée, diluez la sonde Channel-2 (50x) et la sonde Channel-3 (50x) dans la sonde Channel-1 (1x).
  14. Couvrir sg avec 100 μL de sonde pour le gène d’intérêt et incuber pendant une nuit à 40 °C avec une légère agitation. Placer la plaque de 96 puits dans une chambre humide à 40 °C pour toutes les étapes d’incubation.
    REMARQUE : Inclure un SG comme témoin négatif, à l’aide d’une sonde contre un gène bactérien (p. ex., dihydro-dipicolinate réductase, Dapb)pour vérifier la liaison non spécifique des réactifs d’amplification dans les étapes ultérieures.
  15. Laver SG dans le tampon de lavage fourni 3x pendant 15 min chacun sur un agitateur orbital.
  16. Amp1-3, HRP-C1 et HRP-Blocker préchauffés à RT. Si la co-coloration avec la sonde Channel-2 et/ou Channel-2 est souhaitée, HRP-C2 et HRP-C3 préchauffés.
  17. Re-fixer SG pendant 10 minutes à droite dans 4% PFA/PBS sur un agitateur orbital.
  18. Laver SG dans 200 μL de tampon de lavage fourni 3x pendant 5 min chacun sur un agitateur orbital à RT.
  19. Pour l’amplification, incuber SG avec 100 μL d’Amp1 pendant 35 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
  20. Retirez soigneusement tout liquide et lavez sg dans 200 μL de tampon de lavage fourni 3x pendant 5 min chacun à RT sur un agitateur orbital.
  21. Incuber SG avec 100 μL d’Amp2 pendant 35 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
  22. Répétez l’étape 3.18.
  23. Incuber SG avec 100 μL d’Amp3 pendant 20 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
  24. Répétez l’étape 3.18.
  25. Incuber SG avec 100 μL de multiplex FL v2 HRP-C1 fourni pendant 20 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
  26. Répétez l’étape 3.18.
  27. Préparer l’anticorps secondaire conjugué à l’opale 1:1 000 dans 200 μL de tampon TSA fourni et incuber le SG pendant 35 min à 40 °C sur un agitateur orbital. Protéger de la lumière pendant l’incubation et à partir de cette étape.
  28. Répétez l’étape 3.18.
  29. Incuber SG dans 100 μL de multiplex FL v2 HRP-blocker fourni pendant 15 min à 40 °C sur un agitateur orbital.
  30. Répétez l’étape 3.18.
  31. Facultatif : Pour la co-coloration avec la sonde Channel-2, répétez les étapes 3.25-3.30 avec le multiplex FL v2 HRP-C2 fourni.
  32. Facultatif: Pour la co-coloration avec la sonde Channel-3, répétez les étapes 3.25-3.30 avec multiplex FL v2 HRP-C3 fourni.
  33. En cas de coloration immunofluorescente ultérieure, effectuez les étapes 2.13-2.25 de ce protocole.
  34. Incuber dans 1% BSA/PBS pendant 30 minutes sur un agitateur orbital.
  35. Incuber le SG pendant 30 min dans 1 μg/mL de trichlorhydrate de bisbenzimide H33342 (coloration de Hoechst) dans 1 % de BSA/PBS si une coloration nucléaire est souhaitée et/ou ajouter de l’agglutinine de germe de blé couplée à Alexa (WGA, 1:500) sur un agitateur orbital.
  36. Répétez l’étape 3.18.
  37. Incorporer comme décrit dans les étapes 2.19-2.22.

4. Imagerie et analyses des ganglions étoilés murins

  1. Effectuer la microscopie confocale du SG incorporé dans l’installation locale d’imagerie.
  2. Si des mesures de taille de cellule sont requises, l’image SG colorée pour la tyrosine hydroxylase (voir la table des matériaux)à un grossissement de 200x et prend 4-6 images aléatoires de chaque SG.
  3. Analysez les images à l’aide du logiciel ImageJ33 pour estimer la taille des cellules (par exemple, avec une table à stylet, voir Table des matériaux). Utilisez free hand selection, encerclez chaque cellule et cliquez sur Analyser | Mesure pour obtenir la surface cellulaire. Veillez à n’inclure que les cellules intactes et entièrement visibles qui sont situées bien dans le SG.
  4. À l’aide de cette méthode, effectuez une mesure d’environ 100 cellules par SG.
  5. Demandez à un investigateur aveuglé d’exécuter les étapes 4.2-4.3 si vous voulez comparer SG de différentes souris. Utilisez une distribution de fréquence dans un logiciel statistique pour visualiser les différences de taille entre les groupes34.

5. Analyses moléculaires des ganglions étoilés murins

REMARQUE : Incluez des contrôles en fonction de votre plan expérimental. Il pourrait s’agir de SG avec différents génotypes et fond de la maladie et/ou d’autres ganglions autonomes, tels que le ganglion cervical supérieur sympathique (situé dans la région du cou, voir la description détaillée dans Ziegler et al.35) ou les ganglions parasympathiques (tels que les ganglions intracardiaques, voir Jungen et al.4).

  1. Préparer un tube de 2 mL contenant 500 μL de solution de thiocyanate de phénol/guanidine (p. ex. Qiazol) par animal et préparer l’azote liquide pour le glaçage par choc ou envisager des solutions commerciales pour la protection de l’ARN (facultatif, voir le tableau des matériaux)36. Travaillez rapidement pour l’isolement de l’ARN.
  2. Effectuez la dissection du SG comme décrit dans les étapes 1.1-1.13.
  3. Plongez immédiatement les deux SG directement dans un tube avec une solution de thiocyanate de phénol/guanidine et un tube de choc-gel dans de l’azote liquide.
  4. Conserver à -80 °C jusqu’à la transformation ultérieure.
  5. Pour la lyse tissulaire, laisser les tubes contenant du SG décongeler jusqu’à ce que la solution de thiocyanate de phénol/guanidine soit liquéfiée et ajouter deux billes d’acier inoxydable de 7 mm. Refroidir les parties métalliques de l’homogénéisateur tissulaire (broyeur à billes ou à mélangeurs, p. ex. Tissue Lyser II) sur de la glace carbonique et centrifuger à 4 °C.
  6. Tubes à centrifuger à 500 x g pendant 1 min à 4 °C de sorte que SG soit au fond du tube.
  7. Mettez des tubes dans les parties métalliques de la lyseuse tissulaire et lysez pendant 1 min à 20 Hz.
  8. Répétez les étapes 5.6 et 5.7 jusqu’à 5 fois jusqu’à ce qu’aucun tissu intact ne soit détectable.
  9. Transférer le liquide dans un tube frais de 1,5 mL.
  10. Effectuez l’isolement de l’ARN avec un kit d’isolation de l’ARN à base de colonnes (par exemple, mini-kit miRNeasy) conformément aux instructions du fabricant.
  11. Éluer l’ARN dans 20 μL d’eau sans RNase et mesurer la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre.
    REMARQUE: Pour exclure la contamination de l’ARN purifié par l’ADN génomique, nous proposons d’effectuer une réaction en chaîne de la polymérase avec des amorces génomiques et 1 μL d’ARN comme modèle, moins le contrôle de la transcriptase inverse. Cela permettra d’économiser une quantité importante d’ARN. Si l’ARN est contaminé, utilisez des amorces limites d’exon-intron ou des amorces flanquantes d’intron pour une réaction en chaîne de la polymérase quantitative en temps réel ultérieure.
  12. Utilisez 250 ng d’ARN SG pour effectuer la synthèse de l’ADNc et utilisez les protocoles établis. Ici, un kit de transcription inverse de l’ADNc de grande capacité a été utilisé conformément aux instructions du fabricant.
  13. Diluer à une concentration finale de 2,5 ng/μL d’ADNc et effectuer une réaction quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel avec les sondes appropriées conformément aux protocoles établis. Ici, le test TaqMan (voir la table des matériaux)a été effectué en utilisant 10 ng d’ADNc par réaction.
    Remarque : effectuez un contrôle sans modèle pour chaque gène afin d’exclure les résultats faussement positifs.
  14. Normaliser l’expression génique de votre gène d’intérêt sur un gène de ménage (p. ex. Cdkn1b)pour comparer l’expression génique relative entre différents groupes de SG.

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Résultats

La figure 1 montre comment identifier et disséquer le SG. La figure 1A montre un dessin schématique de l’emplacement, tandis que la figure 1B présente la vue dans le thorax après le retrait de l’emballage cœur-poumon. Les muscles gauches et droits de colli de longus médiaux du SG et de la cage thoracique sont des points de repère importants pour l’orientation. La dissection est effectuée le long des lignes pointillées entre les musc...

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Discussion

La compréhension des processus cellulaires et moléculaires dans les neurones et les cellules gliales du système nerveux sympathique qui précèdent l’apparition de l’AV est d’un grand intérêt, car l’arrêt cardiaque soudain reste la cause de décès la plus fréquente dans le monde5. Par conséquent, dans le manuscrit actuel, nous fournissons un répertoire de base de méthodes pour identifier le SG murin – un élément murin au sein de ce réseau – et effectuer des analyses ultérieures au niveau de l’ARN, de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Hartwig Wieboldt pour son excellente assistance technique, et l’installation d’imagerie par microscopie UKE (Umif) du centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf pour avoir fourni des microscopes et un soutien. Cette recherche a été financée par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire) [FKZ 81Z4710141].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque à 96 puitsTPP92097RNAscope
Lames d’adhérence SuperFrost plus  ; 25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Microscopie
Albumine bovine Fraction V récepteur lyophil.Serva11924.03Coloration de monture entière
bisBenzimide H33342 trichlorhydrate (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Coloration de monture entière
Poulet anti-neurofilamentEMD MilliporeAB5539Coloration de monture entière
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, AllemagneD8418Coloration de monture
entière Donkey anti poulet IgY Alexa 647  ;Merck, KGA, Darmstadt, AllemagneAP194SA6Coloration de monture entière Donkey
anti chèvre IgG Alexa 568  ;Thermo Fisher ScientificA11057Montage entier coloration
Âne anti lapin IgG Alexa 488  ;Thermo Fisher ScientificA21206Montage entier coloration
Bloc de séchage 37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992  ;Coloration de l’ensemble du montage
Eosin YSigma AldrichE4009Coloration à montage entier
Éthanol 99 % dénaturé au MEK, IPA et Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Coloration à montage entier
Eukitt moyen de montageAppliChem253681.0008Coloration à montage entier
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Coloration à montage entier
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Coloration à monture entière
Chèvre anti choline acétyltransféraseEMD MilliporeAP144PColoration à monture entière
H2O2 30 % (w/p)Merck, KGA, Darmstadt, AllemagneH1009Coloration à monture entière
Héparine sodique 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN : 3862340Préparation SG
Kit de transctiption inverse d’ADNc haute capacitéLife technologies  ; 4368813Isolement de l’ARN
Isoflurane (Forene)Abbott Laboratories2594.00.00Préparation SG
Mayer’s hemalum solutionMerck1.09249.0500Coloration à monture entière
MéthanolSigma-Aldrich34860Coloration à monture entière
Verres de protection pour microscope 20x20 mm ou moinsMarienfeld0101040Coloration à monture entière
miRNeasy Mini KitQiagen217004isolement de l’ARN
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000CIsolement de l’ARN
Opal 570 Pack de réactifsAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldéhyde, 16 % p/v aq. soln., sans méthanol  ;Alfa Aesar43368Coloration à montage entier
Pipettes Pasteur, LDPE, non stérile, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Coloration à montage entier
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphateGibco18912-014Coloration à montage entier
Pinzette Dumont SS ForcepsFineScienceTools11203-25Préparation SG
QIAzol Lysis ReagentQiagen  ;79306Isolement de l’ARN
Lapin anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Coloration à montage entier
ARNLATERMerckR0901-100MLIsolement de l’ARN (facultatif)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-mm-S100B-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Billes d’acier inoxydable 7 mm  ;Qiagen  ;69990Isolement de l’ARN
Sudan black BRoth0292.2Coloration de l’ensemble du montage
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientificl’expressiongénique
TaqMan Gene Expression Assay Choline acétyltransférase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Analyse
de l’expression géniqueTaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Analyse de l’expression génique
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Analyse de l’expression génique
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Analyse
de l’expression géniqueTaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientificl’expressiongénique
TaqMan mastermixBiosystèmes appliqués4370074Analyse de l’expression génique  ;
Tissue Lyser IIQiagen85300Isolement de l’ARN
Triton X-100 Solution à 10 %Sigma-Aldrich93443-100mlColoration à montage entier
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Stylo en bambou WacomWacomCTL-460/KMesures de la taille des cellules
Papier filtre qualitatif préplissé Whatman, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Coloration à montage entier
Germe de blé Agglutinine, Alexa Fluor 633 ConjuguéThermo Fisher ScientificW21404RNAscope
4331182 Analyse de 4331182 Analyse de

Références

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