Test de fuite fluorescente pour étudier la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules

Résumé

Le test de fuite de fluorescence est une méthode simple qui permet d’enquêter sur les interactions peptide/membrane afin de comprendre leur implication dans plusieurs processus biologiques et en particulier la capacité des peptides pénétrants dans les cellules à perturber les bicouches de phospholipides lors d’un processus de translocation cellulaire directe.

Résumé

Les peptides pénétrant dans les cellules (CPP) sont définis comme des transporteurs capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules. L’une des principales caractéristiques communes requises pour cette activité résultait des interactions des CPP avec la membrane plasmique (lipides) et plus particulièrement avec les composants de la matrice extracellulaire de la membrane elle-même (sulfate d’héparane). En effet, indépendamment de la translocation directe ou de l’internalisation dépendante de l’endocytose, les bicouches lipidiques sont impliquées dans le processus d’internalisation tant au niveau de la membrane plasmique qu’au niveau du trafic intracellulaire (vésicules endosomales). Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé décrivant les différentes étapes de la formulation, de la purification, de la caractérisation et de l’application d’une grande vésicule unilamellaire (LV) dans le test de fuite de fluorescence afin de détecter une éventuelle déstabilisation/interaction CPP-membrane et d’aborder leur rôle dans le mécanisme d’internalisation. Des LV avec une composition lipidique reflétant la teneur en membrane plasmique sont générés afin d’encapsuler à la fois un colorant fluorescent et un quencher. L’ajout de peptides dans le milieu extravésiculaire et l’induction d’interactions peptide-membrane sur les LV pourraient ainsi induire de manière dose-dépendante une augmentation significative de la fluorescence révélant une fuite. Des exemples sont fournis ici avec les peptides amphipathiques (W) riches en tryptophane (W) et en arginine (R) récemment développés, qui ont montré une administration rapide et efficace de siRNA dans diverses lignées cellulaires. Enfin, la nature de ces interactions et l’affinité pour les lipides sont discutées pour comprendre et améliorer la translocation membranaire et/ou l’échappement endosomal.

Introduction

Après leur découverte dans les années quatre-vingt-dix, des peptides pénétrant dans les cellules (CPP) ont été développés pour favoriser une livraison cellulaire efficace des cargaisons à travers la membrane^{plasmique 1,2.} Les CPP sont généralement des peptides courts, généralement de 8 à 30 acides aminés, ayant une grande variété d’origines. Ils ont d’abord été définis comme des porteurs « à translocation directe », ce qui signifie qu’ils étaient capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules indépendamment de toute voie endocytotique, ni besoin en énergie ni impli....

Protocole

1. Préparation de grandes vésicules unilamellaires (LV)

1. Préparez les LV pour leur utilisation comme imitations de membrane cellulaire pour le test de fuite de fluorescence.
2. Mélanger avec une seringue en verre Hamilton phosphatidylcholine (DOPC, 786,11 g/mol), sphingomyéline (SM, 760,22 g/mol) et cholestérol (Chol, 386,65 g/mol) au rapport molaire 4:4:2. La solution lipidique est obtenue à partir d’une solution type de chaque lipide solubilisé dans un solvant méthanol/chloroforme (3/1; volume/volume) à 25 mg/mL dans une fiole à fond rond en verre de 25 mL. Sur la base de 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM et 2 μmol de Chol, la solution lipidique est obten....

Résultats

Le principe du test de fuite de fluorescence est illustré à la figure 1. Dans le détail, de grandes vésicules unilamellaires (LV) encapsulant un colorant fluorescent et un quencher (pas de signal de fluorescence) sont traitées avec la biomolécule d’intérêt. En raison de l’interaction du peptide avec les membranes lipidiques, ce qui pourrait impliquer la perméabilité de la membrane, la réorganisation ou même la rupture, le colorant de fluorescence et le quench.......

Discussion

Le test de fuite de fluorescence présenté est une méthode simple et rapide pour traiter la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules. Facile à faire, il permet également une comparaison indirecte entre différents peptides interagissant avec la membrane ou d’autres molécules interagissant avec la membrane. En ce qui concerne les étapes critiques du protocole, comme ce test fournit des valeurs relatives entre la valeur de référence (LV seules) et la libération maximale de fluorescence (condi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fiole en verre à fond rond de 25 mL	Pyrex
8-aminonaphtalène-1, 3, 6-acide trisulfonique, sel disodique (ANTS)	Invitrogen	A350	Protéger de la lumière  ;
Chloroforme  ;	Sigma-Aldrich	288306
Cholestérol	Sigma-Aldrich	C8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)	Avanti Polar	850375P	Protéger de l’air
Extrudeur	Avanti Polar	610000
Fluorimètre	PTI Serlabo
50 µ ; L seringue en verre	Hamilton	705N
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
LabAssay Phospholipid  ;	WAKO  ;	296-63801
colonne de chromatographie liquide	Sigma-Aldrich
Méthanol	Carlo Erba	414902
Nuclepore membrane polycarbonate (0,1 & micro ; taille des pores, 25 mm de diamètre)	Cuvette en	Whatman 800309
, 10 x 10 x 45 mm		Grener Bio-One
DLS	Fisher Scientific	FB55924
bromure de p-xylène-bispyridinium (DPX)	Invitrogen	X1525	Protéger de la lumière  ;
cuvette à fluorescence de quartz	Hellma	109.004F-QS
système rotavapor  ;	Heidolph	Z334898
Sephadex G-50 résine	Amersham	17-0042-01
Azoture de sodium (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Bain sonicateur	USC300T VWR	142-6001
Sphingomyelin	Avanti Polar	860062P	Protéger de l’air
Triton X-100  ;	Eromedex	2000-B
Zetaziser NanoZS  ;	Malvern	ZEN3500

polystyrène Cuvette semi-micro en polystyrène 614101,