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Article de méthode

Un test rapide de préférence alimentaire à Drosophila

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DOI :

10.3791/62051

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11 février 2021

 , 
1Monell Chemical Senses Center, 2Department of Physiology, The Diabetes Research Center, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole pour un essai d'alimentation à deux choix pour les mouches. Cet essai d'alimentation est rapide et facile à exécuter et convient non seulement pour la recherche en laboratoire à petite échelle, mais aussi pour les écrans comportementaux à haut débit chez les mouches.

Résumé

Pour choisir des aliments à valeur nutritive tout en évitant la consommation d'agents nocifs, les animaux ont besoin d'un système de goût sophistiqué et robuste pour évaluer leur environnement alimentaire. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un organisme modèle génétiquement tractable qui est largement utilisé pour déchiffrer les fondements moléculaires, cellulaires et neuronaux de la préférence alimentaire. Pour analyser les préférences alimentaires des mouches, une méthode d'alimentation robuste est nécessaire. Décrit ici est un test d'alimentation à deux choix, qui est rigoureux, économique et rapide. L'analyse est à base de boîtes de Pétri et implique l'ajout de deux aliments différents complétés par du colorant bleu ou rouge aux deux moitiés du plat. Ensuite, ~70 mouches prédémarrées de 2 à 4 jours sont placées dans le plat et autorisées à choisir entre les aliments bleus et rouges dans l'obscurité pendant environ 90 min. L'examen de l'abdomen de chaque mouche est suivi du calcul de l'indice de préférence. Contrairement aux assiettes multiwell, chaque boîte de Pétri ne prend que ~20 s à remplir et permet d'économiser du temps et des efforts. Cet essai d'alimentation peut être employé pour déterminer rapidement si les mouches aiment ou n'aiment pas un aliment particulier.

Introduction

Malgré des différences dramatiques dans la structure anatomique des organes gustatives entre les mouches et les mammifères, les réactions comportementales des mouches à de nombreuses substances tastantes sont étonnamment similaires à celles des mammifères. Par exemple, les mouchespréfèrent le sucre 1,2,3,4,5,6,7,8, acides aminés9,10, et faible teneur en sel11, qui indiquent des nutriments, mais rejettent les alimentsamers 12,13,14,15 qui sont désagréables ou toxiques. Au cours des deux dernières décennies, les mouches se sont avérées être un organisme modèle très précieux pour faire progresser la compréhension de nombreuses questions fondamentales liées à la sensation gustative et à la consommation alimentaire, y compris la détection du tastant, la transduction gustative, la plasticité gustative et la régulationde l'alimentation 16,17,18,19,20. Fait remarquable, un certain nombre d'études ont démontré que les mécanismes de transduction gustative et de circuit neuronal sous-jacents à la perception du goût sont analogues entre les mouches des fruits et les mammifères. Par conséquent, la mouche des fruits sert d'organisme expérimental idéal, permettant aux chercheurs de découvrir des concepts et des principes conservés de façon évolutionnistes qui régissent la détection et la consommation des aliments dans le règne animal.

Pour étudier la sensation gustative chez les mouches, il est essentiel d'établir un test rapide et rigoureux pour mesurer objectivement les préférences alimentaires. Au fil des ans, diverses méthodes d'alimentation, tels que les analyses à base de teinture11,12,13,21,22,23, l'essai de réponse d'extension de proboscis mouche24, la mangeoire capillaire (CAFE) essai25,26, le comptoir d'interaction liquide-alimentaire volant (FLIC) test27, et d'autres méthodes combinatoires ont été développés pour mesurer quantitativement la préférence alimentaire et / ou l'apport alimentaire pour les mouches des fruits28,29,30,31. L'un des paradigmes d'alimentation populaires est l'analyse d'alimentation à deux choix à base de colorant utilisant soit une plaque de microtiter multiwell12,21,32 ou, comme décrit ici, une petite boîte de Pétri11,22 comme chambre d'alimentation. Cet essai est conçu en fonction de la transparence de l'abdomen de la mouche. Au cours de cet essai, les mouches sont placées dans la chambre d'alimentation et présentées avec deux options alimentaires mélangées avec du colorant rouge ou du colorant bleu. Une fois l'essai terminé, les abdomens de mouche apparaissent rouges ou bleus selon la nourriture qu'ils ont consommée.

La boîte de Pétri et les tests d'alimentation à base de colorants multiwell-plaque sont très robustes et donnent à peu près les mêmes résultats. À l'aide de ces deux analyses, de nombreuses découvertes et percées importantes ont été faites pour déchiffrer les récepteurs et les cellules très diversifiés responsables de la détection des goûts alimentaires et de la texturedes aliments 11,12,21,22,32,33. Dans l'analyse à base de colorant, une étape expérimentale nécessitant beaucoup de temps et d'efforts est la préparation et le chargement des aliments dans la chambre d'alimentation. Pour réduire le temps de préparation et de chargement des aliments, cet essai a été modifié en remplaçant la plaque de microtiter multiwell par une petite boîte de Pétri, qui est divisée en deux compartiments égaux. Dans l'analyse à base de boîtes de Pétri, deux aliments différents complétés par du colorant bleu ou rouge sont ajoutés aux deux moitiés du plat. Ensuite, ~70 mouches prédémarrées de 2 à 4 jours sont placées dans le plat et autorisées à choisir entre les aliments bleus et rouges dans l'obscurité pendant environ 90 min. L'abdomen de chaque mouche est ensuite examiné, et l'indice de préférence (IP) est calculé.

Cet essai d'alimentation à base de boîtes de Pétri à deux choix est abordable, simple et rapide. Une plaque multiwell nécessite environ 110 s à remplir, tandis que chaque plat de Pétri ne prend que ~ 20 s. En outre, la plaque multiwell nécessite de pipetage de petits volumes de nourriture dans un grand nombre de petits puits (par exemple, 60 puits ou plus par assiette), ce qui exige une précision et une attention considérables. Inversement, l'analyse à base de boîtes de Pétri ne nécessite que deux actions par assiette. Comme l'analyse d'alimentation peut impliquer un grand nombre de répliques, l'essai à base de boîtes de Pétri permet d'économiser beaucoup de temps et d'efforts. Cet essai donne des résultats équivalents à ceux de l'analyse à base de multiwell et s'est avéré efficace pour répondre à de nombreuses questions fondamentales dans la sensation gustative, y compris le goût de selcodant 11, plasticité gustative modifiéepar l'expérience alimentaire 22, et la base moléculaire de la sensation de texturedes aliments 33. En résumé, cet essai à deux choix à base de boîtes de Pétri est un outil puissant pour étudier comment les mouches perçoivent les milieux nutritifs externes et internes pour obtenir un comportement alimentaire approprié.

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Protocole

1. Assemblage des chambres d'essai

REMARQUE : Bien que ce protocole décrive l'utilisation d'une boîte de Pétri de 35 mm (figure 1A), l'effet désiré peut être obtenu à l'aide de n'importe quel récipient étanche à fond lisse qui peut être coupé en deux et couvert.

  1. Tout d'abord, couper en deux une boîte de Pétri de 35 mm lidded en fixant une longueur de plastique (5 mm de largeur et 3 mm de hauteur) sur la ligne médiane avec adhésif étanche, formant deux compartiments étanches. Confirmez que le joint est complet pour éviter les fuites qui peuvent entraîner le mélange des deux substrats alimentaires.
    REMARQUE : Après l'assemblage, réutiliser cet appareil tant que le joint tient.

2. Préparation des flacons de famine

  1. Préparer un nombre suffisant de flacons de mouches en plastique vides; puis, compacter lâchement un morceau de papier de soie au fond. Compresser suffisamment le papier de soie pour qu'il remplisse l'espace, mais pas tellement qu'il forme une masse dense.
    REMARQUE : Assurez-vous qu'il n'y a pas de crevasses profondes ou de plis dans les tissus, car cela peut conduire à des mouches piégées.
  2. Ajouter ~3 mL d'eau pure au flacon de sorte que le tissu soit complètement saturé, mais il n'y a pas d'eau stagnante. Assurez-vous qu'il n'y a pas de grosses gouttelettes d'excès d'eau sur le mur du flacon. Alternativement, remplacer le papier trempé par la préparation d'une solution d'agar de 1 % w/v (sans saccharose) en ajoutant 5 mL d'agarose de 1 % à chaque flacon vide et en permettant à l'agarose de se solidifier à température ambiante.

3. Famine humide des mouches avant l'expérience

  1. Lancez la famine 24 h avant l'expérience. Sous anesthésieco 2, trier les groupes de ~70, 2-4 jours vole dans les flacons de famine préparés, étiquetant chaque flacon avec le génotype et le temps de famine.

4. Configuration du reagent

  1. Préparation des dyes
    REMARQUE : Avant d'effectuer des expériences, il est important d'effectuer un test de contrôle préliminaire afin de déterminer les concentrations correctes de dyes rouges et bleues à utiliser.
    1. Pour l'analyse de contrôle, préparez une gamme de dilutions pour chaque colorant, et effectuez l'analyse d'alimentation avec la même nourriture avec une couleur différente de colorant. Utilisez les résultats pour identifier les concentrations de deux colorants (un rouge, un bleu) qui donnent un IP d'~0 lorsqu'aucun composé expérimental n'est ajouté (voir la section 7).
      REMARQUE : Par exemple, la concentration finale de colorant bleu a été fixée à 50 μM et testée contre une série de concentrations de colorants rouges. D'après la courbe de dosage des colorants rouges, la concentration optimale de colorant rouge était de 210 μM, ce qui donnait un minimum de biais de teinture (figure 1B). Une concentration plus élevée de colorant rouge pousse les mouches à préférer les aliments rouges, tandis qu'une concentration plus faible pousse les mouches à préférer les aliments bleus. Affiner soigneusement les concentrations de colorant bleu ou rouge par incréments de 1 μM, car des différences de cette ampleur et plus peuvent affecter les résultats expérimentaux.
  2. Préparation de 1% agarose
    1. Dans un récipient allant au micro-ondes, mélanger 0,5 g d'agarose et 50 mL d'eau pure (ou plusieurs d'entre elle). Cuire au micro-ondes la solution agarose jusqu'à dissolution, en l'remuant au besoin.
  3. Préparation d'autres composants alimentaires
    1. Dissoudre chaque composant alimentaire, y compris le saccharose et tous les composés expérimentaux, dans l'eau à une concentration 100 fois ou plus élevée de la concentration finale testée.
      REMARQUE : Le volume total de chaque ingrédient alimentaire ajouté à 1 % d'agar ne doit pas dépasser 1 mL par agar fondu de 10 mL. Sinon, l'agarose peut être trop diluée et ne se solidifiera pas de façon appropriée.
  4. Préparation des médias alimentaires
    1. Mélanger l'agar, le colorant et le composé expérimental désiré dans des tubes coniques de centrifugeuse en polypropylène (15 ou 50 mL); utiliser de l'eau au lieu du tastant expérimental dans les aliments de contrôle. Faites ceci tandis que l'agar est encore complètement liquide et mélangez complètement à l'aide d'un mélangeur de vortex. Gardez les tubes dans un bain d'eau de 60 °C sans être utilisés pour empêcher l'agarose de durcir avant d'être distribué dans la vaisselle.
  5. Préparer des plats pour l'expérience
    REMARQUE : Assurez-vous que tous les plats sont complètement secs avant de commencer.
    1. Pipette 1 mL de milieu alimentaire expérimental rouge dans un côté du plat d'essai (figure 1A); répéter pour le nombre désiré de plats. Laisser refroidir l'agarose jusqu'à consistance ferme (3-5 min), puis pipette 1 mL de nourriture de contrôle bleu dans l'autre côté de la vaisselle (Figure 1A). Répétez ce processus avec la paire bleue rouge/expérimentale de commande.
      REMARQUE : Assurez-vous que tous les plats sont bien réglés avant de commencer l'expérience. Utilisez la vaisselle dans les 30 minutes.

5. Lancement de l'analyse d'alimentation bi-sens

  1. Paralyser temporairement les lignes de mouche expérimentales sur la glace jusqu'à ce qu'aucune activité motrice évidente comme le vol et l'escalade ne soit observée. Une fois que les mouches sont immobilisées, inversez doucement le flacon et appuyez sur pour transférer toutes les mouches dans la chambre d'essai.
    REMARQUE : Le choc froid prend ~3-5 min. Une exposition prolongée au froid peut affecter la physiologie et la santé de la mouche et doit donc être évitée.
  2. Placez rapidement le couvercle sur la chambre et mettez-le de côté. Une fois que toutes les mouches ont été transférées, déplacez toutes les chambres vers un espace sombre et clos. Laissez l'essai courir pendant 90 min.
    REMARQUE : Un environnement sombre minimise l'influence de la voie visuelle de la mouche sur le comportement alimentaire et élimine tout indice environnemental de l'extérieur du plat.

6. Mettre fin à l'analyse d'alimentation bi-sens

  1. Après 90 minutes se sont écoulées, transférer les chambres dans un congélateur de -20 °C pour sacrifier les mouches. Après ~1 h, comptez les mouches.
    REMARQUE : Inversez chaque boîte de Pétri avant de placer le plat au congélateur pour vous assurer qu'aucune mouche ne sera congelée sur les aliments.

7. Attribution d'un indice de préférence (IP) pour déterminer la préférence alimentaire

  1. Sous un microscope de dissection standard, examiner la couleur abdominale des mouches dans chaque plat individuel. Comptez les mouches comme étant rouges, bleues ou violettes en fonction de la couleur de leur abdomen (figure 2A). Comptez la mouche si son abdomen est de couleur supérieure à 50 %, ce qui indique une alimentation robuste( figure 2B). Exclure la mouche si son abdomen ne contient qu'une petite tache alimentaire, indiquant une mauvaise alimentation (Figure 2C).
  2. Une fois que le nombre de mouches mangeant des aliments bleus, rouges ou bleus et rouges a été compté, utilisez l'équation suivante pour attribuer à chaque boîte de Pétri un indice de préférence (IP) :

PI = (Nombre de mouches mangeant des aliments expérimentaux) - (Nombre de mouches mangeant des aliments de contrôle) / (Nombre de mouches mangeant des aliments expérimentaux) + (Nombre de mouches mangeant des aliments de contrôle) + (Nombre de mouches mangeant les deux)

Pi > 0 indique une préférence pour le composé expérimental, PI < 0 indique une aversion pour le composé expérimental, et PI = 0 n'indique aucun effet du composé sur le comportement alimentaire.

8. Nettoyage des chambres d'essai

  1. Nettoyez rapidement les boîtes de Pétri en raclant le substrat alimentaire et en les rinçant avec du savon et de l'eau non parfumés. Faire tremper les boîtes de Pétri toute la nuit dans de l'eau distillée. Vérifiez que le joint de séparation dans chaque plat est encore étanche, puis laissez le plat sécher à l'air libre.
    REMARQUE : Après s'être assuré qu'il n'y a pas d'agarose résiduelle ou de colorant, les boîtes de Petri sont prêtes à être utilisées à nouveau.

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Résultats

Dans cet essai, un plat de 35 mm a été divisé en deux compartiments d'alimentation égaux, chaque moitié du plat contenant de la nourriture agarose couplée à un colorant bleu ou rouge (Figure 1A). Pour exclure le biais des colorants, les concentrations de colorants bleus et rouges ont été soigneusement affinées pour donner un PI approximatif de « 0 » lorsque seuls ces deux colorants ont été ajoutés (figure 1B). Une fois que la boîte de Pétri a été chargée avec de...

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Discussion

Cette méthode implique plusieurs étapes cruciales où des problèmes peuvent se produire. Tout d'abord, assurez-vous que les mouches ingèrent une quantité suffisante de nourriture pour fournir des données stables. Si les mouches mangent mal, assurez-vous que les mouches ont été affamées pendant au moins 24 h et que le média expérimental contient au moins une concentration minimale de saccharose (2 mM). Pour stimuler davantage la consommation alimentaire, prolongez la période de famine humide au-delà de 24 h, selon l'état p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts ou intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs aimeraient remercier le Dr Tingwei Mi de les avoir aidés à optimiser l'analyse d'alimentation à deux choix. Ils remercient également Samuel Chan et Wyatt Koolmees pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce projet a été financé par les subventions des National Institutes of Health R03 DC014787 (Y.V.Z.) et R01 DC018592 (Y.V.Z.) et par la Fondation Ambrose Monell.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de Pétri 35 mmFisher Scientific08-772E
AgaroseThomas ScientificC756P56
Adhésif transparentFisher ScientificNC9884114
Tubes à centrifuger coniquesFisher Scientific05-527-90
Microscope de dissectionAmscopeSM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant BlueWako Chemical3844-45-9
Fly CO2 système d’anesthésieGenesee Scientfic59-114/54-104M
Incubateur à mouches avec cycle jour/nuit programmablePowers Scientific Inc.IS33SD
Lignes anti-mouches
Plat en verre (passe au micro-ondes)
KimwipesFisher Scientific06-666A
Bouteille de stockage multimédiaFisher Scientific50-192-9998
Séparateur en plastique coupé pour s’adapter au plat à partir d’une feuille d’une épaisseur ne dépassant pas 5 mm
Flacons anti-mouchesen plastiqueGenesee Scientific32-116
SaccharoseMillipore SigmaS9378
Sulforhodamine BMillipore SigmaS9012
Composé d’intérêt
Mélangeur VortexBenchmark ScientificBV1000
Bain d’eauFisher ScientificFSGPD05

Références

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