Article de méthode

Coloration par immunofluorescence à monture entière, imagerie confocale et reconstruction 3D du nœud sino-auriculaire et auriculo-ventriculaire chez la souris

DOI :

10.3791/62058

⸱

22 décembre 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

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Résumé

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Nous fournissons un protocole étape par étape pour la coloration par immunofluorescence complète du nœud sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) dans les cœurs murins.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le signal électrique physiologiquement généré par les cellules du stimulateur cardiaque dans le nœud sino-auriculaire (SAN) est conduit à travers le système de conduction, qui comprend le nœud auriculo-ventriculaire (AVN), pour permettre l’excitation et la contraction de tout le cœur. Tout dysfonctionnement du SAN ou de l’AVN entraîne des arythmies, indiquant leur rôle fondamental dans l’électrophysiologie et l’arythmogenèse. Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur l’arythmie, mais l’étude spécifique du SAN et de l’AVN reste difficile.

Le SAN est situé à la jonction de la crista terminalis avec la veine cave supérieure et AVN est situé au sommet du triangle de Koch, formé par l’orifice du sinus coronaire, l’anneau tricuspide et le tendon de Todaro. Cependant, en raison de la petite taille, la visualisation par histologie conventionnelle reste difficile et ne permet pas l’étude du SAN et de l’AVN dans leur environnement 3D.

Nous décrivons ici une approche d’immunofluorescence à montage entier qui permet la visualisation locale du SAN et de l’AVN marqués chez la souris. La coloration par immunofluorescence à montage entier est destinée à de plus petites sections de tissu sans nécessiter de section manuelle. À cette fin, le cœur de souris est disséqué, avec le tissu indésirable enlevé, suivi de la fixation, de la perméabilisation et du blocage. Les cellules du système de conduction dans le SAN et l’AVN sont ensuite colorées avec un anticorps anti-HCN4. La microscopie confocale à balayage laser et le traitement d’image permettent de différencier les cellules nodales et les cardiomyocytes fonctionnels, et de localiser clairement le SAN et l’AVN. En outre, des anticorps supplémentaires peuvent également être combinés pour marquer d’autres types de cellules, telles que les fibres nerveuses.

Par rapport à l’immunohistologie conventionnelle, la coloration par immunofluorescence à montage entier préserve l’intégrité anatomique du système de conduction cardiaque, permettant ainsi l’investigation de l’AVN; en particulier dans leur anatomie et leurs interactions avec le myocarde de travail environnant et les cellules non myocytaires.

Introduction

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Les arythmies sont des maladies courantes qui touchent des millions de personnes et sont la cause d’une morbidité et d’une mortalité importantes dans le monde entier. Malgré d’énormes progrès dans le traitement et la prévention, tels que le développement de stimulateurs cardiaques, le traitement des arythmies reste difficile, principalement en raison des connaissances très limitées sur les mécanismes sous-jacents de la maladie 1,2,3. Une meilleure compréhension de l’électrophysiologie normale et de la physiopathologie des arythmies peut aider à développer des stratégies de traitement nouvelles, innovantes et causales à l’avenir. De plus, pour étudier de manière exhaustive l’arythmagénèse, il est important de localiser et de visualiser le système de conduction cardiaque spécifique dans des modèles animaux tels que la souris, car les souris sont largement utilisées dans la recherche en électrophysiologie.

Les principales parties du système de conduction cardiaque sont le nœud sino-auriculaire (SAN), où l’impulsion électrique est générée dans des cellules de stimulateur cardiaque spécialisées, et le nœud auriculo-ventriculaire (AVN), qui est la seule connexion électrique entre les oreillettes et les ventricules4. Chaque fois que les propriétés électrophysiologiques du SAN et de l’AVN sont altérées, des arythmies telles que le syndrome du sinus malade ou le bloc auriculo-ventriculaire peuvent survenir, ce qui peut entraîner une détérioration hémodynamique, une syncope et même la mort, soulignant ainsi le rôle essentiel du SAN et de l’AVN dans l’électrophysiologie et l’arythmogenèse5.

Des études approfondies sur SAN ou AVN nécessitent une localisation et une visualisation précises des deux structures, idéalement dans leur environnement physiologique. Cependant, en raison de leur petite taille et de leur emplacement dans le myocarde de travail, sans établir une structure macroscopiquement visible clairement, l’étude de l’anatomie et de l’électrophysiologie du SAN et de l’AVN est difficile. Les repères anatomiques peuvent être utilisés pour identifier approximativement la région qui contient SAN et AVN 6,7,8. En bref, SAN est situé dans la région inter-cavale de l’oreillette droite adjacente à la crista terminalis musculaire (CT), AVN est situé dans le triangle de Koch établi par la valve tricuspide, l’ostium du sinus coronaire et le tendon de Todaro. Jusqu’à présent, ces repères anatomiques ont été principalement utilisés pour localiser, supprimer puis étudier SAN et AVN en tant que structures individuelles (par exemple, par histologie conventionnelle). Pour mieux comprendre l’électrophysiologie complexe du SAN et de l’AVN (par exemple, les effets régulateurs des cellules adjacentes du myocarde de travail), il est toutefois nécessaire d’étudier les systèmes de conduction dans l’environnement physiologique 3D.

La coloration par immunofluorescence à montage entier est une méthode utilisée pour étudier les structures anatomiques in situ tout en préservant l’intégrité des tissus environnants9. Tirant parti des logiciels de microscopie confocale et d’analyse d’images, SAN et AVN peuvent être visualisés avec des anticorps marqués par fluorescence ciblant les canaux ioniques spécifiquement exprimés dans ces régions.

Le protocole suivant explique les étapes nécessaires pour effectuer une méthode de coloration à monture entière bien établie pour la localisation et la visualisation des microscopes SAN et AVN. Plus précisément, ce protocole décrit comment (1) localiser le SAN et l’AVN par repères anatomiques pour préparer ces échantillons pour la coloration et l’analyse microscopique (2) effectuer une coloration par immunofluorescence à montage entier des marqueurs de référence HCN4 et Cx43 (3) préparer les échantillons SAN et AVN pour la microscopie confocale (4) effectuer l’imagerie confocale du SAN et de l’AVN. Nous décrivons également comment ce protocole peut être modifié pour inclure une coloration supplémentaire du myocarde de travail environnant ou des cellules non myocytaires telles que les fibres nerveuses autonomes, ce qui permet une étude approfondie du système de conduction cardiaque dans le cœur.

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Protocole

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Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menés conformément aux directives du comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Munich, et toutes les procédures entreprises sur les souris ont été approuvées par le gouvernement de Bavière, Munich, Allemagne (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Les souris C57BL6/J ont été achetées au Jackson Laboratory.

NOTE: La figure 1 montre les instruments nécessaires à l’expérience. La figure 2 montre une illustration de l’anatomie cardiaque globale. La figure 3 montre l’emplacement du SAN et de l’AVN dans le cœur d’une souris adulte. La figure 4 montre l’échantillon préparé chargé sur la microscopie confocale.

1. Préparatifs

  1. Préparer une solution de formaldéhyde à 4 % (PFA à 4 %) en diluant 10 mL de solution de formaldéhyde à 16 % dans 30 mL de PBS.
  2. Préparer une solution de saccharose à 15 % et une solution de saccharose à 30 % en dissolvant 15 g et 30 g de poudre de saccharose dans 100 ml de PBS, respectivement. Une fois la poudre de saccharose complètement dissoute, filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm avant de la conserver à 4 °C.
  3. Préparez un gel d’agarose à 3%-4%, ajoutez 3 g ou 4 g de poudre d’agarose et 100 ml de 1x TAE (dilué dans 50x la solution mère TAE) dans un bécher. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et faites-le bouillir jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
  4. Préparer la boîte de dissection en versant doucement 30 ml de gel d’agarose (3 % à 4 %) dans une boîte de Petri de 100 mm de diamètre. Laissez la boîte de Petri sur le banc à température ambiante pour refroidir et durcir.
  5. Préparer la solution de blocage et la solution de lavage selon les recettes fournies dans le tableau 1. Préparez toutes les solutions préparées le jour de l’utilisation. Le stockage à long terme n’est pas recommandé.
  6. Préparer les solutions d’anticorps en les diluant dans du froid (4 °C) 1x PBS, protéger la dilution de la lumière (p. ex., en enroulant du papier d’aluminium) et conserver les dilutions sur la glace jusqu’à utilisation. Diluer les anticorps peu de temps avant l’incubation. Évitez de laisser les anticorps dilués à température ambiante.
    REMARQUE : La dilution appropriée des anticorps doit être testée avec des échantillons de tissus comparables en effectuant une coloration immunofluorescente conventionnelle. Ici, nous avons testé les anticorps en colorant des sections congelées coupées sur une épaisseur de 10 μm.

2. Prélèvement d’organes et préparation de tissus

  1. Anesthésiez la souris en la plaçant dans une chambre d’incubation reliée à un vaporisateur d’isoflurane. Réglez le vaporisateur pour qu’il fournisse 4 à 5 % d’isoflurane (96 à 95 % d’oxygène, respectivement).
    REMARQUE: L’anesthésie complète est confirmée par la perte de la réaction posturale et du réflexe de redressement en roulant doucement la chambre jusqu’à ce que la souris soit placée sur le dos.
  2. Placez la souris en décubitus dorsal sur la table chirurgicale. Placez le nez de la souris dans un masque d’anesthésie relié à un circuit Bain modifié avec son tube intérieur connecté au vaporisateur d’isoflurane. Pour maintenir l’anesthésie, utilisez 1-2% d’isoflurane dans l’oxygène à un débit de 1 L / min. Récupérez l’excès de vapeur anesthésique de la souris via le tube extérieur du masque et aspirez à travers une cartouche de charbon actif, qui absorbe l’excès de gaz anesthésique.
  3. Lorsque l’anesthésie complète est obtenue, injecter du fentanyl pour l’analgésie (0,1 μg/25 g de poids corporel i.p.).
  4. Lorsque le réflexe de pincement des orteils est indétectable, faites une coupe claire du jugulaire à la symphyse en utilisant des ciseaux d’iris pour enlever la fourrure et la peau. Faites une autre coupe de gauche à droite sous les côtes en utilisant des ciseaux d’iris pour ouvrir soigneusement l’abdomen.
  5. Vivez un peu le xiphoïde en utilisant des pinces incurvées pour permettre de couper le diaphragme de gauche à droite sans blesser aucun organe. Coupez la cage thoracique en une ligne axillaire médiale des deux côtés à l’aide de ciseaux à iris pour la retourner crânienne et permettre l’accès au cœur.
  6. Couper la veine cave inférieure et l’aorte thoracique descendante au niveau du diaphragme à l’aide de ciseaux d’iris. Percez le cœur avec une aiguille de 27 G dans la région de l’apex, puis poussez soigneusement l’aiguille dans le ventricule gauche (LV). Injectez doucement 5 à 10 ml de PBS glacé dans le VG pour perfuser le cœur.
    REMARQUE: La couleur du cœur doit passer du rouge au gris indiquant une perfusion réussie avec PBS.
  7. Soulevez délicatement l’apex du cœur à l’aide d’une pince à épiler permettant de couper les gros vaisseaux et d’enlever le cœur.
  8. Extrayez le cœur en coupant les grosses artères et les veines aussi loin que possible du cœur pour éviter tout dommage à la veine cave supérieure (SVC). Conservez le SVC car il servira de point de repère important lors du traitement ultérieur.
  9. Après le retrait du cœur, éteignez le vaporisateur d’isoflurane.
  10. Mettez le cœur dans une boîte de dissection remplie de PBS glacé sous le microscope à dissection. Après détermination de la gauche / droite et de l’avant / arrière du cœur, tournez le cœur avec l’avant du cœur au fond du plat (pour exposer les gros vaisseaux situés à l’arrière).
  11. Immobiliser le cœur en plaçant de petites épingles à travers l’apex et l’appendice auriculaire gauche (AAL) dans l’agarose au fond de la boîte de dissection (Figure 2A). À l’aide d’une pince à épiler fine et de ciseaux, retirez délicatement le tissu non cardiaque autour du CVS et de la veine cave inférieure (IVC) (p. ex. poumons, graisse, péricarde) pour exposer la région intercavale (figure 3A).
  12. Retirez la majorité des ventricules en coupant parallèlement la rainure entre les ventricules et les oreillettes avec le micro ciseau. Conservez une petite partie du tissu ventriculaire pour la charge ultérieure sur l’anneau en plexiglas.
  13. Pour la fixation et la déshydratation, mettre l’échantillon (contenant les oreillettes, le SVC et l’IVC) dans 4% PFA pendant une nuit à 4 °C.
  14. Le lendemain, transférer le cœur dans une solution de saccharose à 15% pendant 24 heures à 4 °C.
  15. Le lendemain, transférer le cœur dans une solution de saccharose à 30% pendant 24 heures à 4 °C.
    NOTE: Pour la fixation et la déshydratation aux étapes 2.13, 2.14 et 2.15, les échantillons sont laissés à 4 °C sans autre agitation ni balancement.

3. Coloration par immunofluorescence à montage entier

  1. Laver le cœur dans du Triton X-100 à 1 % dilué dans du PBS et bloquer et perméabiliser dans une solution de blocage (tableau 1) pendant une nuit à 4 °C.
  2. Placer le cœur dans un tube de 1,5 mL et incuber avec des anticorps anti-souris de lapin connexin-43 (dilution de 1:200) et de rats anti-souris HCN4 (dilution de 1:200) dilués avec une solution bloquante pendant 7 jours à 4 °C.
    REMARQUE : La concentration optimale d’anticorps primaires doit être testée avant d’utiliser les fiches techniques comme orientation. D’autres antigènes d’intérêt pourraient également être colorés à cette étape, à condition que l’espèce hôte de l’antigène primaire soit différente des autres. Une concentration plus élevée de Triton X-100 peut aider à obtenir une coloration plus efficace des anticorps, comme démontré avant10, mais la concentration peut être déterminée individuellement.
  3. Après 7 jours, retirer la solution contenant les anticorps primaires à l’aide d’une pipette et laver le cœur avec la solution 1% Triton X-100 3 fois (chaque fois pendant 1 h à température ambiante sur le vibreur orbital).
  4. Après lavage, incuber le cœur = avec Alexa Fluor 488 chèvre anti-rat IgG (dilution de 1:200) et Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (dilution de 1:200) pendant 7 jours à 4 °C.
  5. Après 7 jours, retirer toute la solution contenant les anticorps secondaires à l’aide d’une pipette. Ensuite, laver le cœur avec une solution de lavage (tableau 1) 3 fois (chaque fois pendant 1 h à température ambiante sur le shaker orbital).
  6. Pour colorer les noyaux, incuber le cœur dans une solution DAPI (10 μg/mL) pendant une nuit à 4 °C.
  7. Le lendemain, laver le cœur avec une solution de lavage 3 fois (chaque fois pendant 1 h à température ambiante sur le shaker orbital).
    NOTE: Pour le blocage, la perméabilisation, l’incubation d’anticorps et la coloration DAPI aux étapes 3.1, 3.2, 3.4 et 3.6, laisser les échantillons à l’état d’équilibre à 4 °C, aucune agitation n’est nécessaire. Le tissu coloré a pu être conservé entièrement recouvert d’une solution de lavage à 4 °C et protégé de la lumière pendant quelques jours jusqu’à l’imagerie au microscope confocal.

4. Microscopie confocale

  1. Préparez des bagues en plexiglas et remplissez-les de pâte à modeler (Figure 1). Au centre de la pâte à modeler, une petite rainure se forme au centre pour charger le cœur. Faire une rainure peu profonde, car il serait plus facile d’acquérir un plan d’imagerie plat, et d’ajuster l’espace et d’éviter les bulles d’air entre l’échantillon et les lamelles de couverture à l’étape 4.4.
  2. Utilisez le même échantillon cardiaque pour l’imagerie séquentielle du SAN et de l’AVN. Pour l’imagerie SAN, chargez directement le cœur tandis que pour l’imagerie AVN, effectuez la microdissection avant.
    1. Imagerie SAN
      1. Identifier le SAN par des repères anatomiques : il est situé sur la face dorsale du cœur dans la région inter-cavale (la région entre la veine cave supérieure et inférieure). La crista terminalis (CT) est la strie musculaire entre le SAN et le RAA.
      2. Placez le cœur dans la rainure de pâte à modeler avec l’arrière du cœur tourné vers le haut. Ajoutez du PBS sur le cœur pour déplacer tout l’air dans la cavité jusqu’à ce que le cœur soit complètement recouvert de PBS (généralement quelques gouttes de PBS suffisent).
      3. Sous le microscope à dissection, presser doucement le RAA, le LAA et les parties restantes du ventricule gauche dans la pâte à modeler pour fixer le cœur. Assurez-vous que toute la région inter-cavale et la crista terminalis sont clairement visibles (non recouvertes de pâte à modeler). La zone qui sera imagée est illustrée à la figure 3A.
    2. Imagerie AVN
      1. Une fois l’imagerie du SAN terminée, prélevez le même échantillon et utilisez-le ensuite pour l’imagerie AVN. Pour la microdissection AVN, placer le cœur = sur une boîte de dissection au microscope à dissection.
      2. Orientez le cœur avec le côté droit tourné vers le haut (y compris les parties restantes du ventricule droit). Placez des broches à travers la partie restante de la paroi libre BT (qui se trouve maintenant en bas) pour immobiliser le tissu (Figure 2B).
      3. Coupez le mur libre de VR restant vers le haut à travers la valve tricuspide et la veine cave supérieure. Ensuite, retournez le VR et la PR pour exposer le septum interventriculaire et interauriculaire. (Figure 3B)
        REMARQUE: Faites attention à ne pas endommager le sinus coronaire (CS), car c’est un repère anatomique important pour trouver le triangle de Koch qui permet ensuite de localiser l’AVN. Le CS passe transversalement dans la rainure auriculo-ventriculaire gauche du côté postérieur du cœur, et l’ouverture de l’orifice CS est située entre IVC et la valve tricuspide à la partie inférieure du septum interauriculaire (Figure 3A et B).
      4. Identifier le triangle de Koch qui se trouve sur la surface endocardique de l’oreillette droite, bordé antérieurement par la ligne charnière du feuillet septal de la valve tricuspide (TV) et postérieurement par le tendon de Todaro. La base est formée par l’orifice du sinus coronaire (Figure 3B). Comme il s’agit de la région cible pour l’imagerie AVN, elle doit être clairement visible.
      5. Transférez le cœur dans la rainure de pâte à modeler à l’intérieur de l’anneau en plexiglas avec le triangle de Koch clairement exposé (c’est-à-dire non recouvert de pâte à modeler). Pressez doucement le tissu autour du triangle de Koch dans la pâte à modeler pour fixer l’échantillon. Ajoutez du PBS sur le cœur pour déplacer tout l’air dans la cavité jusqu’à ce que le cœur soit complètement recouvert de PBS (généralement quelques gouttes de PBS suffisent).
  3. Appliquez du silicone sur les bords des anneaux en plexiglas pour permettre de couvrir les cœurs chargés dans les anneaux en plexiglas remplis de pâte à modeler avec des lamelles de couverture.
  4. Appuyez doucement sur la face arrière de la pâte à modeler pour extraire des parties du PBS et attacher le cœur à la lamelle de couverture tout en évitant toute bulle d’air dans la zone d’imagerie.
    REMARQUE: Assurez-vous que les régions d’intérêt ne sont pas pliées et couvertes lors de la pression sur la face arrière de la pâte à modeler. Un plan d’imagerie plat sans surcompression de l’échantillon est nécessaire pour conserver l’anatomie et pour une imagerie confocale correcte des échantillons. Pour le SAN, il est important de s’assurer que la région inter-cavale est clairement exposée. Pour AVN, le triangle de Koch doit être entièrement exposé.
  5. Placez les échantillons de coloration à montage entier à l’envers sur la plate-forme du microscope confocal. Le SAN/AVN exposé fixé à la glissière de couvercle se trouve maintenant au bas de la plate-forme du microscope (Figure 4).
    REMARQUE: Pour prendre des images, nous utilisons le Carl Zeiss LSM800 avec l’unité Airyscan et le logiciel ZEN 2.3 SP1 noir.
  6. Choisissez la plaque « BP420-480 + LP605 » pour l’excitation de l’anti-HCN4 conjugué Alexa Fluor 647. Variez le gain principal de 650-750.
  7. Prenez une image globale de l’ensemble de la région SAN et AVN à l’aide de la fonction Tile Scan . Sélectionnez ensuite la région HCN4 positive en cliquant et en ajoutant un carré sur l’image de vue d’ensemble autour de la zone d’intérêt qui sera analysée.
  8. Vérifiez les paramètres, y compris les plaques et le gain principal pour les canaux restants (Alexa Fluor 488 et DAPI) du microscope confocal et réglez-les comme décrit à l’étape 4.6.
  9. Ajustez lentement la mise au point de haut en bas de l’échantillon pour prévisualiser l’échantillon entier et définir le premier et le dernier pour la plage Z-stack. Définissez un intervalle optimal pour la pile Z en fonction de l’épaisseur de l’échantillon optique. Nous utilisons un objectif 20x, et 0,8-1 μm comme intervalle pour Z-stack.
  10. Une fois tous les paramètres correctement définis, analysez toute la zone du SAN et de l’AVN.
  11. Effectuer une reconstruction 3D des images à l’aide d’un logiciel (par exemple, Imaris version 8.4.2).
    1. Sélectionner le traitement des images | Soustraction de base pour éliminer les taches de fond.
    2. Sélectionnez la création de surface sur le paramètre du canal et de la région d’intérêt sélectionnés pour le traitement.

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Résultats

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En utilisant le protocole décrit ci-dessus, l’imagerie par microscopie confocale du SAN et de l’AVN peut être réalisée de manière fiable. La coloration spécifique du système de conduction à l’aide d’anticorps fluorescents ciblant HCN4 et la coloration du myocarde de travail à l’aide d’anticorps fluorescents ciblant Cx43 permettent l’identification claire du SAN (Figure 5, Vidéo 1) et de l’AVN (Figure 6, Vidéo 2) ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’anatomie cardiaque a traditionnellement été étudiée à l’aide de coupes histologiques minces11. Cependant, ces méthodes ne préservent pas la structure tridimensionnelle du système de conduction et ne fournissent donc que des informations 2D. Le protocole de coloration par immunofluorescence à montage complet décrit ici permet de surmonter ces limitations et peut être utilisé en routine pour l’imagerie SAN et AVN.

Par rapport aux méthodes standard telles que l’immunohis...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le China Scholarship Council (CSC, à R. Xia), le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK; 81X2600255 à S. Clauss, 81Z0600206 à S. Kääb), la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. Clauss), le SFB 914 (projet Z01 à H. Ishikawa-Ankerhold et S. Massberg et projet A10 à C. Schulz), l’ERA-NET sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD; 01KL1910 à S. Clauss) et la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (à S. Clauss). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la préparation des manuscrits.

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Matériaux

Animals

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hugo Sachs Elektronik34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910Comprend une chambre d’induction, une unité d’évacuation de gaz et des filtres à charbon
Circuit Bain modifiéHugo Sachs Elektronik73-4860Comprend un masque d’anesthésie pour souris
Plateforme chirurgicaleKent ScientificSURGI-M
Instrumentation in vivo
Pince fineOutils de science fine11295-51
Ciseaux à irisde science fine14084-08
Ciseaux à ressortde science fine91500-09
Pince à tissusOutils de science fine11051-10
Épingles à tissuOutils de science fine26007-01Pourrait utiliser des aiguilles 27G comme substitut
General lab instruments
Agitateur orbitalSunlabD-8040
Agitateur magnétiqueIKA  ;de base
, volume 10 & micro ; L, 100 et micro ; L, 1000 et micro ; LEppendorfZ683884-1EA
Microscopes Microscope
stéréo-zoom de dissection  ;VWR10836-004
Laser Scanning Microscope confocalZeissLSM 800
Software
Imaris 8.4.2Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 noirZeiss
General Lab Material
0,2 et micro ; Filtre à seringueSartorius17597
100 mm Boîte de PétriFalcon351029
27G aiguilleBD Microlance 3300635
50 ml Tube conique en polypropylèneFalcon352070
5ml SeringueBraun4606108V
Couvre-slipsThermo Scientific7632160
Eppendorf TubesEppendorf30121872
Chemicals
0.5 M EDTASigma20-158Composants du TEA
16 % Formaldéhyde SolutionThermo Scientific  ;28908Utilisation en solution à 4 %  ;
Acide acétiqueMerck100063Composants du thé
AgaroseBiozym850070
Sérum bovin AlbumineSigmaA2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineGibco14190-094
Sérum de chèvre normalSigmaNS02L
SaccharoseSigmaS1888-1kg
Tris-baseRocheTRIS-ROComposants du TEA
Triton X-100SigmaT8787-250mlDilué à 1 % dans PBS
Tween 20SigmaP2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5  ; mg/10  ; mLBraun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mLCp-pharma31303
Oxygène 5 LLinde2020175Comprend un régulateur de pression
Chèvre anti-Lapin IgG Alexa Fluor  ; 488  ;Cell Signaling Technology#4412dilué à 1:200
IgG anti-rat de chèvre Alexa Fluor 647Invitrogen#A-21247dilué à 1:200
Hoechst 33342, trichlorhydrate trihydraté (DAPI)InvitrogenH3570dilué à 1:1000
Anti-Connexin-43SigmaC6219dilué à 1:200
Anti-HCN4 de rat (SHG 1E5)InvitrogenMA3-903dilué à 1:200
<>AutreAnneau
et imprimé en 3D
C57BL/6Le Laboratoire
) Outils Outils Pipette RH de lapin en plexiglas Pâte à modeler Cernit 49655005 Silikonpasten conçu , Baysilone VWR 291-1220Mouse, Jackson

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  2. Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374(2020).
  3. Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  4. van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
  5. Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
  6. Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
  7. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
  8. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
  9. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
  10. Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  11. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
  12. Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
  13. Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
  14. Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
  15. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  16. Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
  17. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  18. Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
  19. Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664(2014).
  20. Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
  21. Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81(2013).
  22. van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).

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Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

Mots-clés

Reconstruction 3Dn ud sino atrialc ur de sourissyst me de conduction cardiaqueanticorps HCN4connexine 43anticorps fluorescents

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