Nous décrivons l’ingénierie d’une nouvelle ARN polymérase T7 attachée à l’ADN pour réguler les réactions de transcription in vitro. Nous discutons des étapes de la synthèse et de la caractérisation des protéines, validons la régulation transcriptionnelle de la preuve de concept et discutons de ses applications en informatique moléculaire, en diagnostic et en traitement de l’information moléculaire.
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Article de méthode
ARN polymérase attachée à l’ADN pour la transcription in vitro programmable et le calcul moléculaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
La nanotechnologie de l’ADN permet l’auto-assemblage programmable des acides nucléiques en formes et dynamiques prescrites par l’utilisateur pour diverses applications. Ces travaux démontrent que les concepts de la nanotechnologie de l’ADN peuvent être utilisés pour programmer l’activité enzymatique de l’ARN polymérase T7 dérivée des phages (RNAP) et construire des réseaux de régulation de gènes synthétiques évolutifs. Tout d’abord, un RNAP T7 attaché à un oligonucléotide est conçu par l’expression d’un RNAP marqué SNAP N-terminal et le couplage chimique ultérieur du marqueur SNAP avec un oligonucléotide modifié par benzylguanine (BG). Ensuite, le déplacement des brins d’acide nucléique est utilisé pour programmer la transcription de la polymérase à la demande. En outre, les assemblages auxiliaires d’acides nucléiques peuvent être utilisés comme « facteurs de transcription artificiels » pour réguler les interactions entre l’ARNP T7 programmé par l’ADN et ses modèles d’ADN. Ce mécanisme de régulation de la transcription in vitro peut mettre en œuvre une variété de comportements de circuit tels que la logique numérique, la rétroaction, la cascade et le multiplexage. La composabilité de cette architecture de régulation des gènes facilite l’abstraction, la normalisation et la mise à l’échelle de la conception. Ces caractéristiques permettront le prototypage rapide de dispositifs génétiques in vitro pour des applications telles que la biodétection, la détection de maladies et le stockage de données.
Introduction
Le calcul de l’ADN utilise un ensemble d’oligonucléotides conçus comme support de calcul. Ces oligonucléotides sont programmés avec des séquences pour s’assembler dynamiquement selon la logique spécifiée par l’utilisateur et répondre à des entrées d’acide nucléique spécifiques. Dans les études de preuve de concept, le résultat du calcul consiste généralement en un ensemble d’oligonucléotides marqués par fluorescence qui peuvent être détectés par électrophorèse sur gel ou lecteurs de plaques de fluorescence. Au cours des 30 dernières années, des circuits de calcul de l’ADN de plus en plus complexes ont été démontrés, tels que diverses cascades logiques numériques, des ....
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Protocole
1. Préparation du tampon
REMARQUE: La préparation du tampon de purification des protéines peut se produire n’importe quel jour; ici, cela a été fait avant de commencer les expériences.
- Préparer un tampon d’lyse/équilibrage contenant 50 mM de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris), 300 mM de chlorure de sodium (NaCl), 5 % de glycérol et 5 mM de β-mercaptoéthanol (BME), pH 8. Ajouter 1,5 mL de Tris 1M, 1,8 mL de NaCl 5M, 1,5 mL de glycérol, 25,2 mL d’eau désionisée (ddH2O) dans un tube centrifuge de 50 mL et ajouter 10,5 μL de 14,2 M BME juste avant utilisation.
REMARQUE: Tris peut causer une toxicité aiguë; par conséq....
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Résultats
Figure 5: Analyse SDS-PAGE de l’expression snap T7 RNAP et du test de transcription in vitro. (A) Analyse de purification de la protéine SNAP T7 RNAP, poids moléculaire SNAP T7 RNAP: 119.4kDa. FT = écoulement à partir de la colonne, W1 = fractions d’élution du tampon de lavage contenant des impuretés, E1-3 = fractions d’élution contenant un p.......
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Discussion
Cette étude démontre une approche inspirée de la nanotechnologie de l’ADN pour contrôler l’activité de l’ARN polymérase T7 en couplant de manière covalente un RNAP T7 recombinant marqué N-terminal SNAP avec un oligonucléotide fonctionnalisé BG, qui a ensuite été utilisé pour programmer les réactions TMDSD. De par sa conception, la balise SNAP a été positionnée à la terminaison N de la polymérase, car la terminaison C de l’ARNR T7 de type sauvage est enfouie dans le noyau de la structure protéique et établit des contacts .......
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Déclarations de divulgation
Il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents à déclarer par l’un des auteurs.
Remerciements
L.Y.T.C reconnaît le généreux soutien du Fonds-exploration Nouvelles frontières en recherche (NFRF-E), de la subvention de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et de l’initiative Medicine by Design de l’Université de Toronto, qui reçoit un financement du Fonds d’excellence en recherche Canada First (CFREF).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,5 % polysorbate 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0,5M Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM tampon phosphate de sodium (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Comprimés utilisés pour fabriquer 10 mM |
| de persulfate d’ammonium 10 % (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 centrifuge Unité de filtration | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100 % acétone | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100 % éthanol (EtOH) | Marque maison | 39752-P016-EAAN | |
| 10x tampon de transcription in vitro (IVT) | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) Bio | Basic | A0026 | |
| 1M Isopropyl &beta ;- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M tampon de bicarbonate de sodium | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X Tampon Tris-EDTA (TE) | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M imidazole | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-mercaptoéthanol (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M acétate de sodium | Bio Basic | SRB1611 | |
| 40 % d’acrylamide (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x LDS tampon de chargement d’échantillon de protéine Fisher | Scientific | NP0007 | |
| 5M chlorure de sodium (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x gel loading colorant | New England Biolabs | B7024S | |
| agarose B poudre | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 compétent E. coli | Addgene | C2530H | |
| BLUeye échelle de protéines précolorées | FroggaBio | PM007-0500 | |
| bleu bromophénol | Bio Basic | BDB0001 | |
| bleu coomassie (SimplyBlue SafeStain) | ThermoFisher | LC6060 | |
| colorant cyanine (colorant gel d’acide nucléique SYBR Gold) | Fisher Scientific | S11494 | |
| colorant cyanine (colorant gel d’acide nucléique SYBR Safe) | Fisher Scientific | S33102 | |
| diméthylsulfoxyde sec (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| formamide | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| glycérol | Bio Basic | GB0232 | |
| sulfate de kanamycine | BioShop | KAN201.5 | |
| bouillon de lysogénie | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| oxalate vert de malachite | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N’N'-Tétraméthyléthane-1,2-diamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS tampon courant (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris gel 1,0 mm 12-well | Life Technologies | NP0322BOX | |
| oligonucléotide (cage antisens) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| oligonucléotide ( cage sense) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAA TTAATACGACTCACTATA |
| oligonucléotide (aptamère vert malachite antisens) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| oligonucléotide (sens de l’aptamère vert malachite) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| oligonucléotide (facteur de transcription A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| oligonucléotide (facteur de transcription B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA |
| Oligonucléotide TGGAACTG avec 3' Modification d’amines (tether) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC Colonnes de |
| spin échangeuse d’ions forts Colonnes de spin | Fisher Scientific | 90008 | |
| codant pour les gènes de résistance SNAP T7 RNAP et kanamycine | Genscript | N/A | d’insertion de gène personnalisée |
| (colonne de spin HisPur Ni-NTA) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP mix | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche mini colonne de spin d’ADN rapide | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| Échelle d’ADN Ultra Low Range | Fisher Scientific | 10597012 | |
| urée | BioShop | URE001.1 |
Références
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 4....
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Réimpressions et autorisations
