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Monocouche épithéliale dérivée d’organoïdes : un modèle in vitro cliniquement pertinent pour la fonction de barrière intestinale

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DOI :

10.3791/62074

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29 juillet 2021

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1Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB)

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons la préparation de monocouches épithéliales intestinales dérivées d’organoïdes humains pour étudier la fonction de barrière intestinale, la perméabilité et le transport. Comme les organoïdes représentent la réponse originale du tissu épithélial aux stimuli externes, ces modèles combinent les avantages de l’extensibilité des lignées cellulaires et la pertinence et la complexité des tissus primaires.

Résumé

Dans le passé, les systèmes modèles épithéliaux intestinaux étaient limités aux lignées cellulaires transformées et aux tissus primaires. Ces systèmes modèles ont des limites inhérentes car les premiers ne représentent pas fidèlement la physiologie tissulaire originale et la disponibilité de la seconde est limitée. Par conséquent, leur application entrave la recherche fondamentale et la recherche sur le développement de médicaments. Les organoïdes à base de cellules souches adultes (ci-après appelés organoïdes) sont des miniatures de tissu épithélial normal ou malade dont ils sont dérivés. Ils peuvent être établis très efficacement à partir de différentes régions du tractus gastro-intestinal (GI), ont une extensibilité à long terme et simulent des réponses spécifiques aux tissus et aux patients aux traitements in vitro. Ici, l’établissement de monocouches épithéliales dérivées d’organoïdes intestinaux a été démontré ainsi que des méthodes pour mesurer l’intégrité de la barrière épithéliale, la perméabilité et le transport, la sécrétion de protéines antimicrobiennes, ainsi que l’histologie. De plus, les monocouches dérivées d’organoïdes intestinaux peuvent être enrichies de cellules souches proliférantes et de cellules amplifiant le transit, ainsi que de cellules épithéliales différenciées clés. Par conséquent, ils représentent un système modèle qui peut être adapté pour étudier les effets des composés sur les cellules cibles et leur mode d’action. Bien que les cultures organoïdes soient techniquement plus exigeantes que les lignées cellulaires, une fois établies, elles peuvent réduire les défaillances dans les derniers stades du développement de médicaments car elles représentent vraiment la complexité in vivo de l’épithélium et l’hétérogénéité interpatiente.

Introduction

L’épithélium intestinal agit comme une barrière physique entre le contenu luminal des intestins et le tissu sous-jacent. Cette barrière comprend une seule couche épithéliale d’entérocytes principalement absorbants qui sont reliés par des jonctions serrées, qui établissent de fortes connexions intercellulaires entre les cellules adjacentes. Ces cellules forment une muqueuse épithéliale polarisée qui sépare les côtés apical (lumen) et basolatéral de l’intestin, tout en régulant simultanément le transport paracellulaire des nutriments et des métabolites digérés. En plus des entérocytes, d’autres cellules épithéliales importantes telles que le gobelet, le Paneth et les cellules entéroendocrines contribuent également à l’homéostasie intestinale en produisant du mucus, des peptides antimicrobiens et des hormones, respectivement. L’épithélium intestinal est constamment reconstitué en divisant les cellules souches du récepteur 5 positif (LGR5+) couplées à la protéine G riches en leucine et contenant des protéines G dans le fond des cryptes intestinales produisant des cellules amplifiant le transit (TA) qui migrent vers le haut et se différencient en d’autres types de cellules1. La perturbation de l’homéostasie épithéliale intestinale par des facteurs génétiques et environnementaux, tels que l’exposition à des allergènes alimentaires, des composés médicinaux et des agents pathogènes microbiens, entraîne une perturbation de la fonction de barrière intestinale. Ces affections causent plusieurs maladies intestinales, y compris les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), la maladie cœliaque et la toxicité gastro-intestinale induite par les médicaments2.

Les études sur l’épithélium intestinal sont réalisées à l’aide de plusieurs systèmes de plate-forme in vitro tels que des inserts membranaires, des systèmes d’organes sur puce, des chambres d’Ussing et des anneaux intestinaux. Ces plates-formes conviennent à l’établissement de monocouches épithéliales polarisées avec accès aux côtés apical et basolatéral de la membrane, en utilisant des lignées cellulaires transformées ou des tissus primaires comme modèles. Bien que les lignées cellulaires transformées, telles que les lignées cellulaires colorectales (adéno)carcinomes Caco-2, T84 et HT-29, soient capables de se différencier en entérocytes intestinaux polarisés ou en cellules productrices de mucus dans une certaine mesure, elles ne sont pas représentatives de l’épithélium in vivo car plusieurs types de cellules sont manquants et divers récepteurs et transporteurs sont exprimés de manière aberrante3 . De plus, comme les lignées cellulaires sont dérivées d’un seul donneur, elles ne représentent pas l’hétérogénéité interpatiente et souffrent d’une complexité et d’une pertinence physiologique réduites. Bien que les tissus primaires utilisés dans les chambres d’Ussing et comme anneaux intestinaux soient plus représentatifs de la situation in vivo, leur disponibilité limitée, leur viabilité à court terme et leur manque d’extensibilité les rendent impropres comme milieu pour les études à haut débit (HT).

Les organoïdes sont des cultures épithéliales in vitro établies à partir de différents organes tels que l’intestin, les reins, le foie, le pancréas et les poumons. Il est prouvé qu’ils ont une extensibilité stable à long terme ainsi qu’une stabilité génétique et phénotypique et sont donc des miniatures biologiques représentatives de l’épithélium de l’organe d’origine avec des réponses fidèles aux stimuli externes 4,5,6,7,8,9. Les organoïdes sont efficacement établis à partir de tissus normaux, malades, enflammés ou cancéreux réséqués ou biopsiés, représentant des réponses hétérogènes spécifiques au patient10,11,12,13,14,15,16. Cet article montre comment établir des monocouches épithéliales intestinales dérivées de cultures organoïdes. Des monocouches ont été établies avec succès à partir de cultures organoïdes de l’intestin grêle, du côlon et du rectum. Ce modèle crée une opportunité d’étudier le transport et la perméabilité des cellules épithéliales aux médicaments ainsi que leurs effets toxicologiques sur l’épithélium. De plus, le modèle permet la co-culture avec des cellules immunitaires et des bactéries pour étudier leurs interactions avec l’épithélium intestinal 17,18,19. En outre, ce modèle peut être utilisé pour étudier les réponses aux thérapies d’une manière spécifique au patient et initier des efforts de dépistage pour rechercher la prochaine vague de thérapies axées sur la barrière épithéliale. Une telle approche pourrait être étendue à la clinique et ouvrir la voie à des traitements personnalisés.

Bien que les monocouches épithéliales de ce protocole soient préparées à partir d’organoïdes intestinaux normaux humains, le protocole peut être appliqué et optimisé pour d’autres modèles organoïdes. Les monocouches organoïdes épithéliales sont cultivées dans un milieu d’expansion organoïde intestinal contenant Wnt pour soutenir la prolifération des cellules souches et représenter la composition cellulaire de la crypte intestinale. Les organoïdes intestinaux peuvent être enrichis pour avoir différents destins épithéliaux intestinaux, tels que les entérocytes, Paneth, gobelet et cellules entéroendocrines, en modulant les voies Wnt, Notch et du facteur de croissance épidermique (EGF). Ici, après l’établissement de monocouches en milieu d’expansion, elles sont entraînées vers des cellules épithéliales intestinales plus différenciées, comme décrit précédemment 20,21,22,23,24,25. À des fins de criblage, en fonction du mode d’action du composé d’intérêt, de ses cellules cibles et des conditions expérimentales, les monocouches peuvent être dirigées vers la composition cellulaire de choix pour mesurer les effets du composé avec des lectures fonctionnelles pertinentes.

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Protocole

1. Préparer les réactifs pour la culture

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à l’intérieur d’une armoire de biosécurité et suivez les directives standard pour travailler avec des cultures cellulaires. La lumière ultraviolette est utilisée pendant 10 minutes avant de démarrer l’armoire de biosécurité. Avant et après utilisation, la surface de l’armoire de biosécurité est nettoyée avec un papier de soie trempé dans de l’éthanol à 70%. Pour faciliter la formation de gouttes tridimensionnelles de matrice extracellulaire (ECM), gardez un stock préavertissé de plaques de 96, 24 et 6 puits prêtes dans l’incubateur à 37 ° C.

  1. Préparation du milieu basal
    1. Préparer le milieu basal (BM) dans un milieu Eagle modifié de 500 mL d’Advanced Dulbecco avec le milieu F-12 (Ad-DF) du mélange nutritif de jambon en ajoutant 5 mL de glutamine de 200 mM, 5 mL d’acide 4-(2-hydroxyétrolethanesulfonique (HEPES) et 5 mL de solutions de pénicilline/streptomycine (stylo/streptocoque) (10 000 U/mL ou 10 000 μg/mL). Celui-ci peut être conservé au réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 4 semaines.
  2. Sources Wnt
    1. Préparer le milieu conditionné Wnt3a (Wnt3aCM) selon la méthode26 décrite précédemment.
      REMARQUE: Récemment, un Wnt de substitution de nouvelle génération (NGS-Wnt), qui soutient également l’expansion des organoïdes intestinaux humains, a été généré27.
  3. Préparation du milieu de base organoïde intestinal
    REMARQUE: Utilisez tous les facteurs de croissance et réactifs conformément aux recommandations du fabricant. Utilisez de petites aliquotes et évitez les cycles de gel-dégel; les facteurs de croissance fonctionnels sont essentiels à la réussite de la culture organoïde.
    1. Préparer 2x milieu de base organoïde intestinal concentré (2x IBM) en complétant BM avec 1 μM A83-01, 2,5 mM de N-acétylcystéine, 2x supplément de B27, 100 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain (hEGF), 10 nM de gastrine, 200 ng/mL hNoggin et 100 μg/mL d’une formulation antimicrobienne pour les cellules primaires (voir la Table des matières).
    2. Aliquotez les 2x IBM et congelez à -20 °C jusqu’à 4 mois. Au besoin, décongeler une aliquote pendant la nuit à 4 °C ou pendant plusieurs heures à température ambiante (RT).
    3. Pour préparer le milieu d’expansion organoïde intestinal (IEM), complétez 2x IBM avec 50% Wnt3aCM ou 50% BM et 0,5 nM NGS-Wnt, 250 ng / mL humain Rspondin-3 (hRspo3), 10 mM de nicotinamide et 10 μM SB202190.
  4. Préparation du milieu de différenciation organoïde intestinale
    1. Préparer le milieu de différenciation des entérocytes (eDM) en complétant 2x IBM avec 50% de BM, 250 ng / mL hRspo3 et 1,5 μM Wnt inhibiteur de la voie (IWP-2). Conservez l’eDM à 4 °C jusqu’à 10 jours.
    2. Préparez le milieu de différenciation combinée (cDM) en complétant 2x IBM avec 40% BM et 10% Wnt3aCM ou 50% BM et 0,1 nM NGS-Wnt, 250 ng / mL hRspo3, 10 μM DAPT et 100 nM PD0325901. Conserver le cDM à 4 °C jusqu’à 10 jours.
  5. Manipulation de la matrice extracellulaire (ECM)
    REMARQUE: Préparer la matrice extracellulaire (ECM) (voir le tableau des matériaux) conformément à la recommandation du fabricant.
    1. Décongeler l’ECM pendant la nuit sur la glace; transférer l’ECM de la bouteille dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette de 5 mL, les deux pré-refroidies à -20 °C. Recongeler les aliquotes une seule fois à -20 °C. Une fois décongelé, conservez l’ECM au réfrigérateur à 4 °C pendant 7 jours. Incuber pendant au moins 30 min sur de la glace avant utilisation.
      REMARQUE: Mélangez correctement l’ECM et assurez-vous qu’il fait froid avant d’intégrer des cryptes ou des organoïdes.

2. Cultures organoïdes

  1. Établissement de cultures à partir d’organoïdes congelés
    REMARQUE: Laissez BM atteindre RT et gardez une aliquote de 12 mL, chauffée à 37 ° C, prête avant de commencer la procédure de décongélation d’un cryovial contenant des organoïdes congelés.
    1. Décongeler rapidement le cryovial organoïde en agitant dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un morceau de glace. Ajouter immédiatement 500 μL de BM chaud goutte à goutte au cryovial, et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour diluer le milieu de congélation et mélanger le contenu avec soin.
    2. À l’aide d’une pipette P1000, transférer les organoïdes dans un tube conique de 15 mL et ajouter 1 mL de BM chaud tout en mélangeant doucement le fond du tube. Pipet de haut en bas plusieurs fois pour diluer le milieu de congélation et mélanger le contenu avec soin.
    3. Ajouter jusqu’à 12 mL de BM chaud goutte à goutte au tube conique de 15 mL contenant les organoïdes, et pipeter de haut en bas avec une pipette stérile de 10 mL pour remettre en suspension doucement les organoïdes.
    4. Centrifuger la suspension organoïde pendant 5 min à 85 × g et 8 °C. Jeter soigneusement le surnageant sans perturber la pastille et remettre en suspension les organoïdes dans 30 % v/v d’IEM complété par 10 μM Y27632 ou d’autres inhibiteurs de la sérine/thréonine kinase formant des bobines enroulées associées aux rhos associés.). Placez le tube sur de la glace.
    5. Ajouter 70% v/v d’ECM dans le tube conique de 15 mL contenant les organoïdes. Mélanger la suspension organoïde en maintenant le tube conique de 15 mL sur la glace et ensemencer 5 μL de la suspension pour vérifier la densité (Figure 1A). Continuer le placage si la densité est appropriée; si la densité est trop élevée, ajoutez plus de solution IEM/ECM dans le même rapport de 30-70% v/v, respectivement.
    6. Dans chaque puits d’une plaque préaverdie de 24 puits, semer 50 μL de la suspension organoïde en pipetant 5 gouttes séparées de 10 μL (figure 1B). Tournez la plaque à l’envers et laissez-la dans l’armoire de biosécurité pendant 5 min. Transférez la plaque encore à l’envers dans l’incubateur à 37 °C et laissez-la encore 30 min.
    7. Ajouter 500 μL d’IEM avec 10 μM d’inhibiteur de ROCK à chaque puits et transférer la plaque à l’incubateur. Imagez une goutte régulièrement pour surveiller la croissance et actualisez l’IEM tous les 2-3 jours en aspirant l’ancien milieu et en ajoutant 500 μL d’IEM frais.
    8. Passage des organoïdes une fois qu’ils se sont remis correctement de la décongélation et qu’ils ont atteint la bonne taille pour être traités (figure 1C), comme décrit à la section 2.2.
  2. Passage d’organoïdes intestinaux
    REMARQUE: Refroidir l’ECM sur la glace pendant au moins 30 min et maintenir l’IEM à RT pendant au moins 1 h avant utilisation.
    1. Utilisez le milieu d’un puits de culture pour briser les dômes organoïdes à l’aide d’une pointe filtrante à faible rétention de 1250 μL et transférez le contenu du puits dans un tube conique étiqueté de 15 mL. Lavez le puits avec 1 mL de BM et transférez-le dans le même tube conique de 15 mL.
    2. Répétez les étapes 2.2.1 et 2.2.2 avec tous les autres puits (un maximum d’une demi-plaque ou 600 μL de gouttes ECM peut être lavé et ajouté à un tube conique de 15 mL).
    3. Ajouter BM pour remplir le tube jusqu’à 12 mL et pipeter de haut en bas 10x à l’aide d’une pipette de 10 mL. Centrifuger à 85 × g pendant 5 min à 8 °C.
    4. Avant de retirer le BM, vérifiez au microscope si tous les organoïdes sont agglomérés au fond du tube conique de 15 mL (Figure 1D). S’il n’y a pas d’ECM superposant la pastille organoïde ou si la couche ECM est propre ou ne contient que des débris, des cellules individuelles ou très peu d’organoïdes par rapport aux organoïdes agglomérés, aspirez le surnageant et pipetez l’ECM en superposant la pastille organoïde très soigneusement à l’aide d’une pipette P200.
      REMARQUE: Les organoïdes peuvent être piégés dans l’ECM et ne sédimentent pas sous forme de granulés compacts en raison de la faible force de centrifugation. Si l’ECM contient des organoïdes, centrifuger à nouveau le tube à 450 × g pendant 5 min à 8 °C et retirer soigneusement le surnageant comme décrit au point 2.2.4. S’il existe plusieurs tubes coniques de 15 mL, ils peuvent être regroupés après l’étape 2.2.4.
    5. Ajouter 1 mL de BM à chaque pastille (d’un volume de 50 à 200 μL, selon la culture organoïde et la densité) et remettre en suspension avec précaution. Pipet les organoïdes de haut en bas au moins 5x pour les cisailler, en évitant la formation de mousse. Vérifiez au microscope si les organoïdes sont perturbés (Figure 2A). Si les organoïdes sont perturbés, passez à l’étape 2.2.7; si les organoïdes ne sont pas perturbés, pipetez-les encore 5x. Cette fois, touchez la paroi du tube en plastique avec la pointe de la pipette pour exercer plus de force mécanique pour perturber les organoïdes.
      REMARQUE : Le cisaillement mécanique des organoïdes kystiques (Figure 1C) et bourgeonnants (Figure 1E) est possible avec une pointe de pipette en plastique de 200 μL ou 10 μL montée sur une pointe de filtre à faible rétention de 1250 μL (Figure 1F), en fonction du volume requis pour perturber les organoïdes. L’utilisation d’une pipette en verre rétréci (figure 1F) est recommandée lorsque plus de 200 μL d’ECM contenant les organoïdes sont traités (un puits d’une plaque de 6 puits ou 4 puits d’une plaque de 24 puits).
    6. Vérifiez à nouveau au microscope si les organoïdes sont perturbés. En cas de perturbation, passez à l’étape suivante; sinon, pipetez les organoïdes jusqu’à 20x, en vérifiant régulièrement les organoïdes au microscope. Si les organoïdes ne sont toujours pas perturbés, ajoutez 25% de réactif de dissociation cellulaire v/v 1 (voir le tableau des matériaux) à la suspension, incubez au bain-marie à 37 °C pendant 2 min et pipetez les organoïdes jusqu’à 20x, en vérifiant régulièrement les organoïdes au microscope pour vous assurer qu’ils ne sont pas digérés en cellules individuelles.
    7. Ajouter jusqu’à 12 mL de BM au tube conique de 15 mL et laver la pastille organoïde en pipetant de haut en bas. Centrifuger à 85 × g pendant 5 min à 8 °C. Jetez le surnageant et ajustez la concentration finale à 70 % v/v ECM en ajoutant IEM et ECM à la pastille organoïde.
    8. Commencez à réutiliser la pastille organoïde avec le double du volume d’IEM/ECM collecté pour le passage, et ensemencez 5 μL de la suspension pour vérifier la densité. Poursuivre le placage si la densité est appropriée (figure 2B); ajouter plus de solution IEM/ECM si la densité est trop élevée. Ajouter 200 μL de suspension à chaque puits d’une plaque préavertissée de 6 puits, en faisant des gouttes séparées de 10 μL de volume.
    9. Tournez la plaque à l’envers et laissez-la dans l’armoire de biosécurité pendant 5 min. Transférez la plaque encore à l’envers dans l’incubateur à 37 °C, en la laissant encore 30 min. Ajouter 2 mL d’IEM avec un inhibiteur de ROCK de 10 μM à chaque puits et transférer la plaque à l’incubateur.
    10. Imagez une goutte régulièrement pour surveiller la croissance et actualisez l’IEM tous les 2-3 jours en aspirant l’ancien milieu et en ajoutant 2 mL d’IEM frais.
  3. Passage d’organoïdes intestinaux pour la préparation de monocouches épithéliales
    1. Passage des organoïdes 3 jours avant le prélèvement pour la préparation monocouche en suivant le même protocole de passage décrit à la rubrique 2.2, à une exception près. À l’étape 2.2.7, remettre en suspension les organoïdes dans 1 à 1,5 fois le volume de départ de l’IEM/ECM pour avoir une densité et un potentiel d’expansion plus élevés lorsqu’ils sont récoltés pour la préparation monocouche (Figure 3A).

3. Préparation monocouche épithéliale

  1. Cultiver des monocouches épithéliales sur des inserts membranaires à 24 et 96 puits avec une variété de types de plaques disponibles (tableau 1). Utilisez des inserts à membrane de système à haut débit (HTS) pour les deux tailles, car ils contiennent un plateau intégré avec les inserts à membrane et une plaque réceptrice. Pour le format à 24 puits, l’utilisation de plaques avec des inserts à membrane amovibles séparés est également possible.
    REMARQUE: Différents types de membranes (polyéthylène téréphtalate (PET) ou polycarbonate) et tailles de pores (0,4-8,0 μm) sont disponibles et peuvent être utilisés en fonction des besoins expérimentaux. Les monocouches ne peuvent être imagées par champ clair que lorsque des inserts avec des membranes PET sont utilisés. Les membranes étanches à la lumière bloquent les fuites de lumière fluorescente du compartiment apical vers le compartiment basolatéral et peuvent être envisagées lorsque le transport dynamique ou la perméabilité des substrats marqués par fluorescence sont étudiés. Le protocole actuel utilise des inserts membranaires à 24 puits; les adaptations pour les inserts membranaires à 96 puits sont décrites à la rubrique 5. Selon la densité, la morphologie et la taille des organoïdes (figure 3A), 6 puits d’une plaque de 6 puits (comme ensemencé à la section 2.3) suffisent pour ensemencer une plaque complète de 24 puits d’inserts membranaires.
  2. Inserts de membrane de revêtement avec ECM
    REMARQUE: S’il y a des doutes sur le fait d’avoir suffisamment de cellules, enduire les inserts après avoir compté les cellules. Il s’agit d’éviter un revêtement inutile et la perte des inserts de membrane coûteux.
    1. Placez les inserts de membrane dans la plaque de support de l’armoire de biosécurité. Diluer l’ECM 40x dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) glacée de Dulbecco avec Du2+ et Mg2+, et pipeter 150 μL de l’ECM dilué dans le compartiment apical de chaque insert. Incuber la plaque à 37 °C pendant au moins 1 h.
  3. Préparation des cellules pour l’ensemencement
    1. Aliquotes préwarm du réactif de dissociation cellulaire 2 au bain-marie (37 °C). Préparer 2 mL de réactif pour chaque puits d’une plaque de 6 puits.
    2. Transférer la plaque de culture contenant les organoïdes (préparés à la section 2.3) de l’incubateur à l’armoire de biosécurité. Traiter les organoïdes, comme décrit aux étapes 2.2.1.-2.2.4. Ne regroupez pas plusieurs tubes en un seul tube.
    3. Remplissez le tube, contenant des organoïdes à partir d’un maximum de 3 puits d’une plaque de 6 puits, jusqu’à 12 mL avec DPBS (sans Ca2+ et Mg2+), et pipetez de haut en bas 10x à l’aide d’une pipette de 10 mL. Centrifuger à 85 × g pendant 5 min à 8 °C, et aspirer le surnageant sans perturber la pastille organoïde.
    4. Ajouter 2 mL du réactif de dissociation cellulaire préavertissé 2 par puits d’une plaque de 6 puits utilisée comme matériau de départ et remettre en suspension. Incuber les tubes en diagonale ou horizontalement pendant 5 min au bain-marie à 37 °C, pour éviter l’enfoncement des organoïdes au fond du tube.
    5. Pipet de haut en bas 10x à l’aide d’une pipette en plastique stérile de 5 mL ou d’une pipette P1000, en fonction du volume total du réactif de dissociation cellulaire. Vérifiez la suspension organoïde au microscope pour voir si un mélange de cellules individuelles et de quelques amas cellulaires constitués de 2 à 4 cellules s’est formé (Figure 3B). Si nécessaire, poursuivre la digestion en répétant les étapes 3.3.4-3.3.5 (ne pas augmenter le volume du réactif de dissociation cellulaire) jusqu’à ce que le mélange ressemble à la figure 3B.
      REMARQUE: Évitez de digérer complètement les organoïdes en cellules individuelles. Il est nécessaire d’avoir quelques petits groupes de cellules (c’est-à-dire des groupes de 2 à 4 cellules).
    6. Arrêter la dissociation cellulaire en ajoutant jusqu’à 12 mL de BM, y compris un inhibiteur de ROCK de 10 μM , à la suspension cellulaire. Centrifuger à 450 × g pendant 5 min à 8 °C, et aspirer le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Lorsque vous manipulez la même culture organoïde dans plusieurs tubes coniques de 15 mL, regroupez les pastilles cellulaires et remettez-les en suspension dans 12 mL de BM.
    7. Filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire de 40 μm préhumidifiée avec du BM et récolter l’écoulement dans un tube conique de 50 mL. Lavez la passoire avec 10 mL de BM et récoltez l’écoulement dans le même tube conique de 50 mL.
    8. Transférer la suspension de cellules tendues dans deux nouveaux tubes coniques de 15 mL. Centrifuger à 450 × g pendant 5 min à 8 °C, et aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans 4 mL d’IEM complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM par plaque de culture complète utilisée comme matériau de départ.
    9. Mélangez une petite quantité de suspension cellulaire dans un rapport de 1: 1 avec du bleu de trypan pour compter. Comptez les cellules vivantes, et non bleues (Figure 3C), et calculez le nombre total de cellules vivantes. En petits amas, comptez chaque cellule individuelle.
    10. Préparer une suspension cellulaire contenant 3 × 106 cellules vivantes par mL d’IEM complétée par un inhibiteur de ROCK de 10 μM.
  4. Ensemencement de cellules sur inserts de membrane en polyester
    1. Aspirez soigneusement le DPBS des inserts revêtus d’ECM (étape 3.2.1), tout en conservant la plaque horizontalement. Pipeter 800 μL d’IEM complété par un inhibiteur de ROCK dans chaque compartiment basolatéral. Pipeter 150 μL de la suspension cellulaire préparée à l’étape 3.3.10 sur la membrane revêtue d’ECM dans le compartiment apical goutte à goutte. Par assiette, assurez-vous d’avoir au moins un puits « vierge » avec BM seulement.
    2. Une fois que les cellules ont sédimenté sur la membrane, mesurez la résistance électrique transépithéliale (TEER), comme décrit à la section 4.1, et imagez les inserts membranaires à l’aide d’un microscope. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Mesurez TEER tous les jours et acquérez régulièrement des images pour surveiller la formation de monocouches (Figure 4A-D).
  5. Monocouches rafraîchissantes
    REMARQUE: Rafraîchissez le milieu tous les 2-3 jours, en respectant l’ordre suivant pour maintenir une pression hydrostatique positive au-dessus des cellules et empêcher les cellules d’être poussées hors de la membrane. Tout en rafraîchissant le milieu, assurez-vous que la monocouche, qui est visible lors de l’aspiration du milieu, n’est pas endommagée par la pointe de la pipette.
    1. Retirer le milieu des compartiments basolatéraux de la plaque contenant les inserts membranaires. Ensuite, aspirez soigneusement le milieu des compartiments apicals des inserts membranaires.
    2. Ajouter 150 μL d’IEM frais goutte à goutte dans chaque compartiment apical, puis ajouter 800 μL d’IEM frais à chaque compartiment basolatéral.
  6. Enrichissement de la monocouche pour les types de cellules épithéliales intestinales souhaitées
    1. Laisser la monocouche devenir confluente dans l’IEM, correspondant à une valeur TEER d’environ 100 Ω·cm² (calculée à l’étape 4.1.1.4). Vérifiez au microscope si les monocouches se sont complètement formées (figure 4D) et s’il n’y a pas de trous (comme on le voit à la figure 4B, C).
    2. Retirez soigneusement l’IEM des compartiments basolatéral et apical des inserts membranaires et remplacez-le par de l’eDM ou du cDM comme préparé à la section 1.4. Cultivez la monocouche pendant encore 3-4 jours dans le milieu de différenciation spécifique pour enrichir les cellules organoïdes avec le type de cellule spécifique souhaité. Actualisez le milieu tous les 2-3 jours, comme décrit à la rubrique 3.4.
    3. Mesurez LE TEER quotidiennement et acquérez des images régulièrement si vous le souhaitez (Figure 5A-C).
      REMARQUE: La valeur TEER qui indique une monocouche enrichie entièrement organisée varie selon la culture organoïde; en règle générale, les valeurs TEER augmentent jusqu’à 600 et peuvent augmenter jusqu’à 1000 Ω·cm2 (comme calculé à l’étape 4.1.1.4) après 3 jours dans les milieux de différenciation et sont stables pendant 3-5 jours.

4. Lectures de tests monocouches épithéliales

  1. Mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER)
    REMARQUE: Les mesures TEER sont largement acceptées comme méthode d’analyse de la dynamique des jonctions serrées et de l’intégrité de la fonction de barrière dans les modèles biologiques de barrières physiologiques, tels que les monocouches épithéliales28,29. L’augmentation du TEER après différenciation en raison de l’interaction cellulaire accrue aux jonctions serrées peut être mesurée à l’aide d’un compteur TEER manuel ou d’un robot de mesure TEER automatisé.
    1. Mesure de TEER à l’aide d’un compteur TEER manuel
      1. Nettoyez l’électrode avec de l’éthanol à 70 % et laissez-la sécher à l’air libre à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Placez l’électrode dans un tube contenant du BM. Connectez l’électrode au compteur TEER manuel. Tournez le commutateur Fonction pour mesurer en Ohms (Ω). Allumez l’interrupteur d’alimentation.
      2. Placez l’électrode courte dans le compartiment apical de l’insert, tandis que l’électrode longue est positionnée dans le compartiment basolatéral (figure 6A). Évitez de toucher la monocouche.
      3. Mesurez la résistance dans le puits à blanc (Rblanc), puis mesurez les échantillons restants (échantillon R)de la même manière. Lavez l’électrode avec BM entre des échantillons de conditions différentes. Nettoyez d’abord l’électrode avec de l’eau de demi, puis avec de l’éthanol à 70% et laissez-la sécher à l’air.
      4. Calculer le TEER (Ω·cm2): [Échantillon R (Ω) - Rblanc (Ω)] × surface de la membrane (cm2) (tableau 1 et figure 6B).
    2. Mesure de TEER à l’aide d’un robot de mesure TEER automatisé (Table des matériaux)
      1. Effectuez des mesures TEER automatisées lors de l’utilisation de systèmes HTS pour des plaques HTS de 96 et 24 puits contenant des inserts membranaires. Utilisez différentes électrodes pour la mesure TEER pour les deux types (inserts à membrane HTS 24 et 96). Pour mesurer TEER à l’aide d’un robot de mesure TEER automatisé, suivez les instructions du fabricant.
  2. Mesure de l’intégrité et de la perméabilité de la barrière épithéliale
    REMARQUE: Ce protocole introduit la perméabilité jaune lucifer du compartiment apical au compartiment basolatéral comme indication de l’intégrité monocouche. Cette section décrit la mesure de fluorescence dans le compartiment basolatéral après une étape d’incubation de 1 h pour évaluer la perméabilité monocouche et donc l’intégrité de la barrière. Cette mesure est un test de point final et est particulièrement utile lors de l’essai des composés pour leur effet sur l’intégrité de la barrière.
    1. Décongelez Lucifer Yellow sur la glace et laissez BM s’équilibrer à RT. Pour une plaque de 24 puits d’inserts membranaires, préparer 5 mL de solution de travail de 60 μM de jaune de lucifer dans du BM.
      REMARQUE: Lucifer Yellow est sensible à la lumière. Préparez les dilutions dans des tubes stériles sombres de 1,5 mL et effectuez toutes les étapes avec le voyant de l’armoire de biosécurité éteint.
    2. Retirez soigneusement le milieu des compartiments basolatéral et apical des inserts membranaires, comme décrit à l’étape 3.5.1. Si vous le souhaitez, grattez une monocouche non traitée à l’aide d’une pointe de pipette comme contrôle positif de la fuite de jaune Lucifer à travers une barrière endommagée.
    3. Ajouter 150 μL de BM avec 60 μM de jaune de lucifer à chaque compartiment apical et ajouter 800 μL de BM sans jaune de lucifer à chaque compartiment basolatéral. Placer la plaque sur un agitateur à 37 °C, 50 tr/min pendant 60 min.
    4. En attendant, préparez une courbe standard de Lucifer Yellow en BM en commençant par la solution de travail préparée à l’étape 4.2.1. Diluer 1:3 à chaque étape jusqu’à ce qu’une concentration de 3 nM soit atteinte. Inclure un contrôle négatif (BM uniquement).
    5. Transférer 100 μL de chaque étalon en triple exemplaire sur une plaque transparente de 96 puits. Après 60 min d’incubation, retirez les inserts membranaires et transférez 100 μL de chaque puits basolatéral (étape 4.2.3) en triple exemplaire sur la plaque transparente de 96 puits. Mesurer la fluorescence de la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque à une longueur d’onde d’excitation de 430 nm et à une longueur d’onde d’émission de 530 nm.
    6. Après avoir corrigé la valeur de contrôle négative (BM uniquement), utilisez les valeurs de courbe standard pour calculer la concentration de jaune de Lucifer dans le compartiment basolatéral (concentration finale du récepteur (μM)).
    7. Calculer le coefficient de perméabilité apparente (application P) selon la formule suivante (Figure 6C) :
      figure-protocol-1
    8. Pour une plaque de 24 puits contenant des inserts membranaires, utilisez la formule suivante :
      figure-protocol-2
  3. Fixation de monocouches et préparation de blocs de paraffine pour l’histologie
    REMARQUE: Les monocouches épithéliales peuvent être utilisées pour la coloration histologique pour l’évaluation de leur composition cellulaire, de leur polarité et de l’expression de différentes protéines d’intérêt telles que les protéines jonctionnelles, la prolifération ou les marqueurs de différenciation. Cette section décrit la préparation de blocs de paraffine pour la coloration histologique.
    1. Retirez soigneusement le milieu des compartiments basolatéral et apical des inserts membranaires, comme décrit aux étapes 3.5.1.
    2. Lavez les monocouches en ajoutant 150 μL de DPBS (sans Ca2+ et Mg2+) à chaque compartiment apical et 800 μL à chaque compartiment basolatéral. Aspirer soigneusement le DPBS à nouveau, d’abord à partir du compartiment basolatéral, puis du compartiment apical.
      REMARQUE: Le compartiment basolatéral restera vide à partir de cette étape.
    3. Dans une hotte, ajouter 150 μL de paraformaldéhyde à 4 % à chaque compartiment apical et incuber pendant 30 min à TA.
      REMARQUE: À partir de cette étape, effectuez toutes les actions de cette section à l’intérieur d’une hotte, car le paraformaldéhyde est toxique.
    4. Aspirer soigneusement le fixateur des compartiments apicals des inserts membranaires et l’éliminer sous forme de déchets halogènes liquides.
      REMARQUE: À partir de cette étape, éliminer tous les déchets liquides en tant que déchets halogènes liquides.
    5. Lavez les monocouches en ajoutant 200 μL de DPBS (sans Ca2+ et Mg2+) à chaque compartiment apical, et aspirez à nouveau soigneusement le DPBS. Répétez cette étape une fois de plus.
    6. Ajouter 200 μL d’alcool éthylique (EtOH) à 25 % dans chaque compartiment apical et incuber pendant 15 min à TA. Après 15 min, aspirer soigneusement les 25% d’EtOH des compartiments apicaux des inserts membranaires. Répéter avec une solution d’EtOH à 50%, puis avec une solution d’EtOH à 70%.
    7. Ajouter 200 μL de 70 % d’EtOH dans chaque compartiment apical et envelopper la plaque de parafilm. Conservez-le à 4 °C jusqu’à nouvel usage.
    8. Aspirez soigneusement l’EtOH à 70% et utilisez un scalpel pour couper soigneusement les membranes monocouches des inserts. Couper du côté basolatéral, autour du bord de l’insert.
    9. Préparez des blocs de paraffine en suivant la procédure standard.
      1. Lorsque la paraffine est encore chaude, prenez la monocouche de la paraffine avec une pince à épiler et placez-la sur une surface prérefroidie.
      2. Veillez à ne pas endommager la monocouche. Coupez la monocouche en deux à l’aide d’une lame à un seul bord.
      3. Lorsque la paraffine au bas de la cassette commence à se solidifier, utilisez une pince chauffante pour placer les deux parties monocouches dans la paraffine, l’une à côté de l’autre avec le côté droit vers le bas et dans une direction verticale pour vous assurer que la monocouche sera verticale dans le coupé.
    10. Lorsque les blocs de paraffine sont prêts, coupez les blocs à l’aide d’un microtome et faites des lames de sections de 4 μm d’épaisseur en suivant la procédure standard. Assurez-vous que les monocouches se retrouvent verticalement dans le coupé.
    11. Effectuer des colorations histologiques comme décrit précédemment 7,9. Utilisez l’hématoxyline et l’éosine (H & E), Ki67, mucine-2 (MUC2) et Alcian Blue pour montrer la morphologie générale, les cellules prolifératives, la production de mucus et les cellules de gobelet, respectivement (Figure 6E).
      REMARQUE: Des marqueurs de différenciation supplémentaires, tels que le lysozyme pour les cellules de Paneth, peuvent également être utilisés. Ce marqueur n’est pas présenté à la figure 6E car les cellules de Paneth sont présentes dans l’épithélium de l’intestin grêle plutôt que dans l’épithélium du côlon.
  4. Mesure des protéines sécrétées dans un surnageant moyen
    1. Mesurer les niveaux de lysozyme dans le surnageant apical des monocouches iléales (voir la figure 6D) à l’aide du kit répertorié dans la Table des matériaux. Si vous le souhaitez, mesurez les niveaux de différentes cytokines et d’autres protéines d’intérêt.
  5. Analyse de l’expression génique
    1. Quantifier les effets des milieux de différenciation sur l’expression des gènes marqueurs des cellules épithéliales à l’aide de la réaction en chaîne quantitative transcription inverse-polymérase (qRT-PCR).
      1. Lyser les monocouches dans 350 μL de tampon de lyse d’ARN suivi d’une isolation d’ARN selon les instructions du fabricant. Effectuer la synthèse de l’ADNc et les qPTR, comme décrit précédemment 7,9, à l’aide des kits de synthèse d’ADNc, du mélange maître et des oligonucléotides énumérés dans la Table des matériaux.

5. Mise à l’échelle vers des plaques de 96 puits contenant des inserts à membrane

REMARQUE: Préparer des monocouches épithéliales pour des dépistages de médicaments à haut débit ou des conditions de milieu multiples à l’aide de plaques HTS 96 puits contenant des inserts membranaires.

  1. Adaptations lors de la préparation de monocouches au format 96 puits
    1. Suivez toutes les étapes décrites dans le présent protocole pour les plaques à 24 puits contenant des inserts membranaires, en changeant les volumes et les numéros de cellule par ceux décrits dans le tableau 1. Pour la préparation de monocouches sur des plaques à 96 puits avec des inserts à membrane, procédez comme décrit à la section 3 avec les différences suivantes.
      1. Environ 9 puits d’une plaque de culture de 6 puits avec une densité organoïde représentée à la figure 3A sont nécessaires pour ensemencer une plaque complète de 96 puits avec des inserts membranaires. À l’étape 3.2.1, prélaquez les membranes avec 67 μL d’ECM dilué 40x dans du DPBS (avec Ca2+ et Mg2+).
      2. À la section 3.5, transférer d’abord la plaque intégrale des inserts membranaires sur une autre plaque de 96 puits pour permettre un rafraîchissement moyen des compartiments apical et basolatéral.

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Résultats

La figure 1A montre une image représentative en champ clair d’organoïdes intestinaux après les avoir décongelés d’un cryovial. Il est important de décongeler les organoïdes à haute densité pour assurer une récupération optimale. Les organoïdes sont plaqués dans des plaques de 24 ou 6 puits dans des dômes ECM d’environ 10 μL (Figure 1B). La plupart des organoïdes intestinaux normaux ont une morphologie kystique. Après avoir récupéré du processus de décongélation,...

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Discussion

Ce protocole décrit la manipulation générale et le maintien des organoïdes intestinaux ainsi que la préparation et les applications possibles de monocouches épithéliales dérivées de ces organoïdes. À ce jour, des monocouches ont été préparées avec succès à partir du duodénum, de l’iléon et de différentes régions d’organoïdes du côlon dérivés de tissus intestinaux normaux ainsi que précédemment et activement enflammés (données non publiées). L’application de monocouches organoïdes dérivées du patient facilite l’étude de l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail est soutenu par le Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) allocation de partenariats public-privé (PPP) du secteur néerlandais LSH avec le numéro de projet LSHM16021 Organoïdes comme nouvel outil de modélisation toxicologique à Hubrecht Organoid Technology (HUB) et HUB financement interne au département de modélisation des maladies et de toxicologie. Nous remercions les laboratoires de Sabine Middendorp (Division de gastroentérologie pédiatrique, Wilhelmina Children’s Hospital, UMC, Utrecht) et Hugo R. de Jonge et Marcel J.C. Bijvelds (Département de gastroentérologie et d’hépatologie, Erasmus MC, Rotterdam) d’avoir fourni un soutien technique initial pour la mise en place de monocouches sur inserts membranaires.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 % éthanolFisher Emergo10644795
1250, 300 et 20 µ ; L pointes filtrantes à faible rétentionGreiner bio-one732-1432 / 732-1434 / 732-2383
Tubes coniques 15 mL PlaquesGreiner bio-one188271
24 puitsGreiner bio-one662160
Plaque HTS Fluoroblok Transwell 24 puits (étanche à la lumière)Corning351156
24 puits HTS Transwell plaques (Tableau 1)Corning3378
Plaque 24 puits avec inserts TranswellCorning3470
40 & micro ; Filtre à cellules mPluriSelect43-50040-01
50 mL Tubes coniquesGreiner bio-one227261
6 puits Plaques de culture cellulaireGreiner bio-one657160
Plaque noire 96 puits fond transparentGreiner bio-one655090
Plaques à cycle thermique rapide 96 puitsLife Technologies Europe BV4346907
Plaque Transwell HTS Fluoroblok 96 puitsCorning351162
Plaques Transwell HTS 96 puits (Tableau 1)Corning7369
Plaque de culture transparente 96 puitsGreiner bio-one655180
A83-01Bio-Techne Ltd2939
Accutase Cell Dissociation ReagentLife Technologies Europe BVA11105-01Cell réactif de dissociation 2
Advanced DMEM/F-12Life Technologies Europe BV12634028
supplément B27Life Technologies Europe BV17504001
Microscope de culture cellulaire (microscope optique / optique)Leica
CellTiter-GloPromegaG9683
CentrifugeuseEppendorf
Incubateur 2PHCBI
DAPTSigma-AldrichD5942
traité au DEPC H2OLife Technologies Europe BV750024
solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco avec Ca2+ et Mg2+Life Technologies Europe BV14040091
DPBS, poudre, sans calcium, sans magnésiumLife Technologies Europe BV21600069
EnzChek Lysozyme AssayKit Life Technologies EuropeBV E22013
EVOM2 mètre avec électrode STXWTI
GastrinBio-Techne Ltd3006
Pipettes en verreVolac
GlutaMAXLife Technologies Europe BV35050038
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESLife Technologies Europe BV15630056
Human NogginPeprotech120-10C
Human Rspo3Bio-Techne Ltd3500-RS/CF
IWP-2Miltenyi Biotec130-105-335
Ki67 anticorps primaireSanbioBSH-7302-100
Ki67 anticorps secondaireAgilentK400111-2
Kova International Glasstic Slide avec grilles de comptage FisherEmergo10298483
Hotte à flux laminaireThermo scientific
Lucifer Yellow CH dilithium saltSigma-AldrichL0259
Matrigel, facteur de croissance réduit ( GFR)Matrice extracellulaire (ECM)356231Corning43230324358293Eppendorf
0030 120 086
Micropipettes (1000, 200, 200 et 20 µ ; L)Gilson
MicrotomeLeica
MUC2 anticorps primaireSanta Cruz Biotechnologysc-15334
MUC2 anticorps secondaireVWRVWRKS/DPVR-HRP
Pipette multicanaux (200 µ ; L)Gilson
N-acétylcystéineSigma-AldrichA9165
NGS WntU-Protein ExpressN001-0.5mg
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Oligonucléotide ALPI1/ForwardCustom-madeGGAGTTATCCTGCTCCCC
Oligonucléotide ALPI1/ReverseCustom-madeCTAGGAGGTGAAGGTCCAACG
Oligonucléotide LGR5/ForwardSur mesureACACGTACCCACACAAGCTC
Oligonucléotide LGR5/ReverseSur mesureGGAATGCAGGCCACTGAAAC
Oligonucléotide MUC2/ForwardSur mesureAGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG
Oligonucléotide MUC2/ReverseSur mesureTAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT
Oligonucléotide TBP/Forward SurmesureACGCCGAATATAATCCCAAGCG
Oligonucléotide TBP/ReverseSur mesureAAATCAGTGCCGTGGTTCG
Couvercles adhésifs optiquesLife Technologies Europe BV4311971
PD0325901Stemcell Technologies72184
Pénicilline/streptomycineTechnologies Europe BV15140122
Agitateur à plaquesPanasonic
PowerUp SYBR Green Master MixFisher EmergoA25776
PrimocinInvivoGenANT-PM-2Formulation antimicrobienne pour cellules primaires
Qubit RNA HS AssayKit Life Technologies Europe BVQ32852
Réservoir de réactif pour pipette multicanauxSigma-AldrichCLS4870
REMS AutoSampler avec sonde 24 ou sonde 96CWTI
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain KitThermo scientific87023
RNase-Free DNase SetQiagen79254
RNeasy Mini KitQiagen74106
SB202190Sigma-AldrichS7076
Pipettes sérologiquesGreiner bio-one606180 / 607180 / 760180
Pipette sérologique (Pipet-Aid)Drummond
Lame de rasoir à simple tranchantGEM Scientific
Superscript Système 1er brin pour RT-PCRLife Technologies Europe BV11904018
Tecan Spark 10M lecteur de plaquesTecan
Trypan Blue Solution, 0,4 %Life Technologies Europe BV15250-061
TrypLE Express Enzyme (1x)Life Technologies Europe BV12605-010Réactif de dissociation cellulaire 1
Bain-marieGrant
Y27632 (inhibiteur de ROCK)AbMoleM1817
de culture cellulaire la Life

Références

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Monocouche d riv e d organo desint grit de la barri re pith lialer sistance lectrique transepithelialeculture d organo desperm abilit pith lialeorgano des de cellules souchess cr tion de prot ines antimicrobiennesmarqueurs de diff renciation cellulairemembrane Transwell

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