Article de méthode

Un système de purification de protéines à haut débit économique et polyvalent à l’aide d’un adaptateur de plaque multicolonne

DOI :

10.3791/62075

⸱

21 mai 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Liverpool, 2Health Sciences Center, Texas Tech University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un adaptateur de plaque multicolonne permet aux colonnes de chromatographie d’être interfacées avec des plaques de collecte multi-puits pour une affinité parallèle ou une purification par échange d’ions, offrant une méthode de purification de protéines économique à haut débit. Il peut être utilisé sous gravité ou sous vide donnant des quantités de milligrammes de protéines via une instrumentation abordable.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La purification des protéines est impérative pour l’étude de la structure et de la fonction des protéines et est généralement utilisée en combinaison avec des techniques biophysiques. C’est également un élément clé dans le développement de nouvelles thérapies. L’ère évolutive de la protéomique fonctionnelle alimente la demande de purification des protéines à haut débit et de techniques améliorées pour faciliter cela. On a émis l’hypothèse qu’un adaptateur de plaque multicolonne (MCPA) peut interfacer plusieurs colonnes de chromatographie de différentes résines avec des plaques multi-puits pour la purification parallèle. Cette méthode offre une méthode économique et polyvalente de purification des protéines qui peut être utilisée sous gravité ou vide, rivalisant avec la vitesse d’un système automatisé. Le MCPA peut être utilisé pour récupérer des rendements en milligrammes de protéines par une méthode abordable et efficace dans le temps pour la caractérisation et l’analyse ultérieures. Le MCPA a été utilisé pour la purification par affinité à haut débit des domaines SH3. L’échange d’ions a également été démontré via le MCPA pour purifier la chromatographie d’affinité des protéines post Ni-NTA, indiquant comment ce système peut être adapté à d’autres types de purification. En raison de sa configuration avec plusieurs colonnes, la personnalisation individuelle des paramètres peut être effectuée dans la même purification, irréalisable par les méthodes actuelles à base de plaques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les techniques de purification des protéines pour atteindre des quantités milligrammes de protéines purifiées sont impératives pour leur caractérisation et leur analyse, en particulier pour les méthodes biophysiques telles que la RMN. La purification des protéines est également centrale dans d’autres domaines d’étude tels que les processus de découverte de médicaments et les études d’interaction protéine-protéine; cependant, atteindre de telles quantités de protéines pures peut devenir un goulot d’étranglement pour ces techniques1,2,3. La principale méthode de purification des protéines est la chromatographie, qui comprend une variété de méthodes qui reposent sur les caractéristiques individuelles des protéines et leurs étiquettes. En chromatographie d’affinité, les protéines ont un motif protéique ou peptidique supplémentaire qui fonctionne comme une étiquette qui a une affinité pour un certain substrat sur la résine de chromatographie4. La méthode d’affinité la plus courante est la chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) utilisant des protéines marquées par His, tandis qu’une autre méthode populaire est la chromatographie par échange d’ions qui sépare les protéines en fonction de leur charge. Pour une pureté plus élevée, une combinaison de chromatographie d’affinité et d’échange d’ions est fréquemment utilisée ensemble, nécessitant généralement un équipement de laboratoire coûteux pour un débit élevé.

L’ère évolutive de la protéomique fonctionnelle alimente la demande de techniques à haut débit pour purifier non pas des protéines singulières pour une analyse spécifique, mais un grand nombre de protéines simultanément pour une analyse complète et des études à l’échelle du génome5. La chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) est l’une des méthodes les plus utilisées pour la purification des protéines à haut débit6,7 mais ses systèmes automatisés sont coûteux et inabordables pour les petits laboratoires8. Les solutions de rechange plus abordables à base de plaques qui sont actuellement disponibles utilisent l’utilisation d’équipement de laboratoire accessible, comme le vide. Bien que ces méthodes réussissent à améliorer la vitesse de purification, elles ne peuvent atteindre une purification à haut débit qu’à plus petite échelle, ne produisant que des protéines de l’ordre du microgramme. Ces limitations signifient que les plaques filtrantes de 96 puits préemballées (par exemple, de GE Healthcare, qui appartient maintenant à Cytiva) ne peuvent pas être utilisées avant les techniques biophysiques9. La chromatographie gravitationnelle est la méthode de purification la plus rentable; cependant, la configuration de plusieurs colonnes est peu pratique et peut être sujette à des erreurs pour plusieurs protéines.

Un adaptateur de plaque multicolonne (MCPA) a été développé et éprouvé pour exécuter avec succès et commodément des colonnes de chromatographie d’affinité parallèle à la fois pour purifier les domaines SH3 de levure his-tagged10. Le MCPA offre une méthode de purification à haut débit rentable qui ne dépend pas d’instruments coûteux. Sa conception flexible peut purifier efficacement les milligrammes de protéines par de multiples colonnes de chromatographie d’affinité sous gravité ou collecteur sous vide. En outre, le type de résine, le volume et d’autres paramètres peuvent être ajustés pour chaque colonne individuelle pour une optimisation plus rapide. Cette étude démontre que la chromatographie par échange d’ions par le MCPA peut être utilisée en conjonction avec la chromatographie d’affinité par le MCPA pour améliorer la purification du domaine Abp1 SH3. De plus, jusqu’à 24 protéines différentes peuvent être séparées en parallèle à l’aide de ces méthodes.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dénaturation de la chromatographie Ni-NTA

  1. Préparation des mémoires tampons
    Remarque : voir le tableau 1 pour plus de détails sur toutes les mémoires tampons.
    1. Constituer 500 mL de NaOH 0,5 M, en vous assurant d’ajouter d’abord l’eau Milli-Q, puis en ajoutant le NaOH lentement pendant que le bécher est sous agitation. Filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
    2. Préparer 100 mL de sulfate de nickel de 0,1 M et filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
    3. Préparer 50 mL d’imidazole 2 M et filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
    4. Préparer et filtrer 0,22 μm 1,5 L de tampon dénaturant à pH 8,0 constitué de 5,3 mM de Tris-HCl, 4,7 mM de Tris-base (Tris (hydroxyméthyl)méthylamine), 13,7 mM NaH2PO4,86,3 mMNa2HPO4 et 6 M de chlorhydrate de guanidine.
    5. Préparer et filtrer 0,22 μm 500 mL de solution tampon de lyse d’imidazole 10 mM dissous dans un tampon dénaturant (voir 1.1.4) en utilisant le stock d’imidazole 2 M.
    6. Préparer et filtrer 0,22 μm 500 mL de solution tampon de lavage d’imidazole 10 mM dissous dans un tampon de dénaturation (voir 1.1.4) en utilisant le stock d’imidazole 2 M.
    7. Préparer et filtrer 0,22 μm 500 mL de tampon EDTA 100 mM, ajuster le pH à 8 en utilisant 1 M NaOH.
    8. Préparer et filtrer 0,22 μm 500 mL de tampon d’élution composé de 7 mL d’acide acétique glaciaire à 99 % dans du chlorhydrate de guanidine 6 M.
      Remarque : Si vous utilisez des tampons natifs, adaptez-vous conformément au tableau 1.
  2. Cellules lysantes (méthode de dénaturation)
    1. Ajouter 2 mL de tampon de lyse à chaque 1 g de pastilles de cellules E. coli récoltées qui contiennent la protéine his-taggée sur-exprimée. Vortex pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que les cellules soient à nouveau suspendues. Laisser les échantillons sur une bascule pendant 30 minutes à 4 °C.
    2. Pastilles lysées par centrifugeuse à 18 000 x g pendant 30 minutes. Conservez 50 μL de côté dans un congélateur à -20 °C pour analyser plus tard sur un gel SDS-PAGE.
    3. Versez soigneusement les surnageants en vous assurant que le culot n’est pas dérangé. Les lysats doivent être de couleur jaune clair. Si les lysats sont nuageux, échantillonneur à nouveau par centrifugeuse; envisager la sonication si elle est disponible pour dégrader l’acide nucléique.
    4. Filtrer les surnageants à travers une colonne vide (sans résine mais avec filtre) et les recueillir dans un bac de collecte ouvert. Puis transférer dans un tube pour une utilisation à l’étape 1.3.
      REMARQUE: Si vous utilisez les tampons natifs, puis après l’étape 1.2.1, traiter les échantillons à 3 cycles de gel / dégel à -80 ° C ou le processus par sonication ou Français Pressez pour lyser les cellules.
  3. Préparation de la configuration de purification sous vide et équilibrage des colonnes
    REMARQUE: Voir Graphique 1 pour un MCPA mis en place avec 24 colonnes.
    1. Déterminez le nombre de colonnes nécessaires ainsi que le type et le volume de résine souhaités. En règle générale, pour 100 mL de culture d’autoinduction (~ 2 g de granulés) exprimant des domaines SH3 marqués par His à l’aide de plasmides à base de T7, utilisez 0,6 mL de résine Ni-NTA par colonne pour produire environ 3 mg de protéines à partir d’environ 6 mL de lysat.
    2. Insérez le nombre souhaité de colonnes de 12 mL (sans résine mais avec filtre) dans un MCPA pré-assemblé (plaque à long goutte à goutte avec tapis d’étanchéité perforé). Les colonnes doivent tenir parfaitement dans les trous du tapis d’étanchéité qui ont été perforés.
    3. Si moins de 24 colonnes sont utilisées, fermez les trous vides avec une colonne fermée vide.
    4. Prenez une plaque de collecte ouverte et mettez cette plaque dans la base du collecteur sous vide et fermez avec le haut du collecteur.
    5. Placez le MCPA assemblé avec des colonnes sur le dessus du collecteur de vide.
    6. Fixer le tube d’un système de pompe à vide à l’entrée/buse au bas du collecteur de vide.
    7. Assurez-vous que les billes Ni-NTA sont dans une solution à 50% avec de l’éthanol à 20%. Avant de faire quoi que ce soit avec les perles, secouez / mélangez doucement la solution de perles / éthanol pour la remise en suspension uniformément. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 5 mL, pipetter 1,2 mL de la solution à 50 % dans les colonnes. Pendant le pipetage, assurez-vous que les perles restent entièrement mélangées.
    8. Après avoir pipetisé dans les 24 colonnes, allumez la pompe à vide et passez l’éthanol à 20% à travers la colonne et dans la plaque de collecte ci-dessous.
    9. Éteignez la pompe une fois que tout l’éthanol à 20% a traversé toutes les colonnes (la résine Ni-NTA peut tolérer un séchage bref si le vide est toujours appliqué après que le tampon a traversé la colonne). Jetez ce qui se trouve dans la plaque de collecte ouverte dans une boîte à déchets.
      ATTENTION: Tous les déchets des perles Ni-NTA sont dangereux, lors de la manipulation des perles ou de l’élimination des déchets, portez des gants, des lunettes de protection et d’autres EPI. De plus, éliminer tous les déchets de sulfate de nickel dans un contenant distinct en échange de leur élimination individuelle plus tard.
      Remarque : Si la résine est nouvelle ou récemment régénérée, le reste de ces étapes peut être ignoré, passez à la section suivante.
    10. Ajouter 3 volumes de résine (1,8 mL) de tampon EDTA de 100 mM à l’aide d’une seringue de 20 mL ou d’un dispositif de seringue à répéteur avec une seringue de 50 mL. Ensuite, allumez la pompe à vide pour laisser passer le tampon EDTA et éteignez la pompe une fois qu’elle a été lavée.
      Remarque : ce lavage doit supprimer la couleur bleu nickel, mais si ce n’est pas le cas, répétez cette étape jusqu’à ce que toutes les colonnes ont perdu leur couleur bleue. Éteignez la pompe et versez le contenu de la plaque de collecte ouverte dans la boîte à déchets.
    11. Ajouter 3 volumes de résine (1,8 mL) de tampon NaOH de 0,5 M dans chaque colonne avant d’allumer la pompe et de la faire passer à travers chaque colonne. Plaque de collecte vide.
    12. Ajouter 4 volumes de résine (2,4 mL) de sulfate de nickel de 100 mM dans chaque colonne. Allumez la pompe à vide et exécutez-la à nouveau à travers la colonne.
    13. Ajoutez 10 volumes de résine (~ 6000 μL) d’eau Milli-Q et en passant par les colonnes. Éteignez la pompe et versez le contenu de la plaque de collecte dans la boîte à déchets.
    14. Laver les colonnes deux fois avec 4 volumes de résine (2,4 mL) d’imidazole de 10 mM dans un tampon de lavage (dénaturant ou natif) à chaque fois pour éliminer tout excès de nickel et équilibrer. Plaque de collecte vide.
      REMARQUE: Si des colonnes fonctionnent beaucoup plus lentement, détacher la colonne et vérifier l’air peut être poussé à travers le MCPA à l’aide d’une grande seringue. Si ce filtre est débloqué, utilisez une colonne différente avec un nouveau filtre.
    15. Si plusieurs échantillons/protéines différents vont être purifiés sur le MCPA, remplacez la plaque de collecte ouverte par une plaque de collecte de 48 x (5 mL/puits). Cependant, lorsque vous n’utilisez que les mêmes échantillons de protéines sur chaque colonne, il est bon de continuer à utiliser une plaque de collecte ouverte.
  4. Chargement, lavage et élution
    1. Avec le vide éteint, chargez les lysats en colonnes (la quantité de lysat varie, généralement de 1 à 12 mL ou plus et peut être nécessaire pour charger en plusieurs lots). Utilisez un agitateur en plastique mince pour mélanger doucement les perles et le lysat dans la colonne pour maximiser la liaison.
    2. Après avoir mélangé doucement chaque colonne pendant quelques minutes, allumez la pompe à vide et exécutez les lysats à travers les colonnes. Si plusieurs échantillons de protéines sont exécutés, utilisez une plaque de collecte de 48 puits et assurez-vous d’échanger la plaque de collecte contre une autre plaque de 48 puits après que 4 mL ont traversé, car les puits de ces plaques ne peuvent contenir que 4 mL de solution. Continuez à exécuter lysat jusqu’à ce que tous les lysats aient été exécutés à travers une colonne. Figez les plaques de collecte qui contiennent le relais.
      Remarque : colonnes peuvent devenir « bloqué » à l’origine du lysat à circuler dans la colonne beaucoup plus lentement qu’il ne le devrait. Ceci est facilement repéré car les colonnes voisines couleront à un rythme normal. Si cela se produit, il est recommandé de transférer le mélange lysat/résine dans une colonne contenant un filtre frais.
    3. Remplacez la plaque de collecte par une plaque de collecte ouverte vide, puis ajoutez 9 volumes de résine (5,4 mL) de tampon de lavage imidazole de 10 mM à chaque colonne et allumez le vide et faites passer le lavage. Répétez cette opération 4 à 5 fois. Pour éviter le débordement, videz périodiquement la plaque d’rebut.
      1. Ensuite, remplacez la plaque de collecte par une plaque propre appropriée (plaque ouverte pour une seule protéine et 96 bien s’il y a plusieurs protéines, en veillant à ce que A1 soit dans le coin supérieur gauche).
    4. À l’aide d’une seringue répétiteur avec une seringue de 12,5 mL, pipette ~ 1 volume de résine (0,75 mL) de tampon d’élution dénaturant dans chaque colonne.
    5. Pour éviter la formation de protéines, allumez la pompe à vide au réglage le plus bas. Soulevez doucement le MCPA pour vérifier qu’il ne reste plus rien à égoutter dans la plaque de collecte.
      REMARQUE: Une alternative à l’élution avec le vide ou la gravité consiste à pousser un piston de seringue de 10 mL dans le haut de la colonne pour pousser doucement le tampon d’élution à travers la colonne. Faites-le pour chaque colonne, en faisant attention lors du retrait du piston de la seringue pour ne pas déranger les perles au bas de la colonne. Une fois que le tampon d’élution a été poussé à travers, retirez doucement le piston de la seringue de la dernière colonne dans laquelle il a été utilisé et allumez brièvement la pompe à vide pour retirer les dernières gouttes des colonnes.
      1. Si une plaque de collecte de 96 puits a été utilisée, vérifiez la plaque de collecte pour vous assurer que ce qui s’écoule de chaque colonne à travers la longue plaque d’égouttement ne s’écoule que dans un seul puits et que rien ne s’échappe dans les puits voisins sur la plaque de collecte.
    6. Pour la prochaine élution, répétez les 2 étapes ci-dessus et collectez dans un multi-puits frais (différents échantillons) ou une plaque de collecte ouverte (mêmes échantillons).
    7. Étape facultative, prenez une aliquote de 50 μL de chaque élution pour l’analyse de la pureté et de la concentration.
    8. Ajoutez 2 mL d’éthanol à 20% à chaque colonne et passez-le à l’aide de la pompe à vide. Ajoutez ensuite 2 mL d’éthanol à 20 % dans les colonnes et utilisez un agitateur en plastique mince frais pour mélanger l’éthanol à 20 % et les billes avant de passer à un tube de 50 mL pour le stockage à 4 °C. Nettoyez les colonnes et vérifiez que l’eau circule librement à travers chaque colonne, puis nettoyez tout et rangez-le pour une utilisation ultérieure.
      Remarque : certaines colonnes auront finalement leurs filtres bloqués et s’exécuteront trop lentement, ces colonnes doivent être remplacées ou les filtres nettoyés. En tant que tel, il est recommandé de tester périodiquement les filtres en enlevant la résine et en remplissant la colonne d’eau pour voir si elle s’écoule rapidement. Les filtres peuvent être nettoyés en laissant une colonne fermée remplie de tampon d’élution dénaturant et en secouant pendant la nuit.

2. Échange d’ions - Purification d’une seule protéine

  1. Préparation des mémoires tampons
    REMARQUE : Voir le tableau 1 pour plus de détails sur tous les tampons
    1. Préparer un tampon à faible teneur en sel de 2 L : 10 mM Tris pH 8,1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris Base). Solution filtrant à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
    2. Préparer un tampon de sel de 0,5 L élevé : 10 mM Tris pH 8,1, NaCl 4 M. Mesurer 116,9 g de NaCl et porter jusqu’à 0,5 L avec le pH tris de 10 mM 8,1 ci-dessus. Solution filtrant à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
  2. Fabrication de séries de concentration en sel: 0-1 M NaCl.
    REMARQUE: La plage de concentrations de sel peut être ajustée pour chaque protéine.
    1. Installation de tubes à centrifuger étiquetés 24 x 50 mL dans un rack
    2. À l’aide des tampons ci-dessus, préparer des dilutions de NaCl de 24 x 14 mL allant de 0 à 1000 μM. Commencez par ajouter les volumes requis de 4 M NaCl 10 mM Tris. Cela pourrait se faire par incréments de 25 mM ou 50 mM selon les protéines.
    3. Ajoutez ensuite les volumes requis de Tris de 10 mM à chaque tube. Inversez chaque tube plusieurs fois pour mélanger.
  3. Préparation des échantillons
    1. Obtenir les échantillons à purifier par échange d’ions. Si vous le souhaitez, prenez une partie aliquote de 50 μL pour une analyse ultérieure.
      REMARQUE: Les échantillons doivent toujours être conservés au froid; ceux-ci peuvent être des lysats, ou peut-être post Ni-NTA. Les échantillons de Ni-NTA dans les tampons de dénaturation nécessitent une dialyse ou un échange de tampons dans un tampon Tris de 10 mM. Des échantillons de Ni-NTA dans des tampons natifs pourraient être dilués avec un tampon Tris de 10 mM pour réduire la concentration en sel afin que la protéine puisse se lier à la résine IEX.
    2. Faire tourner les échantillons à 18 000 x g pendant 10 minutes.
    3. Versez soigneusement le surnageant dans un bateau de pesée. Évitez de déranger la pastille.
    4. Prenez soigneusement le surnageant dans une seringue de 20 mL et fixez un filtre de 0,22 μm.
    5. Éjectez lentement le surnageant à travers le filtre dans un tube frais de 50 mL.
    6. Si une dilution est nécessaire, diluer le surnageant avec un tampon Tris de 10 mM fabriqué ci-dessus (dans cette expérience, le surnageant a été dilué 1 sur 2). Conserver à 4 °C entre-temps.
  4. Préparation de la configuration de purification sous vide et de la configuration d’équilibrage
    REMARQUE: Dans ce protocole, une seule colonne est utilisée pour la purification IEX d’un échantillon. Pour les purifications multiples, voir la section suivante.
    1. Déterminez le type et le volume de résine souhaités. En règle générale, pour jusqu’à 20 mg de domaines SH3 partiellement purs marqués par his, utilisez 0,4 mL de résine à flux rapide Q-sépharose par colonne (voir l’étape 2.4.8).
    2. Insérez 24 colonnes vides ouvertes (vides sans filtre en bas) dans un MCPA pré-assemblé. Les colonnes doivent tenir parfaitement dans les trous du tapis d’étanchéité qui ont été perforés.
    3. Placez un piston de seringue de 10 mL dans chaque colonne vide, sauf la première position, où la purification commencera.
    4. Poussez le fond d’une colonne ouverte (avec filtre) à travers un joint en caoutchouc du piston de seringue de 5 mL (qui a été percé) pour former un anneau en caoutchouc à l’extrémité de la colonne. Cet anneau en caoutchouc assurera une bonne étanchéité lorsque cette colonne est insérée dans chaque colonne vide ci-dessus. Pour l’instant, insérez cette colonne dans la première colonne vide du MCPA.
    5. Prenez une plaque de collecte ouverte et mettez cette plaque dans la base du collecteur sous vide et fermez avec le haut du collecteur.
    6. Placez le MCPA assemblé (avec des colonnes) sur le dessus du collecteur de vide.
    7. Fixez le tube d’un système de pompe à vide à l’entrée ou à la buse au fond du vide.
    8. Couper une pointe de pipette bleue ~ 2 cm du fond et utiliser pour prendre 800 μL de billes Q-sépharose (ou toute autre résine échangeuse d’ions), en veillant à ce que la solution de perles-éthanol 50/50 soit mélangée pour éviter la superposition. Pipette 800 μL dans la colonne ouverte (avec filtre) dans la première position et une fois que les perles se déposent au fond des colonnes, allumez suffisamment le vide pour traverser l’éthanol à 20%.
    9. Laver la colonne contenant des billes de sépharose avec 2 x 2 mL de Tris 10 mM. Éteignez le vide juste avant que le tampon Tris ne passe à travers pour empêcher le dessèchement de la résine. Run off peut être ignoré.
      NOTA : Si de la résine a été utilisée précédemment, régénérer par lavage en 5 volumes de résine de NaCl 4 M puis 5 volumes de résine de Tris 10 mM avant l’étape 2.4.9.
  5. Chargement, lavage et élution
    1. Transférer tout l’échantillon à purifier (voir section 3) dans la colonne de sépharose Q dans la première position, utiliser une petite boucle en plastique pour remuer l’échantillon et les perles pendant environ ~ 2 minutes avant d’allumer la pompe à vide.
      REMARQUE: En cas d’excès de surnageant (>12 mL), méfiez-vous de trop remplir la colonne. Laissez l’exemple s’exécuter puis ajoutez-en d’autres, en mélangeant avant de laisser passer à nouveau.
    2. Stockez/figez le relais pour une analyse ultérieure.
    3. Placez une autre plaque de collecte ouverte dans le collecteur sous vide, puis lavez chaque colonne de sépharose avec 2 x 2 mL de Tris 10 mM et rangez.
    4. Insérez une plaque de collecte de 96 puits, en vous assurant que A1 est dans le coin supérieur gauche.
    5. Pour recueillir la première fraction d’élution, retirez le piston de la seringue de la colonne suivante, déplacez la colonne de sépharose Q dans cette position et placez le piston de la seringue dans la position précédente. Pipeter ensuite 1 mL de la première concentration en sel dans la colonne de sépharose Q. Allumez la pompe et récupérez l’élution. Éteignez la pompe tout comme les lignes de liquide près des perles pour éviter de dessécher les perles.
    6. Pour recueillir la fraction d’élution suivante, retirez le piston de la seringue de la colonne suivante, déplacez la colonne de sépharose Q dans cette position et placez le piston de la seringue dans la position précédente.
    7. Ajouter 1 mL de la concentration de sel suivante dans la colonne et répéter le procédé jusqu’à ce que toutes les concentrations aient été utilisées et que 24 élutions aient été recueillies dans 24 puits distincts. Vérifiez qu’aucun liquide n’est entré dans les puits voisins.
    8. Laver la colonne avec 2 mL de Tris NaCl 4 M 10 mM. Laissez cela passer à travers.
    9. Laver avec 2 mL d’éthanol à 20%. Laissez l’éthanol courir jusqu’à ce qu’il soit juste au-dessus des perles et scellez la colonne pour le stockage.
    10. Stockez la plaque de collecte de 96 puits et analysez par spectroscopie UV et SDS PAGE.

3. Échange d’ions - Purifications simultanées de 24 protéines différentes

NOTA : Voir les étapes 2.1 à 2.3 pour plus de détails sur la fabrication de tampons, une série de concentrations de sel et la préparation d’échantillons.

  1. Préparation de la configuration de purification
    REMARQUE: La façon dont le système de purification est mis en place dépend beaucoup du nombre de protéines purifiées et du nombre de conditions de sel qui seront utilisées. Pour purifier 12 échantillons jusqu’à un maximum de 24 échantillons simultanément, une plaque de collecte pour chaque concentration de sel utilisée pour éluer est nécessaire. Pour moins de 12 échantillons, il est possible de déplacer les colonnes de chromatographie de quelques positions à l’intérieur d’un même MCPA avant de changer les plaques de collecte. Dans ce cas, il n’est pas nécessaire de placer les colonnes dans des colonnes vides et elles peuvent être directement fixées au tapis d’étanchéité MCPA. Le protocole ci-dessous concerne 24 purifications par échange d’ions simultanées.
    1. Placez le MCPA assemblé directement fixé à 24 colonnes vides avec des filtres sur le dessus du collecteur de vide qui contient une plaque de collecte ouverte et préparez et lavez 24 colonnes d’échange d’ions comme dans la méthode de purification unique ci-dessus. Pour cette purification, il est pratique d’utiliser un répéteur Eppendorf ou une seringue pour pipetter rapidement dans les colonnes.
  2. Chargement, lavage et élution
    1. Placez une plaque de collecte de 48 puits dans la base du collecteur à vide avant de raccorder le MCPA (avec les colonnes de purification lavées attachées). Assurez-vous que A1 se trouve dans le coin supérieur gauche.
    2. Pipeter chaque échantillon de protéines (jusqu’à 5 mL à la fois) dans leur colonne correspondante. Remuez chaque colonne à l’aide d’une fine boucle en plastique (une boucle pour chaque colonne pour éviter la contamination) pendant environ 2 minutes. Allumez ensuite la pompe à vide et laissez passer le surnageant.
      REMARQUE: En cas d’excès de surnageant, méfiez-vous de trop remplir les colonnes. Laissez l’exemple parcourir sa colonne, puis ajoutez-en d’autres, en mélangeant avant de laisser passer à nouveau.
    3. Entreposer/congeler la plaque de collecte de 48 puits pour une analyse ultérieure, car elle contient le débit de chaque protéine.
    4. Placez une autre plaque de collecte de 48 puits dans le collecteur sous vide, puis lavez chaque colonne de sépharose avec 2 x 2 mL de Tris de 10 mM.
    5. Insérez la première plaque de collecte de 96 puits dans le collecteur, en vous assurant que A1 est dans le coin supérieur gauche, puis pipettez 1 mL de la première concentration de sel dans chaque colonne, puis allumez la pompe à vide pour la faire passer à travers les colonnes. Retirer la plaque de collecte, la recouvrir de parafilm et la conserver à 4 °C pour analyse.
    6. Répétez l’étape pour chaque concentration successive de sel utilisée pour éluer. Assurez-vous qu’une nouvelle plaque de collecte est utilisée pour chaque élution et que chaque plaque de collecte est étiquetée et entreposée.
    7. Laver chaque colonne avec 2 mL de Tris 10 mM, NaCl 4 M.
    8. Laver chaque colonne avec 2 mL d’éthanol à 20 %. Laissez l’éthanol courir jusqu’à ce qu’il soit juste au-dessus des perles et scellez les colonnes pour le stockage.
    9. Stockez 96 plaques de collecte de puits et analysez par spectroscopie UV et SDS-PAGE.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

À titre d’exemple, le MCPA a réussi à purifier 14 mutants abpSH3 dans des conditions de dénaturation via le Ni-NTA(figure 2A). Un petit contaminant ~ 25 kDa peut être vu, mais la protéine est encore largement pure. On pense que ce contaminant est le YodA, une protéine co-purifiée commune présente dans E. coli11. La figure 2B montre la purification de 11 domaines SH3 différents dans des conditions natives. Le petit contam...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode est robuste et simple à utiliser pour les biochimistes protéiques relativement inexpérimentés, mais il y a quelques considérations à garder à l’esprit.

Mise en garde contre le remplissage excessif des plaques de collecte

La plaque de collecte de 48 puits elle-même ne contient que 5 mL par puits alors que chaque puits de 96 n’en contient que 2 mL. Cela doit être gardé à l’esprit lors de l’ajout de tampon et de l’exécution de l’échantillon ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par un prix de développement institutionnel (IDeA) de l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de subvention P20GM103451 et une subvention de recherche interne de l’Université de Liverpool.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de collecte de 2 mL / puitsAgilent technologies201240-100
Plaque de collecte de 5 mL / puitsAgilent technologies201238-100
Colonnes de chromatographie de 12 mL PlaqueBio-Rad7311550
96 puits de longAgilent technologies200919-100Livré avec des filtres de 0,25 um qui doivent être retirés.
96 puits plaque joint/matAgilent technologies201158-100Devrait être pénétrable
His60 Ni Superflow ResinTakara Bio635660
HiTrap Q HP Anion exchange columnGE Healthcare (Cytiva)17115301
Lvis lecteur de plaquesBMG LABTECHCompatible avec FLUOstar Omega lecteur de plaques
Mâle leur plugsCole-ParmerEW-45503-70
PlatePrep 96 puits Collecteur à vide Kitde démarrage Sigma-Aldrich575650-U
Plaque de collecte du réservoirAgilent technologies201244-100
The Repeater PlusEppendorf2226020avec seringues de 5 mL et 50 mL
Vide VACUSAFEINTEGRA158 320L’aspirateur vacusafe a une plage de vide de 300 mBar à 600 mBar et une bouteille de récupération des déchets de 4 L
d’égouttement

Références

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Mots-clés

Purification haut d bitchromatographie d affinitchromatographie d change d ionspurification au nickel NTApurification du domaine SH3purification parall le de prot inesrampe videprot omique fonctionnelle

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