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Article de méthode

Imagerie des protéines podocytiques Nephrin, Actin et Podocin avec microscopie d’expansion

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DOI :

10.3791/62079

⸱

23 avril 2021

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La méthode présentée permet la visualisation de protéines cellulaires étiquetées fluorescentes avec microscopie d’expansion conduisant à une résolution de 70 nm sur un microscope conventionnel.

Résumé

La perturbation du filtre glomerular composé de l’endothélium glomerular, de la membrane glomerular de sous-sol et des podocytes, a comme conséquence l’albuminuria. Les processus de pied de podocyte contiennent des faisceaux d’actine qui se lient aux protéines cytosquelettiques d’adaptateur telles que la podocine. Ces protéines adaptateurs, comme la podocine, relient l’épine dorsale du diaphragme fente glomérique, comme la néphrine, au cytosquelette d’actine. L’étude de la localisation et de la fonction de ces protéines podocytiques et d’autres est essentielle à la compréhension du rôle du filtre glomerular dans la santé et la maladie. Le protocole présenté permet à l’utilisateur de visualiser l’actine, la podocine et la néphrine dans les cellules avec imagerie à super résolution sur un microscope conventionnel. Premièrement, les cellules sont tachées d’une technique conventionnelle d’immunofluorescence. Toutes les protéines de l’échantillon sont ensuite ancrées de façon covalente dans un hydrogel gonflé. Grâce à la digestion avec la proteinase K, les protéines structurelles sont fendillées permettant un gonflement isotropical du gel dans la dernière étape. La dialyse de l’échantillon dans l’eau entraîne une expansion de 4 à 4,5 fois de l’échantillon et l’échantillon peut être photographié au microscope à fluorescence conventionnel, ce qui rend une résolution potentielle de 70 nm.

Introduction

L’albuminurie est un paramètre de substitution du risque cardiovasculaire et résulte de la perturbation du filtre glomerular1. Le filtre glomerular est composé de l’endothélium fenestrated, de la membrane glomerular de sous-sol et du diaphragme de fente formé par des podocytes. Les processus primaires et secondaires de pied des podocytes enveloppent autour de la paroi capillaire du glomerulum2. La structure délicate des processus de pied est maintenue par des faisceaux corticals d’actine qui servent également d’ancres pour les protéines multiples de diaphragme de fente et d’autres protéines d’adaptateur2. La protéine dorsale du diaphragme fendue est appelée néphrine et interagit de manière homophilique avec les molécules de néphrine des podocytes opposés. Grâce à diverses protéines adaptateurs, la néphrine est liée au cytosquelette d’actine2,3. Les mutations dans le gène d’encodage de néphrine NPHS1 mènent au syndrome néphrotique du typefinlandais 4.

L’une des protéines en interaction de la néphrine est la podocine, une protéine en épingle à cheveux de la famille des stomatines3. Podocin recrute de la néphrine aux radeaux lipidiques et la relie au cytosquelette d’actine5. La podocine est codée par le gène NPHS2. Les mutations dans NPHS2 mènent au syndrome néphrotique stéroïde-résistant6.

Pour visualiser et co-localisé les protéines adaptateurs de l’actine, des techniques d’immunofluorescence peuvent être utilisées. Malheureusement, la barrière de diffraction de la lumière limite la résolution des microscopes conventionnels de fluorescence à 200-350 nm7. De nouvelles techniques de microscopie, par exemple, l’épuisement des émissions stimulées (STED)8,la microscopie de localisation photoactivée (PALM)9,la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM ou dSTORM) ou la microscopie de suppression de l’état au sol suivie d’un retour individuel des molécules (GSDIM)9,10,11, permettent une résolution jusqu’à environ 10 nm. Cependant, ces techniques de super résolution nécessitent des microscopes très coûteux, du personnel bien formé et ne sont donc pas disponibles dans de nombreux laboratoires.

La microscopie d’expansion (ExM) est une technique nouvelle et simple qui permet l’imagerie par super résolution avec des microscopes conventionnels et qui est potentiellement disponible pour une grande communauté derecherche 12. Dans la microscopie d’expansion de rétention de protéine (proExM), l’échantillon d’intérêt (cellules ou tissu) est fixé et souillé avec des fluorophores13. Les protéines de l’échantillon sont ensuite ancrées de façon covalente par une petite molécule (6-((Acryloyl)amino)acide hexanoïque, succinimidyl ester, AcX) dans un hydrogel gonflé13. Grâce à la digestion enzymatique avec proteinase K (ProK), les protéines et les fluorophores maintiennent leur position relative dans le gel après expansion13. Après gonflement du gel, l’échantillon se dilate jusqu’à 4,5 fois (expansion volumétrique de 90 fois) menant à une résolution latérale efficace d’environ 60-70 nm (300 nm/4.5). Les modifications de cette technique peuvent même permettre une expansion 10 fois (expansion volumétrique 1000 fois), rendant une résolution de 20-30 nm sur les microscopes conventionnels14,15,16.

Des structures glomerular de souris et de reins humains ont été visualisées par l’intermédiaire d’ExM17. Dans cet article, nous présentons un protocole proExM détaillé pour visualiser des images de super résolution de F-actin et de la podocine de protéine d’actine-adaptateur dans les cellules utilisant un microscope conventionnel de fluorescence.

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Protocole

1. Fractionnement et ensemencement des cellules

  1. Réchauffez le milieu de l’aigle modifié (DMEM) stérile de Dulbecco, y compris le sérum fœtal de veau (FCS) à 10 %, la solution saline tamponnée de phosphate stérile (PBS) et la trypsine stérile à 37 °C. Activez le banc propre.
  2. Préparer une plaque de 6 puits en ajoutant un glissement stérile de couvercle en verre (10 mm) à chaque puits à l’aide de forceps stériles.
  3. Mettez un plat de culture cellulaire de 10 cm avec des cellules Cos7 sous le banc propre. Sous le banc propre, aspirer le milieu des cellules à l’aide d’un dispositif à vide.
  4. Tenez le plat de culture cellulaire angulé dans une main et ajoutez 10 mL de PBS stérile sur le côté du plat de culture cellulaire pour éviter de rincer les cellules. Ez le plat de culture cellulaire vers le bas de sorte que PBS rince le plat complet de culture cellulaire.
  5. Retirer le PBS et ajouter 1 mL de trypsine au milieu du plat de culture cellulaire et incuber pendant 5 min à 37 °C.
  6. Arrêtez la réaction de trypsinisation en ajoutant 10 mL de DMEM dont 10% de FCS et pipette la solution cellulaire de haut en bas avec un pipettor pour séparer manuellement les cellules.
  7. Analyser le numéro de cellule par millilitre à l’aide d’une chambre de comptage.
  8. Ensemencer 68 000 cellules dans un milieu de 2 mL par puits sur le couvercle en verre glisse dans la plaque de 6 puits. Répartir les cellules dans la plaque de 6 puits en secouant prudemment la plaque horizontalement et verticalement.
    REMARQUE : Les cellules doivent être dispersées.
  9. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur de 37 °C avec 5 % de CO2.

2. Transfection des cellules

  1. Préparer deux tubes stériles de 1,5 mL (l’un pour l’ADN dilué (A) et l’autre pour le réagencé dilué pour la transfection lipidique cationique (B)). Pipette 0,75 μg de néphrine et 0,75 μg de plasmide d’expression podocine cDNA par puits dans un tube de 1,5 mL et le diluer en 100 μL de sérum moyen réduit par puits. Ajouter 3 μL de réaccfection cationique par puits au deuxième tube de 1,5 mL et diluer avec 100 μL de sérum moyen réduit. Incuber les deux réactions pendant 5 min à température ambiante.
  2. Combinez les deux réactions (A et B) à un complexe ADN-lipide et incubez pendant 20 min à température ambiante. Ajouter prudemment 200 μL du complexe ADN-lipides à chaque puits.
  3. Incuber les cellules transfectées à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 48 h sans changer le milieu.

3. Immunolabeling des structures cellulaires

  1. Préparer une solution de fixation (4% (w/v) paraformaldéhyde en PBS, 1 mL/puits), la solution de perméabilisation (0,5% (w/v) Triton X-100 en PBS, 1 mL/puits), et une solution de blocage (5% (v/v) albumine de sérum bovin en PBS, 1 mL/puits).
  2. Retirez le milieu à l’l’l’insage d’un dispositif sous vide. Ajouter 2 mL de PBS à chaque puits pour enlever le milieu supplémentaire. Aspirez complètement le PBS.
    REMARQUE: Pour éviter de laver les cellules avec PBS, assurez-vous de pipette PBS pas sur le couvercle en verre glisser directement.
  3. Fixer les cellules avec 4% (w/v) paraformaldéhyde (PFA) dissous dans PBS pendant 10 min à température ambiante.
    REMARQUE : Alternativement, fixez des cellules dans 3% (v/v) glyoxal-éthanol18.
  4. Jetez la PFA et lavez les cellules deux fois dans PBS (2 mL chacune) en évitant le pipetage direct sur les feuillets de couverture en verre. Perméabilizez les cellules fixes avec Triton X-100 0,5% (w/v) en PBS pendant 10 min à température ambiante.
  5. Retirez la solution de perméabilisation et lavez-la deux fois avec pbs comme indiqué dans l’étape 3.2.
  6. Bloquez les cellules en ajoutant 1 mL de 5% (v/v) BSA dans PBS pendant 1 h à température ambiante. Incuber les cellules avec 200 μL de l’anticorps primaire (anticorps anti-podocine 1:200 en 1% (v/v) BSA en PBS) pendant la nuit à 4 °C.
    REMARQUE : Alternativement, incuber l’anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante.
  7. Retirez l’anticorps primaire et lavez-le trois fois avec du PBS comme à l’étape 3.2. Ajouter l’anticorps secondaire (chèvre anti-lapin Alexa 488 1:1000 en 1% (v/v) BSA en PBS) pendant 1 h à température ambiante. Gardez les cellules dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.
  8. Jetez l’anticorps secondaire et lavez-le avec du PBS trois fois.
  9. Retirer le PBS et incuber les cellules avec 200 μL d’anticorps anti-néphrine 1:100 en 1% (v/v) BSA en PBS pendant 1 h à température ambiante. Laver avec PBS trois fois. Gardez les cellules dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.
  10. Retirer le PBS et incuber avec l’anticorps secondaire âne anti-cobaye 633, 1:200, pendant 1 h à température ambiante. Laver avec PBS trois fois. Gardez les cellules dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.

4. Microscopie d’expansion

  1. préparation
    1. Pour former les entretentres pour la chambre de gelation, coupez les glissements de couverture en verre #1,0 et #1,5 en rayures de 5 mm (quatre chacune par glissière de verre) à l’aide d’un couteau en diamant. Placez les bandes de glissement de couverture de #1,5 mm de sorte qu’elles forment un carré de 2,5 cm de longueur sur une glissière de verre et placez-les dans une chambre de coloration(figure 2A1-C1). Pipette une gouttelette de ddH2O dans les coins de la place pour adhérer à la couverture de verre glisser rayures les uns aux autres et à la glissade de verre (Figure 2A2-C2).
      REMARQUE : Évitez le séchage complet du ddH2O car la force d’adhérence se perdra. Si nécessaire, appliquez plus de gouttelettes de ddH2O. Attendez environ 20 min pour que les feuillets de couverture de #1,5 mm soient fixés de façon stably avant de commencer par l’étape 4.1.2.
    2. Placez quatre #1.0 bandes de glissement de couverture en verre par glissement de couverture sur les #1 de couverture de 0,5 mm. Adhérez aux rayures en pipetant une gouttelette sur chaque #1,5 mm de glissement de couverture(figure 2A3-C3).
      REMARQUE : L’épaisseur du gel doit être d’au moins 0,15 mm pour faciliter la manipulation dans l’avancement du protocole. Cependant, pour éviter le gel excessif sur le dessus des cellules, maintenez la hauteur d’espacement près du substrat cellulaire. En utilisant #1.5 et #1.0 bandes de glissement de couverture comme espaceurs, la hauteur des entretaires sera d’environ 0,3 mm. Les cellules adhèrent au verre de couverture (hauteur 0,12 mm). Par conséquent, le gel sera assez épais pour manipuler, mais gel excessif sur le dessus des cellules est évité en utilisant #1,0 et #1,5 bandes de verre de couverture comme espaceurs.
    3. Pour le couvercle de la chambre de gelation, envelopper un verre de couverture (#1,5) avec du film de paraffine. Évitez les plis ou la saleté sur le film de paraffine(figure 2A5-C5).
  2. Ancrage et polymérisation (gelation)
    1. Préparer le tampon d’ancrage (voir le tableau 1). Pour le traitement d’ancrage, remplacez PBS par 250 μL de tampon d’ancrage par puits directement sur le bordereau de couverture en verre et incubez pendant 3 h à température ambiante. Gardez le substrat dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.
      REMARQUE : Alternativement, incuber toute la nuit à température ambiante. Préparez un tampon d’ancrage frais pour chaque expérience et attendez 10-15 min jusqu’à ce qu’il soit dissous correctement. 6-((Acryloyl)amino)acide hexanoïque, ester succinimidyl (AcX) doit être remplacé tous les 4-5 mois pour assurer un ancrage adéquat.
    2. Retirer le tampon d’ancrage et laver une fois avec 1,5 mL de PBS par puits.
    3. Pour tacher les fibres d’actine, décongeler une solution de phalloidine compatible ExM et incuber la phalloidine (5 μL de phalloidine diluée en 195 μL de 1 % (v/v) BSA en PBS/puits) pendant 45 min à température ambiante. Gardez les échantillons dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.
    4. Entre-temps, dissoudre l’acrylate de sodium en ddH 2 Oà l’aided’un dispositif d’agitation. Sur la glace, préparer la solution monomère (voir le tableau 1).
      REMARQUE : L’acrylate de sodium dissous devrait être une solution claire et incolore. Si la solution est jaune, remplacer par un nouvel acrylate de sodium.
    5. Préparer la solution de gelling sur la glace (voir le tableau 1). Pipette ammoniumperoxidsulfate (APS) dans la solution de gelage juste avant que la solution de gelling soit appliquée à la chambre de gelation.
    6. Retirer la phalloidine des cellules et laver avec 1,5 mL de PBS deux fois à température ambiante. Laissez 1,5 mL de PBS dans le puits pour faciliter l’enlèvement de l’échantillon sur la feuille de couverture en verre.
    7. Placez les cellules sur le verre de couverture dans la chambre de hongre à l’aide de forceps et d’une canule pour soulever le glissement de verre de couverture de la plaque de 6 puits.
      REMARQUE : Les cellules doivent être sur le dessus de la feuille de couverture en verre. Le slip de couvercle en verre ne doit pas toucher les entretaires.
    8. Ajouter aps à la solution de gelling et vortex sous peu. Pipette 200 μL de solution de gelling sur l’échantillon( Figure 2A4-C4). Fermez prudemment la chambre de gelation en évitant les bulles d’air dans le gel (Figure 2A5-C5).
    9. Incuber la chambre gélissante pendant au moins 1 h à 37 °C pour polymériser le gel dans la chambre de coloration humide.
  3. Homogénéisation (digestion)
    1. Sortez la chambre de coloration de l’incubateur. Pour ouvrir le couvercle de la chambre de gelation, introduisez une lame de rasoir entre le couvercle et l’espaceur. Retirez le couvercle prudemment. Retirez les entretaires avec la lame de rasoir et éliminez tout gel supplémentaire en le coupant avec la lame de rasoir.
    2. Mettre la diapositive avec le gel et couvrir le verre dans un plat rempli de PBS. En secouant doucement, retirer le verre détaché du gel. Pour retirer facilement le gel du plat, placez la lame sous le gel pour fixer le gel à la lame.
    3. Avec le gel sur la lame, diviser le gel en petits morceaux (le quart du gel est divisé en deux à trois morceaux) à l’aide de la lame de rasoir. Poussez doucement un morceau de gel dans un puits d’une plaque de 6 puits avec fond de verre et pliez-le par un pinceau. Gardez le gel hydraté avec un peu de PBS à l’aide du pinceau pour éviter la déshydratation du gel.
      REMARQUE : Les cellules font face vers le bas.
    4. À l’aide d’un microscope inversé, prenez des images d’aperçu avec une faible ouverture numérique pour déterminer le facteur d’expansion après expansion.
    5. Préparer le tampon de digestion (voir le tableau 1). Diluer proteinase K à 4 U/mL dans le tampon de digestion pour recevoir la solution de digestion.
      REMARQUE : Le tampon de digestion sans Proteinase K peut être stocké à 4 °C pendant 1 à 2 semaines.
    6. Ajouter 500 μL de la solution de digestion à chaque puits et plonger le gel dans la solution. Laissez-le digérer toute la nuit à température ambiante et fermez le couvercle en gardant les échantillons dans l’obscurité.
      REMARQUE : Alternativement, laissez-le digérer à 37 °C pendant 1 h.
  4. expansion
    1. Retirer la solution de digestion à l’aide d’une pipette et la jeter. Ajouter 1 mL de ddH2O. Incuber le gel immergé pendant 10 min à température ambiante.
    2. Retirer l’eau et ajouter 1 mL de ddHfrais 2O. Attendre 10 minutes et continuer à échanger de l’eau toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’un plateau d’expansion soit atteint.
      REMARQUE : L’expansion de l’échantillon jusqu’à 4,5 fois est réalisable. Le gel devient optiquement clair.
  5. imagerie
    1. Retirer l’eau du gel et démarrer directement la microscopie. À l’aide d’un microscope inversé, utilisez principalement un objectif d’air (faible grossissement) pour trouver des cellules imageuses dans l’état de pré-expansion (étape 4.3.4).
    2. Passez à un objectif 40x (huile/eau) et 63x pour une meilleure résolution. Excitez avec la longueur d’onde de l’intérêt et de prendre l’image via la caméra.
  6. validation
    1. Prenez une image de vue d’ensemble de l’échantillon. Trouvez et assortir les mêmes structures dans l’échantillon qui ont été illustrées à l’étape 4.3.4. Utilisez le canal avec le meilleur rapport signal-bruit pour validation(figure 3 A-B).
      REMARQUE : Ajustez les paramètres d’imagerie pour obtenir une luminosité similaire à celle de l’image acquise à l’état non élargi (étape 4.3.4).
    2. Superposez les images avant et après l’expansion en les tournant et en les déplaçant avec ImageJ. Utilisez l’outil de mesure de distance dans ImageJ pour mesurer les distances entre les structures clairement identifiables. Mesurez au moins 10 structures différentes.
      REMARQUE : Alternativement, utilisez un script Python pour mesurer les distances décrites dans14.
    3. Calculez le facteur d’expansion en divisant les mesures post-/pré-expansion.
    4. Pour déterminer les distorsions, prenez des images avec une ouverture numérique plus élevée (Figure 4A-B). Superposez ces images et analysez-les avec ImageJ ou comme décritdans 15.
      REMARQUE : La détermination des distorsions doit être effectuée régulièrement, mais pas nécessairement sur chaque échantillon.

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Résultats

Le concept et le moment de ce protocole proExM sont représentés à la figure 1. Le jour 5, les cellules transfectées sont fixées et tachées d’anticorps fluorescents ciblant la protéine d’intérêt (Figure 1A,B). Le jour 6, le traitement par AcX conduit à la formation de groupes d’amine sur toutes les protéines (y compris les fluorophores) (Figure 1A,B)...

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Discussion

La méthode présentée permet à l’investigateur de visualiser les protéines cellulaires, p. ex., la podocine, la néphrine et les composants cytosquelettiques, p. ex., la F-actine. Dans ce protocole, les cellules cos7 transfectées sont utilisées comme modèle pour étudier l’interaction des protéines de diaphragme fendue avec la F-actine. Malheureusement, les lignées cellulaires immortalisées des podocytes n’expriment pas suffisamment de quantités endogènes de protéines diaphragmes fendues19.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Blanka Duvnjak et Nikola Kuhr pour leur excellente assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acrylamide >99 %Sigma-AldrichA3553-100G
Acide 6-((Acryloyl)amino)hexanoïque, ester succinimidylique, Acryloyl-X, SEinvitrogenA-20770conserver jusqu’à 4 mois
APSSigma-AldrichA3678-25G
Deckglä ; ser (lunettes de couverture)EngelbrechtK1243224x32mm #1.0
Diamont cutterVWR201-0392pour couper les lamelles de recouvrement
Guanidine HClSigma-AldrichG3272-100G8M Stock peut être conservé chez RT
Marten pinceau à cheveuxLeon Hardy3 (770)
"Menzel » Deckglä ; ser (verres de couverture)Thermo Fischer  ;1565478624x24mm #1.5
N,N'-MethylenbisacrylamideSigma-AldrichM7256-25G
Objektträ ; ger UniMarkMarienfeld703010
Protéinase KNew England BiolabsP8107S
Acrylate de sodiumSigma-Aldrich408220vérifier la pureté  ;
Bicarbonatede sodium Sigma-AldrichS5761
Chambreproduite dans l’atelier de l’université
TEMEDROTH2367.1
Plaques à fond en verre à 6 puitsCellvisP06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546  ;chrometranon disponible1:40
Anti Podocin produit chez le lapinSigmaP-0372-200UL1:200
Âne anti cochon d’Inde CF633SigmaSAB4600129-50UL1:200
Chèvre anti lapin 488Life TechnologiesA110341:1000
Cochon d’Inde anti néphrineOrigeneBP50301:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1Zeissnon disponible
de coloration

Références

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