Imagerie des protéines podocytiques Nephrin, Actin et Podocin avec microscopie d’expansion

Résumé

La méthode présentée permet la visualisation de protéines cellulaires étiquetées fluorescentes avec microscopie d’expansion conduisant à une résolution de 70 nm sur un microscope conventionnel.

Résumé

La perturbation du filtre glomerular composé de l’endothélium glomerular, de la membrane glomerular de sous-sol et des podocytes, a comme conséquence l’albuminuria. Les processus de pied de podocyte contiennent des faisceaux d’actine qui se lient aux protéines cytosquelettiques d’adaptateur telles que la podocine. Ces protéines adaptateurs, comme la podocine, relient l’épine dorsale du diaphragme fente glomérique, comme la néphrine, au cytosquelette d’actine. L’étude de la localisation et de la fonction de ces protéines podocytiques et d’autres est essentielle à la compréhension du rôle du filtre glomerular dans la santé et la maladie. Le protocole présenté permet à l’utilisateur de visualiser l’actine, la podocine et la néphrine dans les cellules avec imagerie à super résolution sur un microscope conventionnel. Premièrement, les cellules sont tachées d’une technique conventionnelle d’immunofluorescence. Toutes les protéines de l’échantillon sont ensuite ancrées de façon covalente dans un hydrogel gonflé. Grâce à la digestion avec la proteinase K, les protéines structurelles sont fendillées permettant un gonflement isotropical du gel dans la dernière étape. La dialyse de l’échantillon dans l’eau entraîne une expansion de 4 à 4,5 fois de l’échantillon et l’échantillon peut être photographié au microscope à fluorescence conventionnel, ce qui rend une résolution potentielle de 70 nm.

Introduction

L’albuminurie est un paramètre de substitution du risque cardiovasculaire et résulte de la perturbation du filtre glomerular¹. Le filtre glomerular est composé de l’endothélium fenestrated, de la membrane glomerular de sous-sol et du diaphragme de fente formé par des podocytes. Les processus primaires et secondaires de pied des podocytes enveloppent autour de la paroi capillaire du glomerulum^2. La structure délicate des processus de pied est maintenue par des faisceaux corticals d’actine qui servent également d’ancres pour les protéines multiples de diaphragme de fente et d’autres protéines d’adaptateur^....

Protocole

1. Fractionnement et ensemencement des cellules

1. Réchauffez le milieu de l’aigle modifié (DMEM) stérile de Dulbecco, y compris le sérum fœtal de veau (FCS) à 10 %, la solution saline tamponnée de phosphate stérile (PBS) et la trypsine stérile à 37 °C. Activez le banc propre.
2. Préparer une plaque de 6 puits en ajoutant un glissement stérile de couvercle en verre (10 mm) à chaque puits à l’aide de forceps stériles.
3. Mettez un plat de culture cellulaire de 10 cm avec des cellules Cos7 sous le banc propre. Sous le banc propre, aspirer le milieu des cellules à l’aide d’un dispositif à vide.
4. Tenez le plat de culture cellulaire angulé da....

Résultats

Le concept et le moment de ce protocole proExM sont représentés à la figure 1. Le jour 5, les cellules transfectées sont fixées et tachées d’anticorps fluorescents ciblant la protéine d’intérêt (Figure 1A,B). Le jour 6, le traitement par AcX conduit à la formation de groupes d’amine sur toutes les protéines (y compris les fluorophores) (Figure 1A,B)^.......

Discussion

La méthode présentée permet à l’investigateur de visualiser les protéines cellulaires, p. ex., la podocine, la néphrine et les composants cytosquelettiques, p. ex., la F-actine. Dans ce protocole, les cellules cos7 transfectées sont utilisées comme modèle pour étudier l’interaction des protéines de diaphragme fendue avec la F-actine. Malheureusement, les lignées cellulaires immortalisées des podocytes n’expriment pas suffisamment de quantités endogènes de protéines diaphragmes fendues¹⁹.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acrylamide >99 %	Sigma-Aldrich	A3553-100G
Acide 6-((Acryloyl)amino)hexanoïque, ester succinimidylique, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	conserver jusqu’à 4 mois
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckglä ; ser (lunettes de couverture)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	pour couper les lamelles de recouvrement
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock peut être conservé chez RT
Marten pinceau à cheveux	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel » Deckglä ; ser (verres de couverture)	Thermo Fischer  ;	15654786	24x24mm #1.5
N,N'-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträ ; ger UniMark	Marienfeld	703010
Protéinase K	New England Biolabs	P8107S
Acrylate de sodium	Sigma-Aldrich	408220	vérifier la pureté  ;
Bicarbonate	de sodium Sigma-Aldrich	S5761
Chambre			produite dans l’atelier de l’université
TEMED	ROTH	2367.1
Plaques à fond en verre à 6 puits	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546  ;	chrometra	non disponible	1:40
Anti Podocin produit chez le lapin	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Âne anti cochon d’Inde CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Chèvre anti lapin 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Cochon d’Inde anti néphrine	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non disponible

de coloration