Approches de visualisation et d’analyse tridimensionnelles et quadridimensionnelles pour étudier l’allongement et la segmentation axial des vertébrés

Summary

Nous décrivons ici des outils et des méthodes de calcul qui permettent la visualisation et l’analyse de données d’images tridimensionnelles et quadridimensionnelles d’embryons de souris dans le contexte de l’allongement axial et de la segmentation, obtenues par tomographie par projection optique in toto, et par imagerie en direct et coloration par immunofluorescence en monture entière à l’aide de la microscopie multiphotonique.

Abstract

La somitogenèse est une caractéristique du développement embryonnaire des vertébrés. Pendant des années, les chercheurs ont étudié ce processus dans une variété d’organismes en utilisant un large éventail de techniques englobant des approches ex vivo et in vitro. Cependant, la plupart des études reposent encore sur l’analyse de données d’imagerie bidimensionnelle (2D), ce qui limite l’évaluation correcte d’un processus de développement comme l’extension axiale et la somitogenèse impliquant des interactions hautement dynamiques dans un espace 3D complexe. Nous décrivons ici les techniques qui permettent l’acquisition d’images en direct de souris, le traitement d’ensembles de données, la visualisation et l’analyse en 3D et 4D pour étudier les cellules (par exemple, les progéniteurs neuromésodermiques) impliquées dans ces processus de développement. Nous fournissons également un protocole étape par étape pour la tomographie par projection optique et la microscopie par immunofluorescence à montage entier dans des embryons de souris (de la préparation de l’échantillon à l’acquisition d’images) et montrons un pipeline que nous avons développé pour traiter et visualiser les données d’images 3D. Nous étendons l’utilisation de certaines de ces techniques et mettons en évidence les caractéristiques spécifiques de différents logiciels disponibles (par exemple, Fidji / ImageJ, Drishti, Amira et Imaris) qui peuvent être utilisés pour améliorer notre compréhension actuelle de l’extension axiale et de la formation de somite (par exemple, les reconstructions 3D). Dans l’ensemble, les techniques décrites ici soulignent l’importance de la visualisation et de l’analyse de données 3D en biologie du développement et pourraient aider d’autres chercheurs à mieux traiter les données d’images 3D et 4D dans le contexte de l’extension et de la segmentation axiales des vertébrés. Enfin, le travail utilise également de nouveaux outils pour faciliter l’enseignement du développement embryonnaire des vertébrés.

Introduction

La formation de l’axe du corps des vertébrés est un processus très complexe et dynamique qui se produit au cours du développement embryonnaire. À la fin de la gastrulation [chez la souris, vers le jour embryonnaire (E) 8.0], un groupe de cellules progénitrices épiblastiques connues sous le nom de progéniteurs neuromésodermiques (NMP) deviennent un facteur clé de l’extension axiale dans une séquence tête-queue, générant le tube neural et les tissus mésodermiques paraxiaux lors de la formation du cou, du tronc et de la queue 1,2,3,4 . Fait in....

Protocol

Les expériences impliquant des animaux ont suivi les législations portugaise (Portaria 1005/92) et européenne (directive 2010/63/UE) concernant le logement, l’élevage et le bien-être. Le projet a été examiné et approuvé par le comité d’éthique de l’Instituto Gulbenkian de Ciência et par l’entité nationale portugaise Direcção Geral de Alimentação e Veterinária (référence de licence: 014308).

1. Préparation des échantillons pour l’imagerie 3D et 4D

REMARQUE: Nous fournissons ici une description détaillée sur la façon de disséquer et de préparer des embryons de souris E8.25 à E10.5 pour l’imagerie vivante (1.1), des e....

Results

Les résultats représentatifs présentés dans cet article pour l’imagerie en direct et l’imagerie par immunofluorescence ont été obtenus à l’aide d’un système à deux photons, avec un objectif d’eau de 20 × 1,0 NA, le laser d’excitation réglé à 960 nm et des photodétecteurs GaAsP (comme décrit dans Dias et al. (2020)⁴³. La tomographie par projection optique a été réalisée à l’aide d’un scanner OPenT construit sur mesure (tel que décrit dans Gualda et al. (2013)²⁸.

Discussion

L’allongement axial et la segmentation sont deux des processus les plus complexes et les plus dynamiques qui se produisent au cours du développement embryonnaire des vertébrés. L’utilisation de l’imagerie 3D et 4D avec suivi unicellulaire est appliquée, depuis un certain temps, pour étudier ces processus chez les embryons de poisson-zèbre et de poulet, pour lesquels l’accessibilité et les conditions de culture facilitent l’imagerie complexe 19,44,45,46,47,48,49 <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose à basse température de gélification	Sigma	A9414	Utilisé pour le montage d’embryons (par exemple pour OPT)
Logiciel Amira	Outil logiciel Thermofisher-Commerial
Anti-Brachyury (polyclonal de chèvre)	R and D Systems	AF2085 RRID :AB_2200235	Pour l’immunofluorescence
Anti-Sox2 (Monoclonal de lapin)	Abcam	ab92494 RRID :AB_10585428	Pour immunofluorescence
Anti-Tbx6 (polyclonal de chèvre)	R and D Systems	AF4744 RRID :AB_2200834	Pour l’immunofluorescence
Anti-Laminine111 (polyclonal de lapin)	Sigma	L9393 RRID :AB_477163	Pour l’immunofluorescence
Anti-chèvre 488 (Polyclonal d’âne)	Sondes moléculaires	A11055 RRID :AB_2534102	Pour l’immunofluorescence
Anti-lapin 568 (Polyclonal d’âne)	ThermoFisher   ; Scientifique	A10042 RRID :AB_2534017	Pour l’immunofluorescence
Alcool benzylique (99+ %)	(tout)	-	Utilisé pour éliminer les embryons (composant de BABB)
Benzyl Benzoate (99+ %)	(tout)	-	Utilisé pour éliminer les embryons (composant de BABB)
Albumine sérique bovine	Biowest	P6154	Pour l’immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0	tout)	-	Couvre-objet de 100 um d’épaisseur
20x20 mm #1	(tout)	-	Verre de protection de 170 um d’épaisseur
20x60 mm #1,5	(tout)	-	À utiliser comme " diapositives"
DAPI (4',6-Diamidino-2- Dihydrochloride de phénylindole)	Life Technologies	D3571	Pour l’immunofluorescence
Logiciel Drishti	(open source)	-	Outil logiciel gratuit
EDTA	Sigma	ED2SS	Pour la déminéralisation
Logiciel Fiji/ImageJ	(open source)	-Outil	logiciel gratuit
Glycine	NZYtech	MB01401	Pour l’immunofluorescence
Logiciel Huygens Logiciel	Scientific Volume Imaging-Commerial		Outil logiciel
HyClone défini sérique bovin fœtal	GE Healthcare	#HYCLSH30070.03	Pour l’imagerie en direct
Solution de peroxyde d’hydrogène 30 %	Milipore	1085971000	Pour l’élimination
logiciel Imaris	Instruments Bitplane / Oxford	-	Outil logiciel commercial
iSpacers	SunJin Lab	(varie)	Utilisation comme espaceurs pour les préparations
L-glutamine	Gibco	#25030&ndash ; 024	Pour le support d’imagerie en direct
DMEM à faible teneur en glucose	Gibco	11054020	Pour le support d’imagerie en direct
M2 medium	Sigma	M7167	Pour disséquer les embryons
Methanol	VWR	VWRC20847.307	Pour les étapes de déshydratation et de réhydratation
Salicylate de méthyle	Sigma	M6752	Utilisé pour éliminer les embryons
Paraformaldéhyde	Sigma	P6148	Utilisé en solution pour fixer les embryons
Pénicilline-streptomycine	Sigma	#P0781	Pour milieu d’imagerie en direct
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Biowest	L0615-500-RapiClear
	SunJin Laboratory	RapiClear 1.52	Utilisé pour éliminer les embryons
Chambres d’hybridation Secure-Sea	Sigma	C5474	Utilisation comme espaceurs pour préparations
simLab logiciel	SimLab	soft-Outil	logiciel commercial
Diapositive, dépression verre concave - 75x25 mm	(any)	-	Pour monter des embryons épais.
Triton X-100	Sigma	T8787	Pour l’immunofluorescence