Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Summary

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Abstract

Le bon développement du cerveau mammifère repose sur un équilibre fin de la prolifération et de la différenciation des cellules souches neurales en différents types de cellules neurales. Cet équilibre est étroitement contrôlé par l’expression des gènes qui est peaufinée à plusieurs niveaux, y compris la transcription, la post-transcription et la traduction. À cet égard, un nombre croissant de preuves mettent en évidence un rôle essentiel de la régulation translationnelle dans la coordination des décisions relatives au sort des cellules souches neurales. La fractionnement polysome est un outil puissant pour l’évaluation du statut translationnel de l’ARNm aux niveaux génétique global et individuel. Ici, nous présentons un pipeline interne de profilage polysome pour évaluer l’efficacité translationnelle dans les cellules du cortex cérébral de souris en développement. Nous décrivons les protocoles pour la préparation de gradient de saccharose, la lyse de tissu, l’ultracentrifugation et l’analyse fractionnée-basée de l’état translationnel d’ARNm.

Introduction

Pendant le développement du cerveau des mammifères, les cellules souches neurales prolifèrent et se différencient pour générer des neurones et des^{gliales 1,2} . La perturbation de ce processus peut mener aux changements dans la structure et la fonction de cerveau, comme vu dans beaucoup de désordres neurodevelopmental^3,4. Le bon comportement des cellules souches neurales nécessite l’expression orchestrée de gènes spécifiques⁵. Tandis que le contrôle épigénétique et transcriptionnel de ces gènes a été intensivement étudié, les rés....

Protocol

Toute l’utilisation des animaux a été supervisée par le Comité de protection des animaux de l’Université de Calgary. Les souris CD1 utilisées pour l’expérience ont été achetées auprès d’un fournisseur commercial.

1. Préparation de solutions

REMARQUE Pour prévenir la dégradation de l’ARN, vaporisez l’établi et tout l’équipement avec la solution de décontamination RNase. Les conseils sans RNase sont utilisés pour l’expérience. Toutes les solutions sont préparées dans l’eau sans RNase.

1. Préparer la solution de bouillon de cycloheximide (100 mg/mL) dans DMSO et conserver à -20 °C.
2. Préparez une solu....

Results

À titre de démonstration, le lysate cortical contenant 75 ARN μg (mis en commun à partir de 8 embryons) a été séparé par le gradient de saccharose en 12 fractions. Pics d’absorption UV à 254 nm fractions identifiées contenant le sous-unité 40S, sous-unité 60S, monosome 80S et polysomes (Figure 4A). Analyse des fractions par tache occidentale pour la grande sous-unité ribosomique, Rpl10 a montré sa présence dans la sous-unité 60S (fraction 3), monosome (fraction 4) et polysomes (fractions 5-1.......

Discussion

Le profilage polysome est une technique couramment utilisée et puissante pour évaluer l’état translationnel à la fois au niveau d’un seul gène et à l’échelle du^{génome 14} . Dans ce rapport, nous présentons un protocole de profilage polysome à l’aide d’une plate-forme assemblée à domicile et son application pour analyser le cortex de souris en développement. Cette plate-forme rentable est facile à assembler et à générer des gradients de saccharose robustes et reproductibles et un profilage polysome .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL de microtubes sans ARN	Axygen	MCT-150-C
Antenne de 10 cm	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G aiguille	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
seringue de 30 mL	BD	302832
Extrémité émoussée aiguille	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bleu bromophénol	Sigma	115-39-9
souris CD1		Charles River Laboratory Pince
pointe courbe	Sigma	#Z168785
Cycloheximide	Sigma	66-81-9
données TracerDAQ	Mesure Calcul Convertisseur
		Mesure Informatique	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 pince	Sigma	#F6521
Collecteur de fractions	Bio-Rad	Modèle 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Actionneur à étage linéaire	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first brin kit de synthèse d’ADNc	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-série	Breadboard Thorlabs	MSB7515/M
Mini-série poteau optique	Thorlabs	MS2R/M
Mini-série	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø ; Poteau en aluminium 12,7 mm	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Pince à angle droit	Thorlabs	RA90/M
Angle droit & Oslash ; 1/2" à & Oslash ; Pince de poteau 6 mm	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
Pointes sans RNase	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase d’eau	libre Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Support mince à angle droit	Thorlabs	AB90B/M
Petite pince en V	Thorlabs	VC1/M
Désoxycholate de sodium	Sigma	302-95-4
Pilote de moteur pas à pas	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Pompe à seringue	Harvard Apparatus	70-4500
Pousse-seringue	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifugeuse		Beckman Coulter	L8-70M
Tubes ultracentrifuges	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
Moniteur UV	Bio-Rad	EM-1 Econo
Support vertical	Thorlabs	VB01A/M