Article de méthode

Génération efficace et évolutive d’astrocytes du mésencéphale ventral humain à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

DOI :

10.3791/62095

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2 octobre 2021

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1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons une méthode de génération reproductible d’astrocytes à motif de mésencéphale ventral à partir de hiPSC et des protocoles de caractérisation pour évaluer le phénotype et la fonction.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans la maladie de Parkinson, le dysfonctionnement progressif et la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans le mésencéphale ventral provoquent des symptômes qui changent la vie. La dégénérescence neuronale a diverses causes dans la maladie de Parkinson, y compris des mécanismes autonomes non cellulaires médiés par les astrocytes. Dans tout le SNC, les astrocytes sont essentiels à la survie et au fonctionnement des neurones, car ils maintiennent l’homéostasie métabolique dans l’environnement neuronal. Les astrocytes interagissent avec les cellules immunitaires du SNC, la microglie, pour moduler la neuroinflammation, qui est observée dès les premiers stades de la maladie de Parkinson, et a un impact direct sur la progression de sa pathologie. Dans les maladies à élément neuro-inflammatoire chronique, y compris la maladie de Parkinson, les astrocytes acquièrent un phénotype neurotoxique et améliorent ainsi la neurodégénérescence. Par conséquent, les astrocytes sont une cible thérapeutique potentielle pour ralentir ou arrêter la maladie, mais cela nécessitera une compréhension plus approfondie de leurs propriétés et de leurs rôles dans la maladie de Parkinson. Il est donc urgent de disposer de modèles précis d’astrocytes ventraux du mésencéphale humain pour l’étude in vitro.

Nous avons développé un protocole pour générer des cultures de haute pureté d’astrocytes spécifiques du mésencéphale ventral (vmAstros) à partir d’hiPSC qui peuvent être utilisés pour la recherche sur la maladie de Parkinson. Les vmAstros peuvent être produits régulièrement à partir de plusieurs lignées hiPSC et exprimer des marqueurs astrocytaires et ventraux spécifiques du mésencéphale. Ce protocole est évolutif et convient donc aux applications à haut débit, y compris pour le criblage de médicaments. De manière cruciale, les vmAstros dérivés de hiPSC présentent des caractéristiques immunomodulatrices typiques de leurs homologues in vivo, permettant des études mécanistes de la signalisation neuroinflammatoire dans la maladie de Parkinson.

Introduction

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La maladie de Parkinson touche 2 à 3 % des personnes de plus de 65 ans, ce qui en fait le trouble neurodégénératif du mouvement le plus répandu1. Elle est causée par une dégénérescence des neurones dopaminergiques du mésencéphale ventral dans la substance noire, entraînant des symptômes moteurs débilitants, ainsi que des problèmes cognitifs et psychiatriques fréquents2. La pathologie de Parkinson est caractérisée par des agrégats de la protéine, la α-synucléine, qui sont toxiques pour les neurones et entraînent leur dysfonctionnement et leur mort 1,2,3. Comme les neurones dopaminergiques sont la population en dégénérescence de la maladie de Parkinson, ils ont toujours été au centre de la recherche. Cependant, il est évident qu’un autre type de cellule dans le cerveau, les astrocytes, présente également des anomalies dans la maladie de Parkinson et contribuerait à la dégénérescence dans les modèles de Parkinson 4,5,6,7.

Les astrocytes sont une population cellulaire hétérogène qui peut se transformer à la fois physiquement et fonctionnellement selon les besoins. Ils soutiennent la fonction neuronale et la santé via une pléthore de mécanismes, y compris la modulation de la signalisation neuronale, la formation de l’architecture synaptique et le soutien trophique des populations neuronales via la sécrétion de facteurs spécifiques 6,8,9,10. Cependant, les astrocytes jouent également un rôle immunomodulateur important, essentiel au développement et à la propagation de la neuroinflammation10,11. La neuroinflammation est observée dans le cerveau des patients atteints de la maladie de Parkinson et, de manière significative, il a récemment été démontré qu’elle anticipe l’apparition des symptômes de la maladie de Parkinson 12,13,14,15, prenant ainsi le devant de la scène dans la recherche sur la maladie de Parkinson.

Au niveau cellulaire, on dit que les astrocytes deviennent réactifs en réponse à une blessure, une infection ou une maladie, dans le but de faciliter la neuroprotection 9,6,10,16. La réactivité décrit un changement dans le phénotype des astrocytes caractérisé par des changements dans l’expression des gènes, le sécrétome, la morphologie et les mécanismes d’élimination des débris cellulaires et des sous-produits toxiques 9,10,11,17. Ce changement réactif se produit en réponse à des signaux inductifs provenant de la microglie, qui sont les cellules immunitaires du SNC et les premiers intervenants en cas de blessure et de maladie9. Les astrocytes et les microglies répondent tous deux aux signaux inflammatoires en modérant leur propre fonction et peuvent transduire des signaux inflammatoires et ainsi influencer directement la neuroinflammation 9,10. Cependant, la nature chronique de la maladie de Parkinson entraîne une transition où les astrocytes réactifs deviennent toxiques pour les neurones et favorisent eux-mêmes la dégénérescence et la pathologie de la maladie 6,9,10,18,19. De manière significative, il a récemment été démontré que le blocage de la transformation des astrocytes en phénotype neurotoxique réactif empêche la progression de la maladie de Parkinson dans des modèles animaux11. La réactivité des astrocytes dans le paradigme de la neuroinflammation est donc devenue un objectif majeur de la recherche sur la maladie de Parkinson, et se rapporte également à un large éventail de maladies du SNC. Ensemble, ces résultats dressent un tableau de l’implication astrocytaire significative dans l’étiologie de la maladie de Parkinson, soulignant la nécessité de modèles de recherche précis qui récapitulent le phénotype des populations d’astrocytes humains impliquées dans la maladie de Parkinson.

Dans le cerveau embryonnaire, les neurones apparaissent en premier, la lignée astrogliale, à savoir les astrocytes et les oligodendrocytes, apparaissant plus tard dans le développement6. Des études in vivo et in vitro ont mis en évidence un certain nombre de voies de signalisation qui semblent contrôler la puissance des cellules progénitrices neurales, des dérivés neuronaux aux dérivés astrogliaux. En particulier, les signaux JAK/STAT, EGF et BMP jouent un rôle dans la prolifération, la différenciation et la maturation de l’astroglie 20,21. Ces voies ont été au centre de protocoles in vitro pour la génération d’astrocytes à partir de cellules pluripotentes, y compris hiPSC 6,22,23. Il existe de nombreux exemples réussis de génération d’astrocytes à partir de hiPSCs 6,24,25. Cependant, il est évident que les astrocytes in vivo du SNC possèdent des identités régionales spécifiques, qui sont directement liées à leur fonction, conformément aux exigences spécifiques de ces astrocytes par rapport à leurs voisins neuronaux spécialisés 17,24,25,26. Par exemple, en ce qui concerne spécifiquement le mésencéphale ventral, il a été démontré que les astrocytes de cette région expriment des ensembles spécifiques de protéines, y compris des récepteurs de dopamine permettant la communication avec la population locale de neurones dopaminergiques du mésencéphale26. De plus, les astrocytes ventraux du mésencéphale présentent des propriétés de signalisation uniques26. Par conséquent, pour étudier le rôle des astrocytes du mésencéphale ventral dans la maladie de Parkinson, nous avons besoin d’un modèle in vitro qui reflète leur ensemble unique de caractéristiques.

Pour résoudre ce problème, nous avons développé un protocole permettant de générer des astrocytes du mésencéphale ventral (vmAstros) à partir de hiPSC. Les vmAstros résultants présentent des caractéristiques de leurs homologues du mésencéphale ventral in vivo, telles que l’expression de protéines spécifiques, ainsi que des fonctions immunomodulatrices. Les résultats présentés proviennent de la différenciation des lignées hiPSC NAS2 et AST23, qui nous ont été dérivées et offertes par le Dr Tilo Kunath27. NAS2 a été généré à partir d’un sujet témoin sain tandis que AST23 est dérivé d’un patient atteint de la maladie de Parkinson porteur d’une triplication dans le locus codant pour la α-synucléine (SNCA). Ces lignées hiPSC ont déjà été caractérisées et utilisées dans un certain nombre d’articles de recherche publiés, notamment pour la génération de divers types de cellules neurales 27,28,29,30,31.

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Protocole

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1. Décongélation, maintenance et cryoconservation de la ligne hiPSC humaine

  1. Pour le revêtement des plaques de culture hiPSC, diluer la vitronectine à 5 μg/mL (1:100) dans du PBS à raison de 1 mL par 10 cm de surface de plaque de culturecellulaire 2 . Laisser reposer 1 h à température ambiante.
  2. Retirez la vitronectine et procédez immédiatement à l’ajout de hiPSC/milieux dans la plaque de culture.
    REMARQUE Lors de l’élimination de la vitronectine de la plaque, il est crucial que la surface de culture ne se dessèche pas.
  3. Pour décongeler les hiPSC, retirez les cryoflacons contenant des hiPSC de l’azote liquide et placez-les dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que le contenu soit complètement décongelé.
  4. Préparez 9 ml de milieu de culture cellulaire préchauffé (p. ex., E8 ou E8 Flex) contenant 1 supplément cellulaire (p. ex., Revitacell). Ajouter 1 mL goutte à goutte au contenu du cryoflacon. Placez les 8 ml restants dans un tube à centrifuger de 15 ml et ajoutez-y le contenu dilué du cryoflacon.
    ATTENTION : Ne triturez pas le contenu.
  5. Centrifugeuse à 150 x g pendant 3 min. Aspirez le liquide sans perturber la pastille cellulaire et mettez-le en suspension dans un volume approprié de milieu de culture cellulaire (par exemple, E8 ou E8 Flex) contenant 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell). Par exemple, 2 mL par puits d’une plaque à 6 puits.
  6. Ajouter les hiPSC remis en suspension dans les plats enrobés de vitronectine et les placer dans un incubateur à 37 °C/5 % de CO2 .
    REMARQUE : les hiPSC doivent commencer à se fixer aux objets en plastique enduits de vitronectine dans les 30 à 2 h suivant la décongélation.
  7. Maintenir les hiPSC dans un milieu de culture cellulaire (p. ex., E8 ou E8 Flex). Alimentation quotidienne des cellules par échange de milieu. Préchauffez toujours le milieu de culture pendant 30 minutes avant de le nourrir.
    REMARQUE Si vous utilisez E8 Flex, les hiPSC ne nécessitent pas de changement de support toutes les 24 h et les incréments d’alimentation peuvent être prolongés jusqu’à 48 h, si nécessaire. Les milieux E8 Flex ou E8 produisent des cultures hiPSC de qualité égale. Les cellules HiPSC doivent être cultivées pendant au moins 14 jours après la décongélation et avant de commencer les étapes de différenciation. Des périodes de culture de moins de 14 jours semblent avoir un impact négatif sur la survie des hiPSC pendant la période de différenciation initiale. Passage des hiPSCs à environ 80 % de confluence (Figure 1A : intervalle de passage de 3 à 4 jours).
  8. 1 h avant de commencer, ajoutez 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell) à la culture hiPSC.
  9. Laver une fois les hiPSC avec du PBS (sans calcium ni magnésium) et ajouter 0,5 mM d’EDTA (dilué à partir du stock dans du PBS sans calcium ni magnésium).
  10. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante, ou jusqu’à ce que les hiPSC commencent à se détacher les uns des autres et à prendre un aspect plus arrondi, les limites de chaque iPSC apparaissant plus brillantes au microscope à fond clair.
  11. Ajoutez 200 μL d’EDTA sur une zone ciblée des hiPSC à l’aide d’une pipette. S’ils se détachent facilement, créant un espace dégagé dans la couche cellulaire, ils sont prêts à être récoltés. S’ils ne se détachent pas facilement, laissez-les dans l’EDTA et répétez après 1 min.
  12. Lorsque vous êtes prêt à procéder, retirez délicatement l’EDTA et, à l’aide d’une pipette, lavez doucement les hiPSC deux fois avec un milieu de culture cellulaire (par exemple, E8 ou E8 Flex).
    REMARQUE : Pour y parvenir sans que les hiPSCs ne se détachent, inclinez la plaque et ajoutez le milieu goutte à goutte sur le côté de la plaque de culture.
  13. Pour récolter les hiPSC, utilisez un milieu de culture cellulaire de 1 mL (par exemple, E8 ou E8 Flex) contenant 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell). Relâchez le support directement sur la couche hiPSC et les cellules devraient se détacher. Au besoin, répéter l’opération avec un autre support de 1 ml.
  14. Observez les hiPSC au microscope. Idéalement, les hiPSC devraient apparaître en grappes relativement uniformes, comme le montre la figure 1B. Si les grappes de cellules hiPSC sont beaucoup plus grandes ou de taille très variable, utilisez la pipette pour briser les grappes de cellules hiPSC plus grandes (Figure 1B).
    REMARQUE : Ne sur-triturez pas les hiPSC. Bien que le supplément augmente la survie cellulaire globale, la surtrituration a un impact négatif sur la survie de la culture hiPSC. Il est recommandé de passer 1 à 4 fois à l’aide d’une pipette.
  15. À l’aide d’une pipette sérologique, transférez la suspension hiPSC sur une plaque enrobée de vitronectine comme préparé à l’étape 1.1. Remettez la culture hiPSC dans l’incubateur à 37 °C/5 % de CO2 .
    REMARQUE : Cryoconserver les hiPSC à environ 80 % de confluence.
  16. 1 h avant de commencer, ajoutez 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell) à la culture hiPSC.
  17. Détachez les hiPSC des plaques de culture à l’aide d’EDTA 0,5 mM comme décrit à l’étape 1.4, en recueillant des cellules dans un milieu de culture cellulaire (par exemple, E8 ou E8 Flex) contenant 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell). Centrifugeuse à 150 x g pendant 3 min.
  18. Remettre en suspension les hiPSC granulés dans les milieux de congélation cellulaire (voir le tableau des matériaux). Utiliser 700 μL par zone de culture de 10 cm2 , soit l’équivalent de 1 cryoflacon de cellules par puits d’une plaque à 6 puits.
  19. Transférez les cryoflacons dans un récipient de congélation cellulaire approprié (pour plus de détails, voir le tableau des matériaux).
  20. Transférez le récipient de congélation dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h. Après 24 h, les cryoflacons peuvent être transférés dans de l’azote liquide (-196 °C) pour un stockage à long terme.

2. Protocole de différenciation vmAstro

REMARQUE : La Figure 1A présente un résumé schématique du protocole de différenciation vmAstros. Une liste détaillée des réactifs requis pour le protocole et leur préparation est donnée dans le tableau 1.

  1. Induction des vmNPCs
    REMARQUE : Ce protocole a été optimisé pour commencer avec un minimum avec 1x puits d’une plaque à 6 puits (10 cm2) de hiPSCs de 70 % à 80 % de confluence, soit environ 4-5 x 104 cellules/cm2 (Figure 1B)30. Le nombre et la densité des cellules de départ doivent être optimisés pour chaque lignée de cellules hiPSC, car ils ont un impact significatif sur l’efficacité de survie et de différenciation.
    1. Retirer le milieu de culture cellulaire des hiPSC et laver 3 fois dans DMEM/F12 + glutamax. Remplacez le support par un support à induction vmNPC de 2 mL (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189. Voir le tableau 1 pour plus de détails sur la préparation des milieux et des réactifs).
    2. Nourrissez un jour sur deux avec un demi-changement de média après 24 h et un changement de média complet à 48 h.
      REMARQUE : Après 3-4 jours, la culture vmNPC nécessitera un passage. Un rapport de passage standard de 1:3 ou 1:4 est recommandé, ce qui doit être optimisé pour chaque ligne hiPSC utilisée.
    3. 1 h avant le passage, ajoutez 1 supplément cellulaire (p. ex., Revitacell) aux vmNPC et préparez 1 matrice de membrane basale (p. ex., Geltrex) en plastique de culture tissulaire enduit (section 2.2 Préparation de la matrice de membrane basale et revêtement du plastique de culture de souche).
    4. Retirez le support des vmNPCs et lavez-le 2 fois avec du D-PBS. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire préchauffée (p. ex. Accutase) par zone de culture de 10 cm2 (1 mL par puits d’une plaque à 6 puits).
    5. Placez à 37 °C pendant 1 min, puis examinez les vmNPCs à l’aide d’un microscope à contraste de phase.
      REMARQUE : Les vmNPC commenceront à s’arrondir, leurs processus se rétracteront et des espaces apparaîtront dans la couche de cellules. Cela peut prendre de 1 à 3 minutes selon la densité cellulaire.
    6. Lorsque les vmNPCs prennent cette apparence, ajoutez 100 μL de solution de décollement cellulaire (par exemple, Accutase) sur la couche des vmNPC.
      REMARQUE : Si les vmNPC sont prêts à se détacher, un trou dans la couche cellulaire apparaîtra. Si ce n’est pas le cas, les vmNPCs nécessitent une incubation supplémentaire avec une solution de détachement cellulaire.
    7. Si les vmNPCs se détachent facilement, retirez délicatement la solution de détachement de cellules et lavez les vmNPCs 2x avec le support N2B27. Ajoutez doucement le milieu N2B27 sur le côté du puits ou du récipient de culture et remuez doucement pour laver, en veillant à ce que les vmNPC ne se détachent pas.
      REMARQUE : Cette étape doit être effectuée rapidement pour s’assurer que les vmNPC ne se rattachent pas à la surface de la cellule. Si les vmNPCs commencent à se détacher lors des étapes de lavage, collecter par centrifugation à 150 x g pendant 3 min. Les vmNPCs ne sont pas centrifugés en standard lors du passage car cela peut réduire leur survie.
    8. Enfin, retirez les vmNPCs à l’aide d’une pipette, en éjectant vigoureusement le milieu d’induction vmNPC contenant 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell) directement sur la couche cellulaire. Cela devrait éliminer les vmNPC, qui peuvent ensuite être transférés directement dans les nouveaux récipients de culture enrobés de matrice.
      REMARQUE : Ne réutilisez pas de supports contenant déjà des vmNPCs remis en suspension pour supprimer d’autres cellules, car cela entraînerait une sur-trituration, ce qui réduirait leur survie.
    9. Remplacer dans l’incubateur à 37 °C/5 % de CO2 . Les vmNPCs doivent commencer à se fixer sur la surface recouverte d’une matrice après 20 à 30 min. Remplacez la moitié du milieu par du milieu d’induction vmNPC frais (sans supplément cellulaire) après 24 h et continuez le programme d’alimentation comme précédemment.
    10. Continuez le régime d’alimentation et de passage pendant 10 jours.
  2. Préparation de la matrice de la membrane basale et revêtement du plastique de culture tissulaire
    REMARQUE : Pour l’entretien des vmNPC, 1x matrice de membrane basale (par exemple, Geltrex) est utilisée pour le revêtement des articles en plastique. Pour la maintenance des vmAPCs ou des vmAstros, une matrice de membrane basale 0,25x peut être utilisée.
    1. Retirer le stock de matrice de membrane sous-jacente d’un congélateur à -80 °C et le placer dans un réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit pour décongeler.
    2. Diluer 1:10 avec du DMEM/F12 + glutamax glacé, aliquote et stocker à -80 °C comme un stock 10x.
    3. Lors du revêtement de la vaisselle en plastique, diluez ce stock 10x à 1x (pour les vmNPCs) ou 0,25x (pour les vmAPCs ou vmAstros) avec du DMEM/F12 + glutamax glacé.
    4. Ajouter immédiatement au plastique de culture tissulaire à raison de 1 mL par 10 cm2, par exemple, 1 mL par puits d’une plaque à 6 puits.
    5. Placer à 37 °C pendant 1 h. La solution de matrice de membrane basale ne doit pas être retirée de la vaisselle en plastique avant d’être prête à ajouter des milieux/cellules pour s’assurer que la vaisselle en plastique enduite ne se dessèche pas. Les plaques revêtues de matrice ne nécessitent pas de lavage avant l’ajout de cellules.
  3. Expansion des vmNPCs
    1. Au jour 10 du protocole, remplacez le milieu d’induction par un milieu d’expansion vmNPC (N2B27 + GDNF + BDNF + acide ascorbique. Voir le tableau 1 pour plus de détails sur la préparation des milieux et des réactifs).
      REMARQUE : Les vmNPCs n’ont pas besoin d’être ajoutés à des mitogènes pour induire la prolifération. Le BDNF, le GDNF et l’acide ascorbique favorisent la survie et le maintien des vmNPCs30.
    2. Nourrissez un jour sur deux avec un demi-changement de média après 24 h et un changement de média complet à 48 h.
      REMARQUE : Après 3-4 jours, la culture vmNPC nécessitera un passage. Pour le passage, un rapport de passage standard de 1:3 ou 1:4 est recommandé (il doit être optimisé pour chaque ligne hiPSC utilisée. Déterminez le ratio qui donne le meilleur taux de survie, de prolifération et de génération de vmNPC.
    3. 1 h avant le passage, ajouter 1x supplément cellulaire (p. ex., Revitacell) aux vmNPC et préparer à l’avance 1x plaques/flacons revêtus de matrice (section 2.2 Préparation de la matrice de membrane basale et revêtement du plastique de culture de souche). Préchauffer la solution de décollement cellulaire (p. ex., Accutase) à 37 °C. Préchauffer le milieu d’expansion frais vmNPC contenant 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell).
    4. Retirez les supports des vmNPCs et lavez-les 2 fois avec D-PBS. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire (p. ex. Accutase) par zone de culture de 10 cm2 (1 mL par puits d’une plaque à 6 puits). Placez à 37 °C pendant 1 min, puis examinez les vmNPCs à l’aide d’un microscope à contraste de phase.
      REMARQUE : Les vmNPC commenceront à s’arrondir, leurs processus se rétracteront et des espaces apparaîtront dans la couche de cellules. Cela peut prendre de 1 à 3 minutes selon la densité cellulaire.
    5. Lorsque les vmNPCs prennent une apparence arrondie, ajoutez 100 μL de solution de décollement cellulaire (par exemple, Accutase) sur la couche de vmNPCs.
      REMARQUE : Si les vmNPC sont prêts à se détacher, un trou dans la couche cellulaire apparaîtra. Si ce n’est pas le cas, les vmNPCs nécessitent une incubation supplémentaire avec la solution de détachement de cellules.
    6. Si les vmNPCs se détachent facilement, retirez délicatement la solution de détachement de cellule et lavez les vmNPCs 2x avec le support N2B27. Ajoutez doucement le milieu N2B27 sur le côté du puits ou du récipient de culture et remuez doucement pour laver, en veillant à ce que les vmNPC ne se détachent pas.
      REMARQUE : Si les vmNPCs commencent à se détacher en grand nombre lors des étapes de lavage, collectez-les par centrifugation à 150 x g pendant 3 min. Les vmNPCs ne sont pas centrifugés en standard lors du passage, car cela peut réduire leur survie. Cette étape doit être effectuée rapidement pour s’assurer que les vmNPCs ne se rattachent pas à la surface de la cellule.
    7. Retirez les vmNPCs à l’aide d’une pipette et éjectez vigoureusement le milieu d’expansion vmNPC contenant 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell) directement sur la couche cellulaire. Cela devrait permettre d’éliminer les vmNPC, qui peuvent ensuite être transférés directement dans les plaques/flacons revêtus de matrice pré-préparés (voir section 2.2 « Préparation de la matrice de membrane basale et revêtement du plastique de culture tissulaire »).
      REMARQUE : Ne réutilisez pas de supports contenant déjà des vmNPCs remis en suspension pour supprimer d’autres cellules, car cela entraînerait une sur-trituration, ce qui réduirait leur survie.
    8. Remplacer dans l’incubateur à 37 °C/5 % de CO2 . Les vmNPCs doivent commencer à se fixer à la surface revêtue de matrice après 20 à 30 min. Après 24 h, remplacer la moitié du milieu de culture par un milieu d’expansion vmNPC frais (sans supplément cellulaire) et poursuivre le programme d’alimentation précédent.
    9. Continuez ce régime d’alimentation et de passage pendant 10 jours. Les vmNPCs peuvent être étendus jusqu’au jour 50.
  4. Différenciation et expansion des vmAPC
    REMARQUE : les vmNPCs peuvent être utilisés avec succès pour la génération de vmAPCs/vmAstros entre 30 et 50 jours à partir de l’étape initiale des hiPSC (Figure 1A).
    1. Prenez une culture vmNPC confluente et lavez vmNPCs 3x dans un DMEM/F12 avancé pour éliminer les traces des composants des supports d’expansion vmNPC. Remplacez le support par un support d’extension vmAPC (ASTRO media +EGF +LIF. Voir le tableau 1 pour plus de détails sur la préparation des milieux et des réactifs).
    2. Après 72 h de passage, la culture vmNPC est à un rapport élevé (1:7,5). Par exemple, en supposant que les vmNPCs étaient maintenus dans un seul puits d’une plaque à 6 puits, ils devraient maintenant être passés dans une fiole de 75 cm2 revêtue d’une matrice 1x (revêtue comme décrit à la section 2.2 « Préparation de la matrice de membrane basale et revêtement du plastique de culture tissulaire »). Passage à l’aide d’une solution de détachement de cellule, comme décrit pour les vmNPCs à la section 2.3 'Expansion des vmNPC'.
    3. Remettre en suspension les vmNPC dans un volume approprié de support d’extension vmAPC (7,5 à 15 ml par flacon de75 cm 2 . Effectuez les changements de support tous les 3 jours, ou selon les besoins des cellules.
      REMARQUE : À partir de ce moment, les vmNPC sont appelés vmAPCs et doivent être passés en tant que cellules uniques plutôt qu’en grappes de cellules. Les vmAPCs doivent être adoptés tous les 3 à 7 jours ou au fur et à mesure qu’ils deviennent confluents pour éviter de devenir trop confluents. À partir de ce moment, la concentration réduite de matrice 0,25x doit être utilisée pour revêtir les articles en plastique (comme décrit à la section 2.2 Préparation de la matrice de membrane basale et revêtement du plastique de culture tissulaire).
    4. Développer les vmAPCs jusqu’à ce qu’ils atteignent le jour 90 (à partir du stade hiPSC), en cryoconservant les vmAPCs à différents moments de leur expansion.
  5. Génération de vmAstros matures à partir de vmAPCs
    REMARQUE : À ce stade, les vmAPCs peuvent être cultivés dans des flacons de culture tissulaire de175 cm 2 . Cela peut être étendu pour la génération d’un grand nombre de vmAstros matures.
    1. Lorsque les vmAPCs atteignent 80 % de confluence, laver 3 fois avec le média ASTRO et le remplacer par le média de maturation vmAstros (média ASTRO + BMP4 + LIF. Voir le tableau 1 pour plus de détails sur la préparation des milieux et des réactifs).
    2. Effectuez un changement complet de support tous les 3 jours, ou selon les cellules, pendant 10 jours.
      REMARQUE : a) À ce stade, la caractérisation indique que les vmAstros sont matures, comme le confirme l’immunocytochimie (Figure 2G - I) et l’analyse de l’expression génique (manuscrit en préparation). b) Les vmAstros utilisés immédiatement après la maturation doivent être re-plaqués sur une surface nouvellement préparée recouverte d’une matrice. Le maintien des vmAPCs ou des vmAstros sur la même surface de culture pendant plus de 14 jours pourrait conduire à des cultures sous-optimales, où les cellules commencent à diminuer en taille et même à se détacher. c) Pour les applications examinant la modulation neuroinflammatoire, les BMP et les LIF sont éliminés 72 h avant la stimulation neuroinflammatoire. Il s’agit d’éviter toute interaction potentielle entre la signalisation BMP/LIF et la signalisation neuroinflammatoire induite.
    3. Les vmAstros peuvent désormais être reconditionnés pour des tests expérimentaux, par exemple, sur des lamelles pour l’immunocytochimie ou cryoconservés pour des applications futures (sections 3, 4).
      REMARQUE : Le passage ne devrait pas être nécessaire à ce stade du protocole, car la prolifération ne devrait se produire qu’à un taux très faible. Les vmAPC trop densément plaqués à ce stade maintiennent des niveaux de prolifération plus élevés. Si c’est le cas, passez et divisez les cellules pour obtenir une densité comme le montre la figure 1F.

3. Cryoconservation des vmNPC, vmAPCs et vmAstros

REMARQUE : Cryopreserve vmNPCs/vmAPCs/vmAstros à pleine confluence.

  1. 1 h avant de commencer, ajoutez 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell) à la culture. Remplissez le récipient de cryostockage (voir le tableau des matériaux) avec de l’isopropanol à température ambiante.
  2. Détachez les cellules des plaques de culture à l’aide d’une solution de détachement cellulaire comme décrit précédemment, en recueillant les cellules dans un milieu approprié (milieu N2B27 ou ASTRO) contenant 1x supplément cellulaire (par exemple, Revitacell). Centrifugeuse à 150 x g pendant 3 min.
  3. Remettre en suspension les volumes de vmNPCs/vmAPCs/vmAstros granulés dans les volumes de fluides de congélation de cellules (voir le tableau des matériaux) comme suit (étapes 3.3.1 à 3.3.3)
    1. Pour les vmNPC : utiliser 700 μL par 10 cm2 de surface de culture, dans 1 flacon cryogénique.
    2. Pour les vmAPC : utiliser 700 μL par zone de culture de 60 cm2 , dans 1 flacon cryogénique (environ 1/3 d’une fiole de culture T175).
    3. Pour vmAstros : résuspendez dans un support de 2 ml et comptez le nombre de vmAstros. Recentrifuger et remettre en suspension dans des milieux de congélation cellulaire (voir Tableau des matériaux) à un nombre par cryoflacon approprié aux applications futures. En supposant une perte cellulaire approximative de 15 % due à la congélation-décongélation, les vmAstros nouvellement décongelés sont comptés et recouverts d’un nombre de cellules excédentaire de 15 % pour compenser la mort cellulaire dans le processus de congélation-décongélation. Cela équivaut donc à 74 750 vmAstros par cm2. Les vmAstros décongelés sont maintenus pendant 72 h dans les médias ASTRO avant d’être analysés.
  4. Transférez les cryoflacons dans une cuve de congélation cellulaire (pour plus de détails, voir le tableau des matériaux) et transférez la cuve de congélation dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h. Après 24 h, les cryoflacons peuvent être transférés dans de l’azote liquide (-196 °C) pour un stockage à long terme.

4. Caractérisation du phénotype vmAstro

  1. Immunocytochimie
    1. Placez 100-200 lamelles en verre de 13 mm dans des boîtes de Pétri en verre sur une couche de papier filtre et stérilisez-les dans un autoclave sec.
    2. Transférez les lamelles dans des puits de plaques à 4 ou 24 puits à l’aide d’une pince stérile. Ajouter 1x solution matricielle (p. ex., Geltrex) sur les lamelles sous forme de gouttelettes de 50 μL et incuber à 37 °C pendant 1 h.
    3. Passage ou décongélation vmAstros, remise en suspension dans les milieux ASTRO et réalisation d’un comptage. Plaque vmAstros à 25-100 000 cellules par lamelle dans une gouttelette de 50 μL.
    4. Retirez la matrice de la lamelle et ajoutez immédiatement vmAstros dans une gouttelette de support. Placez à 37 °C pendant 30 min, puis inondez les puits avec un média ASTRO supplémentaire de 250 μL.
      REMARQUE : Si vous effectuez une immunocytochimie pour vérifier simplement l’expression des astrocytes et des marqueurs du mésencéphale, vmAstros peut être fixé 24 heures après le placage.
    5. Préparez une solution de formaldéhyde à 4 % en diluant une solution de formaldéhyde à 36 % 1:9 dans du D-PBS.
    6. Laver vmAstros 1x avec D-PBS. Ajouter immédiatement 4 % de formaldéhyde dans les puits et laisser à température ambiante pendant 10 min.
    7. Retirez le formaldéhyde et remplacez-le par du D-PBS. Soit conserver à 4 °C, soit passer à l’immunocytochimie.
    8. Laver les lamelles dans les puits 3 fois avec D-PBS. Perméabiliser et bloquer dans 10 % de sérum de chèvre, 1 % de BSA dans 0,1 % de PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) pendant 1 h à température ambiante.
    9. Ajouter des anticorps primaires (tableau des matières) dans du sérum de chèvre à 1 %, 0,1 % de BSA dans du PBTx à 0,1 % (D-PBS + 1:1000 Triton-X) et incuber toute la nuit à 4 °C sur un transat.
    10. Le lendemain, retirez les anticorps primaires et lavez les lamelles 3 fois avec du D-PBS.
    11. Ajoutez des anticorps secondaires appropriés (tableau des matières) dans du sérum de chèvre à 1 %, de la BSA à 0,1 % de PBTx, et incubez pendant 1 à 2 h à température ambiante et protégez-le de la lumière sur un transat. Laver les lamelles 3x avec D-PBS.
    12. Ajouter la solution de DAPI (0,1 μg/mL de DAPI dans du D-PBS) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Laver les lamelles 3x avec D-PBS.
    13. Pour monter la lamelle, ajouter une goutte de 5 μL de média de montage Mowiol/DABCO [12 % de Mowiol (p/v), 12 % de glycérol (p/v) dissous pendant la nuit, en agitant dans 0,2 M Tris (pH 8,5) avec 25 mg/mL de 1,4-diazabicylo [2.2.2]octane (DABCO)] sur une lame de microscope en verre. À l’aide d’une pince, retirez délicatement la lamelle du puits ; tamponnez le bord de la lamelle sur le tissu pour éliminer l’excès de liquide et placez vmAstros côté vers le bas sur la gouttelette Mowiol/DABCO.
    14. Répéter l’opération pour chaque lamelle et laisser sécher pendant 8 h avant l’examen microscopique.
  2. Mesure ELISA de la sécrétion d’IL-6 par vmAstros en réponse à un traitement par cytokines
    REMARQUE : Après la maturation de 10 jours avec BMP4 et LIF, les vmAstros doivent être passés, comptés et plaqués sur de la plastique de culture tissulaire à revêtement matriciel 0,25x (comme détaillé dans Paragraphe 2.2Préparation de la matrice de la membrane basale et revêtement du plastique de culture tissulaire), à une densité de 65 000 vmAstros par cm2 dans les médias ASTRO. BMP4 et LIF doivent être retirés du vmAstros 72 h avant le traitement par cytokines, car la signalisation active de ces facteurs peut interférer avec l’efficacité du traitement par cytokines. Alternativement, les vmAstros cryoconservés peuvent être décongelés et utilisés pour des tests.
    1. Le jour du test, laver délicatement vmAstros 3x dans un milieu non redox (DMEM/F-12 + glutamax + N2).
    2. Utilisez un témoin non traité et bien traité aux cytokines à des fins de comparaison. Ajouter la cytokine choisie à la concentration optimisée. Les données de la figure 2J - L ont été obtenues à l’aide de l’IL-1α à 3 ng/mL9 dans un milieu non redox à raison de 1 mL par surface de culture cellulaire de 10 cm2.
    3. Remplacer vmAstros dans l’incubateur à 37 °C/5 % de CO2 pendant 24 h. Après 24 h, recueillir les milieux de culture dans des tubes à microfuge stériles.
    4. Si l’ELISA n’est pas effectué immédiatement, congelez en photofois les échantillons de milieux en immergeant les tubes de microfuge dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C pour une analyse future.
      REMARQUE : Le protocole suivant est optimisé spécifiquement pour une utilisation avec le kit ELISA IL-6 détaillé dans la table des matériaux. Les anticorps et les étalons livrés sous forme de poudre lyophilisée dans un nouveau kit ELISA doivent être reconstitués avant la première utilisation et aliquotes pour une utilisation future. La fiche technique fournie avec le kit détaille les réactifs et les volumes nécessaires à la reconstitution. L’anticorps de capture doit être reconstitué en PBS (sans protéine porteuse).
    5. Effectuez l’ELISA dans un format de plaque à 96 puits et calculez les volumes de réactifs en fonction des puits utilisés. Le jour de l’ELISA, préparer l’anticorps de capture en diluant le stock 1:120 dans du PBS. Enduisez la plaque en chargeant 50 μL d’anticorps de capture par puits. Recouvrez la plaque d’une bande adhésive et incubez à température ambiante pendant la nuit.
    6. Le lendemain, laver la plaque 3 fois avec du D-PBS-Tween (D-PBS avec 0,05 % de Tween-20), 100 μL par puits. Éponger.
    7. Bloquer la plaque en chargeant 150 μL DE D-PBS/1 % de BSA par puits. Incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. Laver la plaque comme décrit.
    8. Décongelez les échantillons sur de la glace (cela peut prendre 1 à 2 h). Diluez les échantillons 1:5 en chargeant 10 μL d’échantillon et 40 μL DE D-PBS/1 % BSA. Vortex chaque échantillon avant le chargement.
      REMARQUE : Il est nécessaire de diluer les échantillons lors de la réalisation d’un ELISA IL-6, les dilutions doivent être optimisées.
    9. Préparez l’étalon supérieur (1 000 ρg/mL) en diluant la matière première 1:180 dans du D-PBS/1 % de BSA. Préparez 7 étalons en procédant à une dilution en série de l’étalon supérieur. Vortex entre chaque dilution.
    10. Ajouter 50 μL d’étalons/échantillons dans les puits. Utilisez D-PBS/1 % BSA comme blanc. Incuber à température ambiante pendant 2 h sur un agitateur orbital pour bien mélanger les échantillons dilués. Laver la plaque comme décrit.
    11. Préparez l’anticorps de détection en diluant la matière à 1:60 dans du D-PBS/1 % BSA. Chargez 50 μL d’anticorps de détection par puits. Couvrir l’assiette et incuber à RT pendant 2 h. Laver la plaque comme décrit.
    12. Préparer la streptavidine conjuguée à la peroxydase de raifort (Strep-HRP) en diluant la pâte 1:40 dans du D-PBS/1 % BSA. Chargez 50 μL de Strep-HRP par puits et incubez à température ambiante pendant 20 min dans l’obscurité. Laver la plaque comme décrit.
    13. Initier la réaction de couleur en chargeant 50 μL de solution de substrat TMB par puits. Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 min (ou jusqu’à ce que les étalons et les échantillons aient développé une couleur bleue).
      REMARQUE : Le TMB est stocké à 4 °C mais doit être utilisé à température ambiante.
    14. Arrêtez la réaction en ajoutant 25 μL de solution d’arrêt (1 M H2SO4) par puits et notez le changement de couleur du bleu au jaune.
    15. Lire la plaque à une absorbance de 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Réglez la correction de longueur d’onde sur une absorbance de 540 nm pour maximiser la précision. Calculer les concentrations en protéines dans les échantillons à partir de la courbe standard produite.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Différenciation, méthodologie et progression
Nous présentons ici les détails des méthodes employées pour la génération des vmAstros et des protocoles utilisés pour leur caractérisation phénotypique ultérieure. La méthode de génération de vmAstros est composée de plusieurs étapes de différenciation distinctes, qui peuvent être surveillées par microscopie et identifier des caractéristiques morphologiques distinctes (Figure 1A-F). Une cultur...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette méthode de génération de vmAstros à partir de hiPSC est très efficace, générant des cultures pures de vmAstros, et étant reproductible pour la génération de vmAstros à partir de différentes lignées hiPSC. Ce protocole a été développé autour de la récapitulation des événements de développement nécessaires dans l’embryon pour modéliser correctement le mésencéphale en développement et générer des astrocytes et comprend trois étapes définies : 1) l’induction neurale ventrale du mésencé...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été financé par une subvention du projet Parkinson’s UK (G-1402) et une bourse d’études. Les auteurs remercient le Wolfson Bioimaging Facility pour son soutien et son aide dans ce travail.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
réactifs
0.2M Tris-Cl (pH 8.5)n/an/aComposé à partir de base Tris et plus HCl
0.5M EDTA, PH 8ThermoFisher  ; 15575-0201:1000 en D-PBS jusqu’à 0,5 mM final  ;
1,4-diazabicylo[2.2.2]octane (DABCO)SigmaD27802-  ; 25 mg/mL dans la solution de montage Mowiol
13 mm lamellesVWR631-0149
2-Mercaptoéthanol (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010A 1x NEAA mais nous ajoutons à la concentration finale de 2x (0,2 mM)
Acide ascorbiqueSigmaA5960200 mM de support, 1:1000 à 200 & micro ; M final
B27 SupplémentThermoFisher17504-04450x stock
BSASigma5470
Milieu de congélation de cellulesSigmaC2874Cryostor CS10
Récipient de congélation de cellulesNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860,8 mM de stock, dilution 1:1000 à 0,8 & micro ; M final
Cryoflacons  ; SigmaCLS430487
DAPI  ;SigmaD95421 mg/mL, 1:10 000 à 100 ng/mL final (en PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS sans Mg ni Ca)ThermoFisher14190144<strong>pH 7,2
E8 Flex medium kitThermoFisherA2858501
Formaldéhyde (solution à 36 %)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 ou 1:400 en DMEM/F12
GlutamaxThermoFisherglacé 350500382 mM (1:200 en N2B27, 1:100 en média ASTRO à 20 & micro ; Finale M)  ;
GlycérolSigmaG5516
BDNF humain  ; Peprotech450-0220 & micro ; g/mL de stock, 1:1000 à 20 ng/mL final
Human BMP4Peprotech120-0520 & micro ; g/mL de stock, 1:1000 à 20 ng/mL final
EGF humainPeprotechAF-100-1520 & micro ; g/mL de stock, 1:1000 à 20 ng/mL final
Human GDNFPeprotech450-1020 µ ; g/mL de stock, 1:1000 à 20 ng/mL solution finale
d’insuline humaineSigma  ;I927810 mg/mL, 1:2000 à 5 & micro ; g/mL final
Humain LIFPeprotech300-0520 µ ; g/mL de stock, 1:1000 à 20 ng/mL
final IL-6 ELISAkit BiotechneDY206
IsopropanolSigma  ; I9516-4LPour le remplissage du récipient de cryostockage Mr Frosty
LDN193189SigmaSML0559100 µ ; Stock M, dilution 1:10 000 jusqu’à 10 nM final
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 SupplementThermoFisher17502048100x stock
NEAAThermoFisher1114003510 mM stock, 1:100 à 0,1 mM final  ;
Milieu neurobasalThermoFisher21103049
Sérum de chèvre normalVector Labs Vector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x stock, 1:100 à 1x
final SB431542Tocris161410 mM stock, dilution 1:1000 à 10 µ ; M final
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 & micro ; g/mL de stock, 1:1000 à 200 ng/mL
Tris-HClSigma  ;PHG0002  ;
Triton-XSigmaX100
Tween-20Sigma  ;P7949
VitronectineThermoFisherA147001:50 dans le D-PBS
Anticorps forts> pour l’immunocytochimie  ; CompanyNuméro de catalogueSpecies hôte
Anticorps contre S100bSigmaSAB4200671souris ; 1:200
Anticorps contre FOXA2SCBTNB600501souris ; 1:50
Anticorps contre LMX1AProSci7087Rabbit ; 1:300
Anticorps contre LMX1AMilliporeAB10533lapin ; 1:2000
Anticorps contre LMX1BProteintech18278-1-APLapin ; 1:300
Anticorps contre GLASTProteintech20785-1-APLapin ; 1:300
Anticorps contre GFAPDakoZ0334Lapin ; 1:400
Anticorps contre CD49fProteintech27189-1-APLapin ; 1:100
Anticorps contre MSI1Abcamab52865Rabbit ; 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  ;ThermoFisherA32731Chèvre ; 1:500
Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-SourisThermoFisherA32723Chèvre ; 1:500
Alexa Fluor 568 Chèvre Anti-LapinThermoFisherA11036Chèvre ; 1:500
Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-SourisThermoFisherA11031Chèvre ; 1:500
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Références

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Ventral Midbrain AstrocytesHuman Astrocyte GenerationInduced Pluripotent Stem CellsParkinson s Disease ModelsAstrocyte NeuroinflammationAstrocyte NeurotoxicityAstrocyte Drug ScreeningAstrocyte ImmunomodulationAstrocyte Marker ExpressionHigh Throughput Protocol
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