Method Article

L’appareil d’annulation du sommeil: une méthode très efficace pour priver la drosophile du sommeil

DOI:

10.3791/62105

⸱

December 14th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La privation de sommeil est un outil puissant pour étudier la fonction et la régulation du sommeil. Nous décrivons un protocole pour priver la drosophile du sommeil à l’aide de l’appareil d’annulation du sommeil, et pour déterminer l’étendue du sommeil de rebond induit par la privation.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’homéostasie du sommeil, l’augmentation du sommeil observée après la perte de sommeil, est l’un des critères déterminants utilisés pour identifier le sommeil dans tout le règne animal. En conséquence, la privation de sommeil et la restriction du sommeil sont des outils puissants qui sont couramment utilisés pour fournir un aperçu de la fonction du sommeil. Néanmoins, les expériences de privation de sommeil sont intrinsèquement problématiques en ce que le stimulus de privation lui-même peut être la cause de changements observés dans la physiologie et le comportement. En conséquence, les techniques de privation de sommeil réussies devraient garder les animaux éveillés et, idéalement, entraîner un rebond du sommeil robuste sans induire également un grand nombre de conséquences imprévues. Ici, nous décrivons une technique de privation de sommeil pour Drosophila melanogaster. L’appareil d’annulation du sommeil (SNAP) administre un stimulus toutes les 10 s pour induire une géotaxie négative. Bien que le stimulus soit prévisible, le SNAP empêche efficacement >95% du sommeil nocturne, même chez les mouches avec un taux de sommeil élevé. Il est important de savoir si la réponse homéostatique ultérieure est très similaire à celle obtenue en utilisant la privation de la main. Le moment et l’espacement des stimuli peuvent être modifiés pour minimiser la perte de sommeil et ainsi examiner les effets non spécifiques du stimulus sur la physiologie et le comportement. Le SNAP peut également être utilisé pour restreindre le sommeil et pour évaluer les seuils d’excitation. Le SNAP est une puissante technique de perturbation du sommeil qui peut être utilisée pour mieux comprendre la fonction du sommeil.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le sommeil est presque universel chez les animaux, mais sa fonction reste incertaine. L’homéostasie du sommeil, l’augmentation compensatoire du sommeil après la privation de sommeil, est une propriété déterminante du sommeil, qui a été utilisée pour caractériser les états de sommeil chez un certain nombred’animaux1,2,3,4,5.

Le sommeil à la mouche présente de nombreuses similitudes avec le sommeil humain, y compris une réponse homéostatique robuste à la perte de sommeil4,5. De nombreuses études sur le sommeil à la mouche ont utilisé la privation de sommeil à la fois pour déduire la fonction du sommeil en examinant les conséquences néfastes qui découlent d’un réveil prolongé et pour comprendre la régulation du sommeil en déterminant les mécanismes neurobiologiques contrôlant la régulation homéostatique du sommeil. Ainsi, il a été démontré que les mouches privées de sommeil présentaient des déficiences d’apprentissage et de mémoire6,7,8,9,10, 11,12, plasticité structurelle13,14,15, attention visuelle16, récupération après une lésion neuronale17,18, accouplement et comportements agressifs19, 20, prolifération cellulaire21, et réponses au stress oxydatif22,23 pour n’en nommer que quelques-uns. En outre, les recherches sur les mécanismes neurobiologiques contrôlant le sommeil de rebond ont fourni des informations critiques sur la machinerie neuronale qui constitue l’homéostat du sommeil8,9,23,24,25,26,27,28,29 . Enfin, en plus de révéler des informations fondamentales sur la fonction du sommeil chez les animaux en bonne santé, les études sur la privation de sommeil ont également éclairé les informations sur la fonction du sommeil dans les états malades30,31.

Bien que la privation de sommeil soit indéniablement un outil puissant, avec toute expérience de privation de sommeil, il est important de distinguer les phénotypes qui résultent d’un éveil prolongé, de ceux induits par le stimulus utilisé pour garder l’animal éveillé. La privation de sommeil par privation de main ou manipulation douce est généralement considérée comme établissant la norme pour la privation de sommeil peu perturbatrice. Nous décrivons ici un protocole pour priver les mouches de sommeil à l’aide de l’appareil SNAP (Sleep Nullifying Apparatus). Le SNAP est un dispositif qui délivre un stimulus mécanique aux mouches toutes les 10s, gardant les mouches éveillées en induisant une géotaxie négative (Figure 1). Le SNAP prive efficacement les mouches de >98% du sommeil nocturne, même chez les mouches avec un taux de sommeil élevé8,32. Le SNAP a été calibré sur les mouches sensibles aux chocs, l’agitation des mouches dans le SNAP ne nuit pas aux mouches; la privation de sommeil avec le SNAP induit un rebond comparable à celui obtenu par privation de main7. Le SNAP est donc une méthode robuste pour priver les mouches du sommeil tout en contrôlant les effets du stimulus d’excitation.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation expérimentale

  1. Recueillez les mouches lorsqu’elles s’épuisent dans des flacons, séparant les mouches mâles et femelles.
    REMARQUE: Les expériences de sommeil sont généralement menées avec des mouches femelles. Il est important de collecter des femelles vierges. Les femelles accouplées pondent des œufs qui éclosent en larves, ce qui complique l’analyse des données.
  2. Mouches domestiques d’un seul sexe en groupes de <20.
    REMARQUE: Les mouches du logement dans un environnement socialement enrichi (groupes de >50) modulent le lecteur de sommeil6,13 mesures potentiellement confondantes du sommeil de rebond. De plus, suite à l’enrichissement social, le sommeil diminuera en quelques jours6. Ainsi, le sommeil de base n’est pas stable, ce qui complique l’analyse du sommeil de rebond. Garder les mouches dans des groupes de <20 évite cette confusion potentielle.
  3. Gardez les mouches dans des flacons pendant 3 à 5 jours dans un environnement contrôlé par la lumière et l’humidité.
    REMARQUE: L’âge et la maturité des mouches influencent fortement le sommeil. Le sommeil est élevé chez les mouches d’un jour et se stabilise à l’âge de 3-5 jours de4ans. Les mouches sont généralement maintenues sur une lumière de 12 h: 12 h d’obscurité à 50% d’humidité.

2. Préparation des tubes pour l’enregistrement du sommeil

REMARQUE: Le sommeil est surveillé à l’aide de moniteurs d’activité locomotrice. Un moniteur peut contenir 32 mouches logées individuellement dans des tubes de 5 mm de diamètre. En règle générale, les génotypes sont analysés en groupes de 16 ou 32 mouches.

  1. Préparez un nombre approprié de tubes avec de la nourriture pour mouches à une extrémité.
    REMARQUE: L’alimentation et le métabolisme sont connus pour influencer le sommeil33,34, il est donc particulièrement important de placer les mouches sur le même aliment sur lequel elles ont été élevées.
  2. Scellez l’extrémité des tubes avec de la cire.
    REMARQUE: La privation de sommeil et le rebond sont une expérience de cinq jours, et les aliments peuvent se dessécher s’ils ne sont pas correctement scellés. Dans des tubes correctement scellés, les aliments peuvent être conservés pendant 10 jours ou plus. Ainsi, il est essentiel de s’assurer que les extrémités des tubes sont bien scellées. Cependant, les mouches peuvent également rester coincées dans les aliments humides. Ainsi, il est utile de fabriquer des tubes 1 à 2 jours avant le début de l’expérience.
  3. Placez individuellement le sillage, le comportement vole dans des tubes de verre de 65 mm de long pour l’enregistrement du sommeil à l’aide d’un aspirateur et branchez l’extrémité des tubes avec un bouchon en mousse.
    REMARQUE: Les mouches ne sont jamais réexposées à l’anesthésie au CO2 lorsqu’elles placent des mouches dans des tubes pour l’enregistrement du sommeil. L’aspirateur est fabriqué à partir de tubes en caoutchouc avec une extrémité recouverte d’étamine et insérée dans une pointe de pipette de 1 mL.

3. Enregistrement du sommeil

  1. La charge vole dans des tubes dans des moniteurs d’activité pour surveiller le sommeil.
    REMARQUE: Les roches SNAP surveillent les allers-retours de -60 ° à + 60 ° toutes les ~ 10 s. Les moniteurs sont maintenus à -60° pendant ~5,9s ; il faut ~2,9 s pour que le plateau contenant les moniteurs passe de -60° à +60° et ~1 s pour revenir de +60° à -60°. La longueur du cycle peut être modifiée au besoin en ajustant la tension fournie au moteur.
    1. Veillez à ce que les tubes soient placés dans les moniteurs d’activité dans la bonne orientation. Dans la bonne orientation, l’extrémité du tube avec de la nourriture est en haut du SNAP pour s’assurer que les mouches ne sont pas poussées dans la nourriture. De plus, l’extrémité avec de la nourriture se trouve sur le côté du moniteur avec la prise d’enregistrement du sommeil. Cela permet aux moniteurs d’activité d’être orientés correctement dans le SNAP pour une privation de sommeil efficace tout en surveillant simultanément l’activité.
  2. Placez des moniteurs d’activité dans la chambre d’enregistrement pour surveiller le sommeil.
  3. Surveillez le sommeil pendant au moins deux jours complets pour estimer le sommeil de base.
    REMARQUE: Les mouches de jour sont chargées dans des moniteurs d’activité est généralement exclu comme un jour d’adaptation pour permettre aux mouches de s’adapter à être logées dans des tubes. Le sommeil de base est enregistré pendant au moins deux jours complets (48 heures) à partir du matin suivant le jour où les mouches sont chargées.
  4. Enregistrez le nombre d’activités locomotrices des mouches dans des bacs de 1 min entre l’heure des lumières d’un jour donné et les lumières de la veille à l’aide d’un logiciel d’enregistrement d’activité (par exemple, de 8 h à 8 h).
  5. Estimer le sommeil à partir des données d’activité locomotrice avec des macros personnalisées en utilisant 5 min d’inactivité comme seuil pour un épisode de sommeil35.
    REMARQUE: Un certain nombre de mesures du sommeil sont calculées à partir du nombre d’activités locomotrices. Ceux-ci incluent le sommeil en min/h sur 24 h, le temps de sommeil total en 24 h, la durée moyenne et maximale des périodes de sommeil diurne et nocturne36.

4. Privation de sommeil et récupération

  1. Comme les mouches peuvent être privées de sommeil pendant des durées variables (par exemple, 12 h, 24 h et 36 h) et que le sommeil de récupération peut également être évalué à divers intervalles (par exemple, 6 h, 12 h, 24 h et 48 h), déterminer la durée de récupération en fonction des besoins expérimentaux. La récupération du sommeil peut être visualisée à l’aide d’un graphique de gain ou de perte de sommeil ou en examinant le pourcentage de sommeil récupéré sur un intervalle prédéterminé (par exemple, 6 h).
  2. Si le sommeil est stable au cours des deux jours de base, le troisième jour, placez des moniteurs d’activité dans le SNAP pour la privation de sommeil pendant la nuit.
    REMARQUE: Les mouches présenteront un rebond de sommeil robuste sur une plage de temps de sommeil8,32,37,38, mais le sommeil doit être stable pour évaluer de manière fiable le sommeil de rebond. Le sommeil est stable lorsque la différence de sommeil entre les jours de base est de ± 100 min.
  3. Assurez-vous que les moniteurs d’activité sont fixés en place avec des broches de support de moniteur, des cordons de moniteur branchés et des moniteurs orientés correctement avec l’extrémité avec de la nourriture à l’arrière et des barrières en plastique à l’avant (Figure 1).
    REMARQUE: Le SNAP est conçu de manière à ce que la came tourne une fois toutes les 10 s (Figure 1). L’insert en plastique réinitialise les tubes en repoussant les tubes lorsque l’appareil est en position « haut ». La réinitialisation des tubes est importante pour s’assurer que tous les tubes ont toute l’amplitude de mouvement au début de chaque cycle.
  4. Débranchez les moniteurs d’activité et retirez les moniteurs du SNAP immédiatement après que les lumières s’allument après une privation de sommeil pendant la nuit.
    REMARQUE: Il est essentiel que la privation de sommeil soit terminée et que les mouches soient mises en convalescence immédiatement après 12 heures de privation de sommeil pendant la nuit. Même un retard de 20 à 30 minutes dans la mise en place des mouches dans la récupération peut interférer avec l’étendue du sommeil de rebond.
  5. Placez les mouches dans une chambre d’enregistrement où elles ne seront pas dérangées pendant deux jours (48 h) pour surveiller le sommeil de récupération.
    REMARQUE: Si la chambre d’enregistrement est utilisée pour d’autres expériences, des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter de stimuler les mouches en convalescence.
  6. Calculez la quantité de sommeil perdue. Pour chaque mouche individuelle, calculer la différence horaire entre le sommeil obtenu pendant la privation de sommeil et l’heure correspondante pendant la ligne de base; additionner les différences horaires pour calculer le sommeil total perdu.
  7. Calculez la quantité de sommeil récupérée. Pour chaque mouche individuelle, calculer la différence horaire entre le sommeil obtenu pendant la récupération et l’heure correspondante pendant la ligne de base; additionner les différences horaires pour calculer le sommeil total gagné.
    REMARQUE: La question de savoir si une mouche est réellement privée de sommeil est empirique. Ainsi, l’expérimentateur devrait examiner le pourcentage de sommeil perdu. Si la mouche n’a pas perdu une quantité suffisante de sommeil, elle peut être exclue de l’analyse. Bien que cela puisse être nécessaire pour d’autres approches de privation de sommeil, c’est rarement, voire jamais, requis pour le SNAP. Plus fréquemment, le sommeil peut ne pas être stable chez une mouche donnée avant le début de la privation de sommeil. Si le sommeil n’est pas stable, l’homéostasie ne peut pas être calculée. Nous acceptons une différence maximale de ± 100 min de sommeil calculée avant le début de la privation de sommeil comme candidats à l’inclusion. À l’occasion, le sommeil d’une mouche individuelle est réparti de manière inégale sur la journée de 24 heures (par exemple, certaines personnes peuvent obtenir 60 à 70% de leur quota de sommeil pendant la journée et ne perdre ainsi qu’une petite proportion de leur quota de sommeil de 24 heures lorsqu’elles sont privées pendant 12 heures la nuit). Ces mouches peuvent être évaluées séparément.
  8. Calculer le pourcentage moyen de sommeil récupéré (par rapport à la ligne de base) sur 12 h, 24 h et 48 h de la période de récupération pour chaque génotype.
  9. À partir des données sur le sommeil, calculez la durée moyenne et maximale de la durée diurne du sommeil au départ et les jours de récupération pour chaque génotype.
    REMARQUE: Le sommeil de rebond chez les mouches se caractérise par une augmentation de la quantité de sommeil et une augmentation de la profondeur du sommeil dans les jours de récupération. La consolidation du sommeil est utilisée comme mesure de la profondeur du sommeil. Les seuils d’excitation pourraient également être utilisés comme mesure de la profondeur du sommeil.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canton S (Cs) a été utilisé comme une souche de type sauvage. Les mouches ont été maintenues sur un horaire de 12 h de lumière: 12 h d’obscurité et le sommeil a été privé pendant 12 heures pendant la nuit. L’inspection des profils de sommeil des mouches Cs le jour de référence (bs), le jour de privation de sommeil (sd) et deux jours de récupération (rec1 et rec2)(Figure 2A)suggère que les mouches ont été effectivement privées de sommeil dans le SNAP et ont ré...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le sommeil chez la drosophile a été caractérisé indépendamment en 2000, par deux groupes4,5. Dans ces études pionnières, les mouches ont été privées de sommeil par une manipulation douce (c’est-à-dire une privation de main) et il a été démontré qu’elles présentaient une réponse homéostatique robuste à la privation de sommeil pendant la nuit. Il est important de savoir si toute expérience de privation de sommeil permet de contrôler les effets confusionux ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les subventions NIH 5R01NS051305-14 et 5R01NS076980-08 à PJS.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubes d’activité locomotrice
Fisher Tissue Prep WaxThermo Fisher13404-122Cire utilisée pour sceller les tubes
Tubes en verreWale Apparatus244050We cut 5mm de diamètre Pyrex glass  ; tubes en tubes de 65 mm de long  ; pour enregistrer le sommeil. Tubes prédécoupés  ; peut également être acheté.
Nutri Fly Bloomington Formulation nourriture pour mouchesGenesee Scientific66-113Labs pourrait utiliser sa propre recette de nourriture pour mouches. Il est important que le sommeil soit enregistré sur la même nourriture que celle dans laquelle les mouches ont été élevées.
Outil de découpe rotatif du verreDremel Multi Pro395Utilisé pour couper des tubes de verre de 65 mm de long.
Monitoring Sleep
DAM et logiciel DAMFileScanTrikineticsLogiciel utilisé pour acquérir des données à partir de moniteurs DAM et enregistrer les données acquises dans un format approprié
Ordinateur d’acquisition de donnéesLenovoIdea Centre AIO3Un ordinateur équivalent de n’importe quel fabricant peut remplacer
les moniteurs d’activité de la drosophileTrikineticsDAM2Ces moniteurs sont utilisés pour enregistrer l’activité locomotrice des mouches
Moniteur d’environnementTrikineticsDEnMPas essentiel, mais un moyen facile de surveiller les conditions environnementales dans la chambre où le sommeil est enregistré
Contrôleur de lumièreTrikineticsLC4Un moyen pratique de contrôler le moment où le SNAP est allumé et éteint
Unité d’interface d’alimentation pour DAMTrikineticsPSIU-9Requis pour que les ordinateurs d’acquisition de données enregistrent les données d’activité locomotrice Trikinetics
Connecteur RJ117001-64PCLesmoniteurs DAM multicomp acceptent les prises RJ11
RépartiteursTrikineticsSPLT5Utilisé pour connecter jusqu’à 5 moniteurs DAM
Câble téléphonique Câble téléphoniqueRadioshack278-367Câbles téléphoniques pour acquérir des données à partir de moniteurs
DAMAlimentation Sleep Deprivation
Gw INSTEKGPS-30300Alimentation pour l’appareil d’annulation du
sommeilAtelier d’usinage de la faculté de médecine de l’Université
Système SNAP de Washington

References

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