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Article de méthode

Un modèle de rat d’infection cérébrale EcoHIV

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DOI :

10.3791/62137

⸱

21 janvier 2021

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à établir un nouveau modèle d’infection active par le VIH chez les rats à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV), qui est essentiel pour améliorer notre compréhension des réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau et offrir un système pour étudier les troubles neurocognitifs associés au VIH et les comorbidités associées (c.-à-d. l’abus de drogues).

Résumé

Il a été bien étudié que le modèle murin infecté par EcoHIV est d’une grande utilité dans l’étude des complications neurologiques associées au VIH. L’établissement du modèle de rat infecté par le VIH ecoHIV pour les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs serait bénéfique dans l’étude des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 et au VIH-1 . Dans la présente étude, nous démontrons la création réussie d’un modèle de rat d’infection active par le VIH à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV). Tout d’abord, la construction lentivirale d’EcoHIV a été emballée dans des cellules cultivées de 293 FT pendant 48 heures. Ensuite, le milieu conditionnel a été concentré et titré. Ensuite, nous avons effectué des injections stéréotaxiques bilatérales de l’EcoHIV-EGFP dans le tissu cérébral du rat F344/N. Une semaine après l’infection, des signaux de fluorescence EGFP ont été détectés dans le tissu cérébral infecté, indiquant que EcoHIV induit avec succès une infection active par le VIH chez les rats. En outre, immunostaining pour le marqueur microglial de cellules, Iba1, a été exécuté. Les résultats ont indiqué que la microglie était le type prédominant de cellules hébergeant EcoHIV. En outre, les rats d’EcoHIV ont montré des changements du traitement temporel, un mécanisme neurobehavioral fondamental potentiel de main aussi bien que le dysfonctionnement synaptique huit semaines après infection. Collectivement, la présente étude étend le modèle EcoHIV de l’infection par le VIH-1 au rat offrant un système biologique précieux pour étudier les réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau ainsi que la MAIN et les comorbidités associées telles que l’abus de drogues.

Introduction

Les systèmes biologiques ont amélioré notre compréhension des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 (HAND) et de leurs mécanismes neuronaux sous-jacents2. La détermination du système biologique le plus approprié pour une étude donnée dépend souvent de la question d’intérêt2. La limitation de la gamme de modèles animaux hôtes remet en question les études sur le développement de la maladie du VIH-1. Pour étudier la réplication virale et la pathogenèse du VIH-1, Potash et coll.3 ont créé un modèle murin d’infection active par le VIH-1, remplaçant la région codante de la glycoprotéine de l’enveloppe de surface du VIH, gp120, par la MLV gp80 écotrope, ce qui a conduit à une réplication virale réussie chez la souris4. Après des injections dans les veines de la queue chez des souris chimériques séropositives (EcoHIV), de nombreuses caractéristiques ressemblant à celles des personnes séropositives du VIH-1 (p. ex. lymphocytes et macrophages infectés, ciblés pour les réponses immunitaires antivirales, et inflammation3,5,6).

Bien que les souris et les rats soient tous deux membres des Muridés, les différences fondamentales entre les espèces peuvent influencer leur aptitude à répondre à des questions expérimentales spécifiques7. Par conséquent, l’extension du modèle d’infection EcoHIV aux rats (couramment utilisé dans les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs) serait avantageuse dans l’étude du neuroHIV. Par exemple, leur plus grande taille rend l’implantation de cathéter jugulaire pour les procédures d’auto-administration de médicaments plus pratique8. Des techniques d’auto-administration de médicaments chez le rat ont été utilisées pour évaluer la motivation dans le VIH-19. En outre, de nombreuses tâches neurocognitives / comportementales ont été initialement conçues pour les rats10. Ici, nous rapportons l’utilisation des injections stereotaxic d’EcoHIV chez les rats pour prolonger le modèle d’infection d’EcoHIV et offrir une occasion clé d’adresser de nouvelles questions liées à neuroHIV et à HAND.

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Protocole

Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de la Caroline du Sud (numéro d’assurance fédéral : D16-00028). Six rats F344/N mâles adultes ont été logés dans un environnement contrôlé sous un cycle 12/12 clair: sombre avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Tous les animaux ont été pris en charge en utilisant les lignes directrices établies par les National Institutes of Health dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Emballage du virus dans 293 cellules FT

  1. Culture des 293 cellules FT (5×105/mL)dans des flacons enrobés de gélatine de 75 cm2 avec du DMEM plus 10% FBS11. Cultiver les cellules à 37 °C pour être 50 % confluentes à la transfection.
  2. Diluer 22,5 μL de réactif de transfection (p. ex. lipofectamine 3000) dans 750 μL de milieu (p. ex. Opti-MEM) dans un tube de micro-centrifugeuse et un vortex de 1,5 mL pendant 3 s.
  3. Diluer 20 μg d’ADN plasmidique EcoHIV dans 750 μL de milieu dans un tube micro-centrifugeuse de 1,5 mL et bien mélanger.
  4. Ajouter l’ADN dilué dans le tube du réactif de transfection dilué et mélanger doucement. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
  5. Ajouter le mélange à 10 mL de milieu DMEM prémulé dans une fiole de 75 cm2. Incuber les cellules pendant 2 jours à 37 °C.
  6. Récolter et combiner 24 mL de milieu conditionnel à partir des deux fioles qui comprennent le lentivirus emballé.
  7. Centrifuger tout 24 mL de milieu conditionnel à 500 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Transférer le surnageant clarifié dans un tube stérile de 50 mL.
  8. Combiner 8 mL de concentrateur Lenti-x avec 24 mL de surnageant clarifié (rapport 1:3). Mélanger par inversion douce. Incuber le mélange à 4 °C pendant deux jours.
  9. Mélange centrifuge à 1 500 x g pendant 45 minutes à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant.
  10. Suspendre doucement la pastille avec 100 μL de PBS de 100 mM.
  11. Concentration de virus de titre avec un kit ELISA p24.

2. Chirurgies stéréotaxiques du virus EcoHIV-EGFP

  1. Anesthésier les rats à l’aide de 3% de sévoflurane. Passez à l’étape 2.2 lorsque les rats ne réagissent pas aux stimuli nocifs et que les réflexes sont absents.
  2. Rasez les poils de la région du cerveau et stérilisez la peau deux fois avec de l’éthanol à 70% et un gommage à base de chlorhexidine. Fixez le rat en position couchée dans l’appareil stéréotaxique.
  3. Faites une incision (5-6 cm) à travers la peau le long de la ligne médiane du cuir chevelu.
  4. Marquer deux positions de forage à 0,8 mm latérale, 1,2 mm rostral à bregma. Percez un trou (diamètre 0,4 mm) dans chaque position du crâne.
  5. Remplissez la solution de lentivirus EcoHIV titré (1,04 × 106 TU/mL) dans une seringue d’injection de 10 μL. Fixez la seringue à l’appareil stéréotaxique.
  6. Descendez l’aiguille près de la surface du trou de forage. Mesurer et déplacer 2,5 mm de profondeur.
  7. Infuser 1 μL de solution virale à raison de 0,2 μL/min. Gardez l’aiguille à l’intérieur de la zone d’injection pendant 5 min. Déplacez lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit à l’extérieur du crâne du rat.
  8. Suturer la peau avec un fil de soie 4-0.
  9. Stérilisez l’incision avec de l’éthanol à 70% une fois. Injecter par voie sous-cutanée du butorphénol (Dorolex, 0,1 mg/kg de poids corporel).
  10. Transférer le rat dans une chambre de récupération avec un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il se réveille.

3. Visualisation des sections du cerveau

REMARQUE: Attendez une à huit semaines après la perfusion virale EcoHIV.

  1. Anesthésier le rat avec 5% de sévoflurane. Passez à l’étape 3.2 lorsque les rats ne réagissent pas aux stimuli nocifs et que les réflexes sont absents.
  2. Fixez le rat en décubitus dorsal à l’intérieur d’une hotte.
  3. Inciser la peau le long de la ligne médiane thoracique. Coupez le diaphragme et ouvrez la cavité thoracique.
  4. Insérez une aiguille de 20 G × de 25 mm dans le ventricule gauche.
  5. Ouvrez immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux.
  6. Perfuser 50 mL de PBS prechilled de 100 mM à raison de 5 mL/min.
  7. Perfuser 100 mL de paraformaldéhyde froid à 4 % à raison de 5 mL/min.
  8. Décapiter le rat, ouvrir le cuir chevelu et enlever le cerveau.
  9. Postfix pendant la nuit avec 4% de paraformaldéhyde.
  10. Transférer le cerveau à 40 mL de saccharose à 30% dans du PBS de 100 mM dans un tube de 50 mL jusqu’à ce que le cerveau flotte vers le bas (environ 3 jours).
  11. Snap congeler le cerveau dans le méthylbutanol pendant 2 min à - 80 °C.
  12. Fixez le tissu cérébral sur une plate-forme métallique à l’intérieur d’un cryostat à -20 °C.
  13. Couper des sections coronales de 50 μm d’épaisseur à l’aide du cryostat.
  14. Transférer les tranches de cerveau sur des lames de verre avec une brosse fine.
  15. Monter des sections dans 0,3 mL de milieu d’étouffement et couvrir avec des lamures de 22 mm 50 mm.
  16. Gardez les lames de verre dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit sec.
  17. Imagez les neurones ciblés avec un microscope confocal à l’aide de Z-stack basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones.
    NOTA : Les réglages du microscope confocal utilisés étaient les suivants : grossissement de 60 X (A/1,4, huile) et intervalle du plan Z de 0,15 μm (taille du trou d’épingle de 30 μm; rayon de trou d’épingle rétro-projeté de 167 nm) en utilisant une longueur d’onde de 488 nm.

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Résultats

Le milieu conditionné a été recueilli à partir du lentivirus des cellules 293FT infectées par EcoHIV-EGFP. Ensuite, il a été concentré et titré, puis injecté stéréotaxiquement dans le cerveau (région corticale) des rats F344/N. Sept jours après l’injection, des rats ont été sacrifiés et des images ont été prises des tranches coronales de cerveau s’étendant du bregma 5.64 millimètres au bregma -4.68 millimètres. Sur la figure 1A,il existe des signaux EcoHIV-EGFP significatifs dans tout le cer...

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Discussion

Dans ce protocole, nous avons établi un modèle d’infection par le VIH induite par EcoHIV chez les rats. Plus précisément, nous avons décrit une injection stéréotaxique bilatérale d’EcoHIV dans le cortex qui a réussi à instituer l’infection active par le VIH dans le cerveau de rat 7 jours après l’injection. De plus, nous démontrons que l’infection à EcoHIV chez le rat pourrait être un bon système biologique pour étudier les aspects clés de la MAIN. Huit semaines après l’infection par le Virus eco-HIV, les rats présentaien...

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Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été financé par les subventions des NIH HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
293FT cellulesThermoFisher ScientificR70007
Solution antibiotique-antimycosiqueCellgro30004CI100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² ; Fiole rectangulaire de culture cellulaire à col incliné avec capuchon ventiléLife Technologies354488
Corning DMEM avec L-glutamine, 4,5 g/L de glucose et de pyruvate de sodium LifeTechnologies10013CV
Verre de couvertureVWR637-137
perceuse
Dumont #5 ForcepsWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 ForcepsWorld Precision Instruments14097
Microcentrifugeuse Eppendorf Snap-Cap Biopur Safe-Lock TubesLife Technologies22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibactérien, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27 po. FS-2Med Vet InternationalVCP422H
Seringue HamiltonHamilton1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Réactif de transfectionLife TechnologiesL3000015
Pince à irisWorld Precision Instruments15914
Ciseaux à irisWorld Precision Instruments500216
Kit ELISA p24 associé aux lentivirusCell Biolabs, inc.VPK-107-5
Concentrateur Lenti-XTakaraPT4421-2
Opti-MEM I Sérum Réduit TechnologiesMoyenne Durée de Vie11058021
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldéhydeSigmaP6148
ProLong GoldFisher ScientificP36930
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
appareil stéréotaxiqueKopf InstrumentsModèle 900
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154 %
Vannas ScissorsWorld Precision Instruments500086
de

Références

  1. Illenberger, J. M., et al. HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).
  2. Joseph, S. B., Swanstrom, R. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).
  3. Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
  4. Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell. 57, 659-666 (1989).
  5. Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).
  6. Gu, C. J., et al. EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment. PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).
  7. Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).
  8. Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).
  9. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).
  10. McGaughy, J., Sarter, M. Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).
  11. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).
  12. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).
  13. McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).
  14. Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).
  15. Ko, A., et al. Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).
  16. Sopper, S., et al. The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey. Virology. 220 (2), 320-329 (1996).
  17. Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency. Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).

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