ROS Imagerie des cellules vivantes au cours du développement neuronal

Aslihan Terzi; S. M. Sabbir Alam; Daniel M. Suter

doi:10.3791/62165

Article de méthode

ROS Imagerie des cellules vivantes au cours du développement neuronal

DOI :

10.3791/62165

⸱

9 février 2021

Aslihan Terzi¹^,² , S. M. Sabbir Alam¹^,² , Daniel M. Suter¹^,²^,³

¹Department of Biological Sciences, Purdue University, ²Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, ³Bindley Bioscience Center, Purdue University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit l’utilisation d’un peroxyde d’hydrogène génétiquement codé (H2O2)-biocapteur dans les neurones et les larves de poisson zèbre cultivés pour évaluer les rôles physiologiques de signalisation de_H2O2pendant le développement du système nerveux. Il peut être appliqué à différents types de cellules et modifié avec des traitements expérimentaux pour étudier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans le développement général.

Résumé

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Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules de signalisation bien établies, qui sont importantes dans le développement normal, l’homéostasie, et la physiologie. Parmi les différents ROS,le peroxyde d’hydrogène (H2O2) est le mieux caractérisé en ce qui concerne les rôles dans la signalisation cellulaire. _H2_{O2 a} été impliqué lors du développement chez plusieurs espèces. Par exemple, une augmentation transitoire de_H2_O2 a été détectée chez les embryons de poissons zèbres au cours des premiers jours suivant la fécondation. En outre, l’épuisement d’une source cellulaire importante H_2O2, NADPH oxydase (NOX), altère le développement du système nerveux tel que la différenciation, la croissance axonale, et le guidage des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGCs) in vivo et in vitro. Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie des niveaux intracellulaires de_H2O2 dans les neurones de poissons zèbres cultivés et les larves entières pendant le développement en utilisant le biocapteur génétiquement codé_{H2 O2}spécifique, roGFP2-Orp1. Cette sonde peut être exprimée de manière transitoire ou stable chez les larves de poissons zèbres. En outre, la lecture ratiométrique diminue la probabilité de détecter des artefacts en raison de l’expression génique différentielle ou des effets de volume. Tout d’abord, nous démontrons comment isoler et mettre en culture des GRC dérivés d’embryons de poissons zèbres qui expriment transitoirement roGFP2-Orp1. Ensuite, nous utilisons des larves entières pour surveiller les niveaux_{de H2O2}au niveau des tissus. Le capteur a été validé par l’ajout de_H2_O2. De plus, cette méthodologie pourrait être utilisée pour mesurer les niveaux_{de H2O2}dans des types de cellules et des tissus spécifiques en générant des animaux transgéniques avec une expression de biocapteur spécifique aux tissus. Comme les poissons zèbres facilitent les manipulations génétiques et développementales, l’approche démontrée ici pourrait servir de pipeline pour tester le rôle de_H2_O2 au cours du développement neuronal et embryonnaire général chez les vertébrés.

Introduction

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La signalisation réactive des espèces de l’oxygène (ROS) régule le développement et le fonctionnement du système nerveux¹. Une source importante de ROS cellulaires sont les oxydases NADPH (NOX), quisont des protéines transmembranaires générant du superoxyde et du peroxyde d’hydrogène (H2O2)2. Les enzymes NOX se trouvent dans tout le système nerveux central (SNC), et les ROS dérivés du NOX contribuent au développement neuronal^3,^4,^5,^6. Il a été démontré que le maintien et la....

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux ont été examinées et approuvées sur le plan éthique par le Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), conformément aux directives des NIH avec le protocole 2006002050 approuvé le 24/07/2020.

1. Préparation des solutions

Support E2 (1x)
1. Préparer des solutions 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) et 500x E2C (100 mL) en combinant tous les composants indiqués dans le tableau 1. Solutions Autoclave E2A, E2B et E2C. Conserver à 4 °C.
2. Pour 1x support E2 : Combinez 5 mL de 100x E2A, 1 mL de 500x E2B et 1 mL de 500x E2C. Porter le volume à 500 mL avec de l’eau s....

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Résultats

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Les CRG de poissons zèbres d’élevage étendent les axones à l’intérieur de 1d. Une image représentative au rapport 405/480du biocapteur_H2O2est représentée sur la figure 4A. Le corps cellulaire, axone, et les cônes de croissance sont clairement visibles dans les neurones individuels. Ces neurones peuvent être soumis à différents traitements au fil du temps pour surveiller les changements_H2O2. Nous avons précédemment constaté que l’ajout de.......

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Discussion

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Il y a plusieurs étapes critiques qui nécessitent une attention particulière tout au long de ce protocole. Nous pensons que la prise en compte de ces points améliorera le flux expérimental. Pour la culture primaire de RGC, la stérilité du ZFCM(-) est très importante, car ce milieu de culture ne contient pas d’antibiotiques et la contamination peut survenir avant ou pendant l’imagerie. Pour l’éviter, nous vous conseillons de préparer et d’utiliser ZFCM(-) uniquement à l’intérieur d’une armoire de biosécurité et de faire r.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (Grant R01NS117701), la National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), l’Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), la Purdue Research Foundation (Grant 209911) et le Bureau du vice-président exécutif pour la recherche et les partenariats à l’Université Purdue (Subvention 210362). Nous remercions le Dr Cory J. Weaver et Haley Roeder d’avoir établi le protocole d’élevage du poisson zèbre RGC. Nous remercions également Haley Roeder d’avoir fourni les données de la figure 4. Nous remercions Leah Biasi et Kenny Nguyen pour leur aide à la culture RGC. Nous remercions Gentry....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue
Plat de culture de 35 mm	Sarstedt	83-3900
Plat à fond en verre de 35 mm	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Tubes capillaires en verre borosilicaté	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Chlorure de calcium dihydraté	Fisher Scientific	C79-500
Verre de couverture	Corning	2850-22
Boîtes de Pétri jetables (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Sérum de veau fœtal	ThermoFisher Scientific	26140087
Glucose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Moule d’injection	Outils de science adaptative	TU-1
Microscope inversé	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Microscopie confocale à balayage laser	Zeiss	710
Leibovitz’s L-15 Medium avec rouge de phénol	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz’s L-15 Medium sans rouge de phénol	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Agarose à bas point de fusion	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Pénicilline/streptomycine	ThermoFisher Scientific	15140122
Phénol Rouge	Sigma Aldich	P0290
Phénylthiourée (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatique PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poly-D-Lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK Kit de purification PCR	QIAGEN	28104
Souris recombinante slit2	R& D Systems	5444-SL-050
Pyruvate de sodium	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µ ; m filter	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Extracteur de pipette vertical	David Kopf Instruments	700C

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiolo....

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Mots-clés

Live Cell Imaging Reactive Oxygen Species Hydrogen Peroxide Biosensor Neuronal Development Zebrafish Embryos Retinal Ganglion Cells roGFP2 Orp1 Sensor Confocal Microscopy Axon Growth In Vivo Imaging

ROS Imagerie des cellules vivantes au cours du développement neuronal

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