Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

Summary

Cet article présente les étapes essentielles de immunoprecipitation d’immunostaining et de chromatine. Ces protocoles sont couramment utilisés pour étudier les processus cellulaires liés aux dommages à l’ADN et pour visualiser et quantifier le recrutement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN.

Abstract

Les cellules sont continuellement exposées à divers agents dommageables de l’ADN, induisant différentes réponses cellulaires. L’application d’approches biochimiques et génétiques est essentielle pour révéler les événements cellulaires associés au recrutement et à l’assemblage de complexes de réparation de l’ADN sur le site des dommages à l’ADN. Au cours des dernières années, plusieurs outils puissants ont été développés pour induire des dommages à l’ADN spécifiques au site. De plus, de nouvelles techniques séminales nous permettent d’étudier ces processus au niveau de résolution unicellulaire en utilisant à la fois des cellules fixes et vivantes. Bien que ces techniques aient été utilisées pour étudier divers processus biologiques, nous présentons ici les protocoles les plus largement utilisés dans le domaine de la réparation de l’ADN, de l’immunomarquage par fluorescence (IF) et de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), qui, en combinaison avec les dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase, permettent de visualiser et de quantifier l’occupation génomique des facteurs de réparation de l’ADN de manière dirigée et régulée, respectivement. Ces techniques fournissent aux chercheurs des outils puissants pour identifier de nouvelles protéines liées au locus génomique endommagé ainsi que leurs modifications post-traductionnelles nécessaires à leur régulation fine lors de la réparation de l’ADN.

Introduction

Notre génome est constamment mis à l’épreuve par divers agents nuisibles à l’ADN. Ces agressions peuvent provenir de sources environnementales, telles que la lumière UV ou l’irradiation, ainsi que de sources endogènes, telles que les sous-produits métaboliques causés par le stress oxydatif ou les erreurs de réplication^1,2. Ces lésions peuvent affecter l’intégrité d’un ou des deux brins d’ADN, et si les erreurs générées deviennent persistantes, cela conduit fréquemment à des translocations et à une instabilité du génome, ce qui peut entraîner une tumorigenèse^3,

Protocol

1. Immunodétection de protéines spécifiques

1. Préparation de la culture cellulaire et installation expérimentale
   1. Maintenez les cellules d’U2OS dans des monocouches dans le milieu de culture de DMEM complété avec du sérum foetal de veau de 10%, de la glutamine de 2 mM, et de la solution antibiotique-antimycotique de 1%.
      REMARQUE: Pour l’induction de dommages à l’ADN à base d’endonucléase, utilisez un milieu traité au charbon de bois ou sans stéroïdes pour éviter les fuites du système.
   2. Cultiver les cellules dans un environnement humidifié à 5% de_CO2 à 37 °C jusqu’à 80% de confluence, en renouvelant le milieu to....

Results

L’étude des processus causés par l’ORD dirigés vers le site dans les cellules peut être réalisée par l’intermédiaire de la transfection stable ou transitoire. Cependant, il convient de noter que la transfection stable assure une population cellulaire homogène, ce qui donne une réponse cellulaire unifiée et donc plus fiable. Dans le cas d’une transfection transitoire, seule une petite proportion de la population cellulaire occupe et maintient le plasmide, ce qui introduit de la diversité dans l’expérience. L’établissement.......

Discussion

Bien que la réparation de l’ADN soit un domaine de recherche relativement récent, nos connaissances s’étendent rapidement à l’aide de diverses méthodes biochimiques et microscopiques. La préservation de l’information génétique est cruciale pour les cellules puisque les mutations survenant dans les gènes impliqués dans les processus de réparation sont parmi les principales causes de la tumorigenèse et, par conséquent, il est essentiel d’élucider les étapes clés des voies de réparation de l’ADN.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarose	Lonza	50004
Solution antibiotique-antimycosique (100&fois ;), stabilisé	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gamma H2A. Anticorps X (phospho S139)	Abcam	ab26350
Sérum bovin Fraction V albumine	Biosera	PM-T1725
TrackIt&trade ; Tampon de charge cyan/jaune	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM avec 1,0 g/L de glucose, sans L-glutamine	Lonza	12-707F
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads&trade ; M-280 mouton anti-souris IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads&trade ; M-280 Mouton Anti-Lapin IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Éthanol	Molaire Produits chimiques	02910-101-340
Sérum de veau fœtal (origine Amérique du Sud), approuvé par l’UE	Gibco	ECS0180L
Solution de formaldéhyde à 37 % sans acide	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX&Commerce ; Supplément	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glycine	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Alcool isoamylique	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Néocarzinostatine de Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Poudre sans Ca2+, Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
Phénol	Sigma Aldrich	P4557
TUYAUX	Sigma Aldrich	P1851
Polysorbate 20 (Tween 20)	Molar Chemicals	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong&trade ; Gold Antifade Mountant avec DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I	Roche	11873580001
Proteinase K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs anticorps	Abcam	ab18192
RNase A	Roche	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris Acétate-EDTA tampon	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molar Chemicals	09370-006-340
Trypsine du pancréas porcin	Sigma Aldrich	T4799
Trypsine-EDTA (0,5 %), pas de rouge de phénol	Gibco	15400054