Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Summary

Ici, nous décrivons des protocoles utilisant des capteurs lipidiques fluorescents et des liposomes pour déterminer si une protéine extrait et transporte de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Abstract

Plusieurs membres de la famille des protéines liées à la protéine de liaison à l’oxystérol (OSBP) conservées de manière évolutionnaire (ORP) / homologues OSBP (Osh) ont récemment été trouvés pour représenter un nouveau groupe de protéines de transfert lipidique (LTP) dans les levures et les cellules humaines. Ils transfèrent la phosphatidylsérine (PS) du réticulum endoplasmique (RE) à la membrane plasmique (PM) via les cycles d’échange PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P). Cette découverte permet de mieux comprendre comment la PS, qui est essentielle pour les processus de signalisation, est distribuée dans toute la cellule et d’enquêter sur le lien entre ce processus et le métabolisme du phosphoinositide (PIP). Le développement de nouveaux protocoles basés sur la fluorescence a joué un rôle déterminant dans la découverte et la caractérisation de ce nouveau mécanisme cellulaire in vitro au niveau moléculaire. Cet article décrit la production et l’utilisation de deux capteurs lipidiques marqués par fluorescence, NBD-C2_Lact et NBD-PH_FAPP,pour mesurer la capacité d’une protéine à extraire PS ou PI(4)P et à transférer ces lipides entre membranes artificielles. Tout d’abord, le protocole décrit comment produire, étiqueter et obtenir des échantillons de haute pureté de ces deux constructions. Deuxièmement, cet article explique comment utiliser ces capteurs avec un lecteur de microplaques de fluorescence pour déterminer si une protéine peut extraire PS ou PI(4)P des liposomes, en utilisant Osh6p comme étude de cas. Enfin, ce protocole montre comment mesurer avec précision la cinétique de l’échange PS/PI(4)P entre liposomes de composition lipidique définie et déterminer les taux de transfert lipidique par transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) à l’aide d’un fluoromètre standard.

Introduction

La distribution précise des lipides entre différentes membranes et à l’intérieur des membranes des cellules eucaryotes^1,2 a de profondes implications biologiques. Décrypter le fonctionnement des LTP est une question importante en biologie cellulaire³,^4,5,6, et les approches in vitro sont d’une grande valeur pour aborder cette question^{7,8,9,10,....}

Protocol

1. Purification de NBD-C2_Lact

REMARQUE: Bien que ce protocole détaille l’utilisation d’un perturbateur cellulaire pour briser les bactéries, il peut être modifié pour utiliser d’autres stratégies de lyse(par exemple, une presse Français). Au début de la purification, il est obligatoire d’utiliser un tampon fraîchement dégazé, filtré et complété par 2 mM de dithiothréitol (DTT) pour éviter l’oxydation de la cystéine. Cependant, pour l’étape de marquage des protéines, il est crucial de supprimer complètement la TNT. De nombreuses étapes doivent être effectuées sur la glace ou dans une chambre froide pour éviter toute dégrada....

Results

Figure 1: Description des capteurs lipidiques fluorescents et des essais in vitro. (A) Modèles tridimensionnels de NBD-C2_Lact et NBD-PH_FAPP basés sur la structure cristalline du domaine C2 de la lactadhérine bovine (ID PDB: 3BN6⁴⁸) et la structure RMN du domaine PH de la protéine FAPP1 h.......

Discussion

Les résultats de ces tests reposent directement sur les signaux des capteurs lipidiques fluorescents. Ainsi, la purification de ces sondes marquées à un rapport de 1:1 avec NBD et sans contamination fluorophore NBD libre est une étape critique de ce protocole. Il est également obligatoire de vérifier si le LTP examiné est correctement plié et non agrégé. La quantité de LTP testée dans les essais d’extraction doit être égale ou supérieure à celle des molécules PS ou PI(4)P accessibles pour mesurer correctement si cette LT.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
; L-cystéine &ge ; 97 % (FG)  ;	Sigma	W326305-100G	Préparez une solution mère de L-cystéine de 10 mM dans l’eau. Les aliquotes sont stockées à -20 ° ; C
Flacon ambré de 2 mL, PTFE/Rub Lnr, pour le stockage des lipides dans CHCL3	Wheaton	W224681
billes de verre de 4 mm de diamètre	Sigma	Z265934-1EA
Tube à centrifuger conique de 50 mL	Falcon
Ä ; Purificateur KTA	GE healthcare		FPLC
			d’aluminium
Amicon Ultra-15 avec un MWCO de 3 et 10 kDa	Merck	UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 avec un MWCO de 3 et 10 kDa	Merck	UFC800324, UFC801024
Ampicilline			Préparez une solution mère de 50 mg/mL avec de l’eau filtrée et stérilisée et conservez-la à -20 & deg ;C.
Bestatin	Sigma	B8385-10mg
BL21 Or Cellules Compétentes	Agilent
C16:0 Liss  ; (Rhod-PE) dans CHCl3 (1 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P  ;   ;	Echelon Lipids	P-4016-3	Dissoudre 1 mg de poudre de C16:0/C16:0-PI(4)P en 250 & micro ; L de MeOH et 250 µ ; L de CHCl3. Complétez ensuite avec CHCl3 à 1 mL. La solution doit devenir claire.
C16:0/C18:1-PS (POPS) dans CHCl3 (10 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) dans CHCl3 (25 mg/mL)	Avanti Polar Lipids	850375C-500mg
CaCl2sp ;	Sigma		Préparez 10 mM de solution mère de CaCl2 dans de l’eau.
Disrupteur cellulaire	à dynamique
Chloroforme (CHCl3) RPE-ISO	Carlo Erba	438601
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTA	Roche	5056489001
Eau
Diméthylformamide (DMF), anhydre, pure
à >99 %DNAse I Recombinante, sans RNAse, en poudre	Roche	10104159001
DTT	Euromedex	EU0006-B	Préparer 1 M de solution mère de DTT dans de l’eau Milli-Q.  ; Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à -20 °C.
Colonnes de chromatographie Econo-Pac (1,5 & times ; 12 cm).	Cuvette	d’électroporation Biorad 7321010
2 mm	Ozyme	EP102
Électroporateur Eppendorf 2510	Eppendorf
Tubes Ti45 et Ti45	Beckman	Rotation des lysats
Seringues en verre (10, 25 et 50 & micro ; L) pour l’expérience de fluorescence	Hamilton
Seringues en verre (25, 100, 250, 500 et 1000 & micro ; L) pour manipuler les solutions mères lipidiques	Hamilton	1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathion Sepharose 4B billes	GE Healthcare	17-0756-05
Glycérol (pur à 99 %)	Sigma	G5516-500ML
Tubes d’hémolyse avec capuchon
HEPES , >99 % pur	Sigma	H3375-500G
Illustra Colonne de dessalage NAP 10	GE healthcare	GE17-0854-02
Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  ;	Euromedex	EU0008-B	Préparer une solution mère d’IPTG à 1 M dans Milli-Qwater. Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à -20 °C.
K-Acétate	Prolabo	26664.293
Lennox LB Bouillon moyen sans glucose			Préparé avec de l’eau milli-Q et autoclave.
Azote liquide	Linde
Methanol (MeOH) &ge ; 99,8 %	VWR	20847.24
MgCl2	Sigma		Préparez une solution de 2 M de MgCl2. Filtrer la solution à l’aide d’un 0,45 & micro ; m filtre.  ;
Microplaque 96 puits PS F-Botom Noir Non-Contraignant	Greiner Bio-one	655900
Mini-Extrudeuse avec deux seringues Hamilton étanches aux gaz de 1 mL	Avanti Polar Lipids	610023
Lecteur de plaques de fluorescence basé sur un monochromateur	TECAN	M1000 Pro
N,N'-Diméthyl-N-(Iodoacétyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)	Dissoudre		25 mg d’IANBD dans 2,5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et préparer 25 aliquotes de 100 µ ; L dans des tubes à bouchon à vis de 1,5 mL. Ne vissez pas complètement le capuchon. Ensuite, retirez le DMSO dans un lyophilisateur pour obtenir 1 mg d’IANBD sec par tube. Les tubes sont fermés et stockés à -20 ° ; C dans l’obscurité.   ;
NaCl	Sigma	S3014-1KG
PBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoclavé et stocké à 4 ° ;C.
Fioles en verre en forme de poire (25 mL, 14/23, verre Duran)			Duran
	Sigma	p5318-25mg
pGEX-C2LACT>plasmide			Disponible sur demande auprès de notre laboratoire
Plasmide			Disponible sur demande auprès de notre laboratoire
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) &ge ; 98,5 % (GC)	Sigma	P7626-25g	Préparer une solution mère de 200 mM de PMSF dans de l’isopropanol
Phosphoramidon	Sigma	R7385-10mg
Filtres en polycarbonate (19 mm de diamètre) avec une taille de pores de 0,2 & micro ; m	Avanti Polar Lipids	610006
Colonne de chromatographie Poly-Prep (avec un volume de lit de 0 à 2 ml et un réservoir de 10 ml)	Biorad	7311550
Préfiltres (10 mm de diamètre).	Avanti Polar Lipids	610014
PyMOL	http://pymol.org/		Construction des modèles 3D des protéines (Figure 1A)
Cuvette en quartz pour la fluorescence UV/visible (volume minimum de 600 µ ; L)	Hellma
Cuvettes en quartz	Hellma
Centrifugeuse réfrigérée  ; Eppendorf 5427R	Eppendorf
Évaporateur rotatif	Buchi	B-100
Tubes microcentriques à bouchon à vis (1,5 mL)	Sarsted
Petite barre d’agitation magnétique PFTE (5 × ; 2 mm)
Tubes microcentriques à pression (0,5, 1 et 2 mL)	Eppendorf
SYPRO orange			coloration fluorescente pour détecter les protéines dans le gel SDS-PAGE
Thermomixeur	Starlab
THROMBIN, À PARTIR DE PLASMA HUMAIN	Sigma	10602400001	Dissoudre 20 unités dans 1 mL d’eau milli-Q et préparer 25 µ ; L aliquotes dans des tubes Eppendorf de 0,5 ml. Ensuite, congelez et conservez à -80 °C.
Tris, ultra pure	MP	819623
Ultracentrifugeuse L90K	Beckman
Spectrophotomètre d’absorbance UV/visible	SAFAS
Spectrofluorimètre UV/visible avec support de cellule à température contrôlée et dispositif d’agitation	Jasco ou Shimadzu	Jasco FP-8300 ou Shimadzu RF-5301PC
Chambre à			vide
Bain-marie	Julabo
XK 16/70 colonne rempli de Sephacryl S200HR	GE healthcare