Method Article

Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

DOI:

10.3791/62177

⸱

March 14th, 2021

 ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Ici, nous décrivons des protocoles utilisant des capteurs lipidiques fluorescents et des liposomes pour déterminer si une protéine extrait et transporte de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Abstract

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Plusieurs membres de la famille des protéines liées à la protéine de liaison à l’oxystérol (OSBP) conservées de manière évolutionnaire (ORP) / homologues OSBP (Osh) ont récemment été trouvés pour représenter un nouveau groupe de protéines de transfert lipidique (LTP) dans les levures et les cellules humaines. Ils transfèrent la phosphatidylsérine (PS) du réticulum endoplasmique (RE) à la membrane plasmique (PM) via les cycles d’échange PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P). Cette découverte permet de mieux comprendre comment la PS, qui est essentielle pour les processus de signalisation, est distribuée dans toute la cellule et d’enquêter sur le lien entre ce processus et le métabolisme du phosphoinositide (PIP). Le développement de nouveaux protocoles basés sur la fluorescence a joué un rôle déterminant dans la découverte et la caractérisation de ce nouveau mécanisme cellulaire in vitro au niveau moléculaire. Cet article décrit la production et l’utilisation de deux capteurs lipidiques marqués par fluorescence, NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP,pour mesurer la capacité d’une protéine à extraire PS ou PI(4)P et à transférer ces lipides entre membranes artificielles. Tout d’abord, le protocole décrit comment produire, étiqueter et obtenir des échantillons de haute pureté de ces deux constructions. Deuxièmement, cet article explique comment utiliser ces capteurs avec un lecteur de microplaques de fluorescence pour déterminer si une protéine peut extraire PS ou PI(4)P des liposomes, en utilisant Osh6p comme étude de cas. Enfin, ce protocole montre comment mesurer avec précision la cinétique de l’échange PS/PI(4)P entre liposomes de composition lipidique définie et déterminer les taux de transfert lipidique par transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) à l’aide d’un fluoromètre standard.

Introduction

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La distribution précise des lipides entre différentes membranes et à l’intérieur des membranes des cellules eucaryotes1,2 a de profondes implications biologiques. Décrypter le fonctionnement des LTP est une question importante en biologie cellulaire3,4,5,6, et les approches in vitro sont d’une grande valeur pour aborder cette question7,8,9,10,11. Ici, une stratégie in vitrobasée sur la fluorescence est présentée qui a joué un rôle déterminant dans l’établissement que plusieurs protéines ORP/Osh affectent l’échange PS/PI(4)P entre les membranes cellulaires12 et constituent ainsi une nouvelle classe de LTP. PS est un glycérophospholipide anionique qui représente 2 à 10% des lipides membranaires totaux dans les cellules eucaryotes13,14,16. Il est distribué le long d’un gradient entre l’ER et le PM, où il représente 5-7% et jusqu’à 30% des glycérophospholipides, respectivement17,18,19. De plus, la PS est essentiellement concentrée dans la foliole cytosolique du PM. Cette accumulation et la partition inégale de PS dans le PM sont essentielles pour les processus de signalisation cellulaire19. En raison de la charge négative des molécules PS, la foliole cytosolique du PM est beaucoup plus anionique que la foliole cytosolique des autres organites1,2,19,20. Cela permet le recrutement, via des forces électrostatiques, de protéines de signalisation telles que le substrat C-kinase riche en alanine myristylée (MARCKS)21,le sarcome (Src)22,l’oncogène viral du sarcome Kirsten-rat (K-Ras)23et le substrat de toxine botulique C3 lié à Ras 1 (Rac1)24 qui contiennent un tronçon d’acides aminés chargés positivement et une queue lipidique.

La PS est également reconnue par la protéine kinase C conventionnelle de manière stéréosélective via un domaine C225. Cependant, le PS est synthétisé dansl’ER 26, indiquant qu’il doit être exporté vers le PM avant de pouvoir jouer son rôle. On ne savait pas comment cela avait été accompli19 jusqu’à ce que l’on constate que, dans la levure, Osh6p et Osh7p transfèrent le PS de l’ER au PM27. Ces LTP appartiennent à une famille conservée de manière évolutionnaire chez les eucaryotes dont le membre fondateur est OSBP et qui contient des protéines (ORP chez l’homme, protéines Osh chez la levure) intégrant un domaine lié à l’OSBP (ORD) avec une poche pour héberger une molécule lipidique. Osh6p et Osh7p sont uniquement constitués d’un ORD dont les caractéristiques structurelles sont adaptées pour lier spécifiquement le PS et le transférer entre les membranes. Néanmoins, la façon dont ces protéines ont transféré le PS de l’ER au PM n’était pas claire. Osh6p et Osh7p peuvent piéger PI(4)P comme ligand lipidiquealternatif 12. Dans la levure, PI(4)P est synthétisé à partir du phosphatidylinositol (PI) dans le Golgi et le PM par les PI 4-kinases, Pik1p et Stt4p, respectivement. En revanche, il n’y a pas de PI(4)P dans la membrane ER, car ce lipide est hydrolysé en PI par la phosphatase Sac1p. Par conséquent, un gradient PI(4)P existe à la fois aux interfaces ER/Golgi et ER/PM. Osh6p et Osh7p transfèrent le PS de l’ER au PM via des cycles d’échange PS/PI(4)P en utilisant le gradient PI(4)P qui existe entre ces deux membranes12.

Au cours d’un cycle, Osh6p extrait le PS de l’ER, échange le PS contre le PI(4)P au PM et transfère le PI(4)P à l’ER pour extraire une autre molécule de PS. Osh6p / Osh7p interagissent avec Ist2p28, l’une des rares protéines qui se connectent et rapprochent la membrane ER et le PM pour créer des sites de contact ER-PM dans la levure29,30,31. De plus, l’association d’Osh6p avec des membranes chargées négativement devient faible dès que la protéine extrait l’un de ses ligands lipidiques en raison d’un changement conformationnel qui modifie ses caractéristiques électrostatiques32. Cela aide Osh6p en raccourcissant son temps de séjour membranaire, maintenant ainsi l’efficacité de son activité de transfert lipidique. Combiné à la liaison à Ist2p, ce mécanisme pourrait permettre à Osh6p/7p d’exécuter rapidement et avec précision l’échange de lipides à l’interface ER/PM. Dans les cellules humaines, les protéines ORP5 et ORP8 exécutent l’échange PS/PI(4)P sur les sites de contact ER-PM via des mécanismes distincts33. Ils ont une ORD centrale, semblable à Osh6p, mais sont directement ancrés à l’ER via un segment transmembranaire C-terminal33 et s’amarrent au PM via un domaine d’homologie de Pleckstrin (PH) N-terminal qui reconnaît PI(4)P et PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 utilise PI(4)P pour transférer PS, et il a été démontré que ORP5/8 régule en outre les niveaux de PM PI(4,5)P2 et module probablement les voies de signalisation. À son tour, une diminution des niveaux de PI(4)P et PI(4,5)P2 diminue l’activité ORP5/ORP8 car ces protéines s’associent au PM d’une manière dépendante du PIP. La synthèse anormalement élevée de PS, qui conduit au syndrome de Lenz-Majewski, a un impact sur les niveaux de PI(4)P par ORP5/836. Lorsque l’activité des deux protéines est bloquée, le PS devient moins abondant au PM, ce qui réduit la capacité oncogène des protéines de signalisation37.

Inversement, la surexpression d’ORP5 semble favoriser l’invasion des cellules cancéreuses et les processus métastatiques38. Ainsi, les altérations de l’activité ORP5/8 peuvent modifier gravement le comportement cellulaire par des changements dans l’homéostasie lipidique. De plus, ORP5 et ORP8 occupent les sites de contact ER-mitochondries et préservent certaines fonctions mitochondriales, éventuellement en fournissant PS39. De plus, ORP5 se localise sur les sites de contact des gouttelettes ER-lipidiques pour délivrer du PS aux gouttelettes lipidiques par échange PS/PI(4)P40. La stratégie décrite ici pour mesurer (i) l’extraction de PS et DEP(4)P à partir de liposomes et (ii) le transport de PS et de PI(4)P entre liposomes a été conçue pour établir et analyser l’activité d’échange de PS/PI(4)P d’Osh6p/Osh7p12,32 et utilisée par d’autres groupes pour analyser l’activité d’ORP5/ORP835 et d’autres LTP10, 41. Il est basé sur l’utilisation d’un lecteur de plaque de fluorescence, d’un spectrofluoromètre standard au format L et de deux capteurs fluorescents, NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP,qui peuvent détecter PS et PI(4)P, respectivement.

NBD-C2Lact correspond au domaine C2 de la glycoprotéine, la lactadhérine, qui a été remanié pour inclure une cystéine unique exposée au solvant près du site de liaison présumé du PS; un fluorophore NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) sensible à la polarité est lié de manière covalente à ce résidu(Figure 1A)12. Pour être plus précis, le domaine C2 de la lactadhérine (Bos taurus, UniProt: Q95114, résidus 270-427) a été cloné dans un vecteur pGEX-4T3 à exprimer en fusion avec la glutathion S-transférase (GST) chez Escherichia coli. La séquence C2Lact a ensuite été mutée pour remplacer deux résidus de cystéine accessibles aux solvants (C270, C427) par des résidus d’alanine et pour introduire un résidu de cystéine dans une région proche du site putatif de liaison PS (mutation H352C) qui peut ensuite être marqué avec N,N'-diméthyl-N-(iodoacétyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)éthylène diamine (IANBD)12 . Un site de clivage de la thrombine est présent entre la protéine GST et le N-terminus du domaine C2. Un avantage majeur est que ce domaine reconnaît sélectivement PS d’une manière indépendante de Ca2+contrairement à d’autres domaines C2 connus ou Annexin A542. NBD-PHFAPP est dérivé du domaine PH de la protéine 1 humaine adapteur de quatre phosphates (FAPP1), qui a été remaniée pour inclure une seule cystéine exposée au solvant qui peut être étiquetée avec un groupe NBD près du site de liaison PI(4)P (Figure 1A)43. La séquence nucléotidique du domaine PH de la protéine FAPP humaine (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) a été clonée en un vecteur pGEX-4T3 pour être exprimé en tandem avec une étiquette GST. La séquence PHFAPP a été modifiée pour insérer un résidu de cystéine unique dans l’interface de liaison membranaire de la protéine43. De plus, un agent de liaison à neuf résidus a été introduit entre le site de clivage de la thrombine et la terminaison N du domaine PH pour assurer l’accessibilité à la protéase.

Pour mesurer l’extraction de PS à partir de liposomes, NBD-C2Lact est mélangé à des liposomes en phosphatidylcholine (PC) contenant des traces de PS. En raison de son affinité pour le PS, cette construction se lie aux liposomes, et le fluorophore NBD subit un changement de polarité lorsqu’il entre en contact avec l’environnement hydrophobe de la membrane, ce qui provoque un décalage bleu et une augmentation de la fluorescence. Si le PS est extrait presque complètement par une quantité stœchiométrique de LTP, la sonde ne s’associe pas aux liposomes, et le signal NBD est plus faible(Figure 1B)32. Cette différence de signal est utilisée pour déterminer si un LTP(par exemple, Osh6p) extrait PS. Une stratégie similaire est utilisée avec NBD-PHFAPP pour mesurer l’extraction PI(4)P(Figure 1B), comme décrit précédemment12,32. Deux tests basés sur FRET ont été conçus pour (i) mesurer le transport PS des liposomes LA à LB, qui imitent respectivement la membrane ER et le PM, et (ii) le transport PI(4)P dans le sens inverse. Ces essais sont effectués dans les mêmes conditions(c.-à-d. même tampon, température et concentration lipidique) pour mesurer l’échange PS/PI(4)P. Pour mesurer le transport de la PS, NBD-C2Lact est mélangé à des liposomes LA composés de PC et dopés avec 5 mol% de PS et 2 mol% d’une phosphatidyléthanolamine fluorescente marquée à la rhodamine (Rhod-PE) - et des liposomes LB incorporant 5 mol% PI(4)P.

Au temps zéro, FRET avec Rhod-PE éteint la fluorescence NBD. Si le PS est transporté des liposomes LA vers LB (par exemple, lors de l’injection d’Osh6p), une décrochage rapide se produit en raison de la translocation des molécules NBD-C2Lact des liposomes LA à LB (Figure 1C). Compte tenu de la quantité de PS accessible, NBD-C2Lact reste essentiellement dans un état lié à la membrane au cours de l’expérience12. Ainsi, l’intensité du signal NBD est directement corrélée avec la distribution de NBD-C2Lact entre les liposomes LA et LB et peut être facilement normalisée pour déterminer la quantité de PS transférée. Pour mesurer le transfert de PI(4)P dans la direction opposée, NBD-PHFAPP est mélangé avec des liposomes LA et LB; étant donné qu’il ne se lie qu’aux liposomes LB qui contiennent pi(4)P, mais pas Rhod-PE, sa fluorescence est élevée. Si PI(4)P est transféré aux liposomes LA, il se transfère à ces liposomes, et le signal diminue en raison de FRET avec Rhod-PE (Figure 1C). Le signal est normalisé pour déterminer la quantité de PI(4)P transférée43.

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Protocol

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1. Purification de NBD-C2Lact

REMARQUE: Bien que ce protocole détaille l’utilisation d’un perturbateur cellulaire pour briser les bactéries, il peut être modifié pour utiliser d’autres stratégies de lyse(par exemple, une presse Français). Au début de la purification, il est obligatoire d’utiliser un tampon fraîchement dégazé, filtré et complété par 2 mM de dithiothréitol (DTT) pour éviter l’oxydation de la cystéine. Cependant, pour l’étape de marquage des protéines, il est crucial de supprimer complètement la TNT. De nombreuses étapes doivent être effectuées sur la glace ou dans une chambre froide pour éviter toute dégradation des protéines. Des échantillons d’un volume de 30 μL doivent être prélevés à différentes étapes du protocole pour effectuer une analyse par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) à l’aide d’un gel d’acrylamide à 15 % afin de vérifier l’avancement de la purification. Mélanger suffisamment de tampon d’échantillon Laemmli dénaturant avec chaque aliquote et chauffer le mélange à 95 °C. Congeler et conserver les tubes à -20 °C jusqu’à analyse.

  1. Expression de GST-C2Lact chez Escherichia coli
    1. Mélanger 20 μL de cellules bl21 Gold compétentes avec 18 μL d’eau stérilisée. Ensuite, mélangez 2 μL de plasmide pGEX-C2Lact (à ~65 ng/μL) avec les bactéries, et transformez-les par électroporation. Resuspendez les bactéries avec 150 μL de bouillon de lysogénie (LB) Lennox autoclavé (10 g/L de tryptone, 5 g/L d’extrait de levure, 5 g/L de NaCl dans de l’eau désionisée, sans glucose). Laissez les bactéries se développer à 37 °C pendant 1 h dans un tube de microcentrifugation à capuchon de 2 mL.
    2. Inoculer 25 mL de milieu LB, complété par 50 μg/mL d’ampicilline, avec 150 μL de suspension bactérienne dans une fiole stérile d’Erlenmeyer de 125 mL. Placez la fiole dans un agitateur orbital à 37 °C et laissez les bactéries se développer pendant la nuit avec agitation à 185 tr/min.
    3. Remplir deux flacons stériles d’Erlenmeyer de 2 L avec 500 mL de milieu LB complété par 50 μg/mL d’ampicilline, et ajouter 5 mL de suspension de préculture. Laissez les bactéries se développer à 37 °C avec agitation à 220 tr/min.
    4. Mesurer périodiquement la densité optique (OD) de la suspension à une longueur d’onde (λ) de 600 nm. Lorsque la DO atteint une valeur d’environ 0,6-0,7, ajouter 500 μL d’une solution mère de 1 M d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à chaque fiole pour initier l’expression de GST-C2Lact. Agiter les flacons à 185 tr/min pendant 4 h à 37 °C.
    5. Transférer le contenu de chaque flacon dans une bouteille de centrifugeuse en polypropylène. Centrifuger les deux bouteilles pendant 30 min à 4600 × g à 4 °C pour granuler les bactéries. Jeter le surnageant et resussaisir chaque pastille dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate froid.
    6. Transférer la suspension bactérienne contenue dans chaque bouteille dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL. Centrifuger les deux tubes pendant 30 min à 2300 × g à 4°C. Retirez le surnageant et conservez les tubes, chacun contenant une pastille bactérienne, à -20 °C.
  2. Purification du C2Lact
    1. Sur glace, remplir deux tubes centrifuges coniques de 50 mL avec 50 mL de tampon contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4 et 150 mM de NaCl (ci-après appelé tampon TN), préalablement filtrés et dégazés par filtration sous vide membranaire.
    2. Pour préparer le tampon de lyse dans chaque tube, dissoudre un comprimé de cocktail d’inhibiteurs de protéase sans acide tétraacétique d’éthylènediamine dans le tampon TN par sonication légère ou vortex. Ajouter d’autres antiprotéases (10 μM de bestatine, 1 μg/mL de pepstatine A et 10 μM de phosphoramidon). Il est important de compléter le tampon avec 2 mM de TNT.
    3. Remplissez les deux tubes qui contiennent les pastilles bactériennes préparées à l’étape 1.1.6, avec un tampon de lyse pour obtenir un volume final de 30 mL dans chaque tube, et décongelez lentement les pastilles sur la glace pendant 10 min. Écraser chaque pastille avec une spatule en acier inoxydable et les remettre en suspension en tourbillonnant les tubes et/ou en pipetant la suspension d’avant en arrière avec un contrôleur de pipette et une pipette de 25 mL jusqu’à l’obtention d’une suspension homogène.
    4. Effectuer la lyse à l’aide d’un perturbateur de cellule prérefroidi (voir le tableau des matériaux)en chargeant 30 mL de l’échantillon à l’intérieur du réservoir et en exécutant un cycle de rupture en mode continu avec une pression de 1,6 bar. Recueillir le lysate dans le même tube, maintenir le tube sur de la glace et ajouter immédiatement 250 μL à partir d’une solution mère de 200 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) préparée dans de l’isopropanol.
    5. Lysez l’autre échantillon en suivant la même procédure. Utilisez le reste du tampon de lyse pour laver le perturbateur cellulaire et collectez le lavage pour ajuster le volume de chaque lysate (~ 30 mL) à un volume final de 50 mL.
    6. Complétez chaque lysate avec 5 mMMgCl2,et ajoutez 20 μg/mL de DNAse I pour fragmenter l’ADN et ainsi réduire la viscosité de l’échantillon. Incuber sur de la glace pendant 30 min. Prélever un échantillon pour l’analyse du gel.
    7. Transférer chaque lysate de 50 mL dans un tube ultracentrifuge en polycarbonate précédité (deux au total, voir le Tableau des matériaux). Centrifuger à 186 000 × g à 4 °C pendant au moins 1 h à l’aide d’une ultracentrifugeuse.
    8. Parallèlement à l’étape de centrifugation, distribuer 1,4 mL d’une boue contenant du glutathion couplée à 4 % de billes d’agarose dans deux tubes centrifuges coniques de 50 mL, ajouter 20 mL de tampon TN complété par 1 mM de TNT (tampon TND) à chaque tube, centrifuger à 1200 × g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Répétez cette étape de lavage deux fois.
    9. Après la centrifugation du lysate bactérien, retirer un échantillon de 30 μL du surnageant et transférer le surnageant de chaque tube d’ultracentrifugeuse dans un tube de centrifugeuse conique correspondant de 50 mL contenant des billes propres. Pour l’analyse du gel, resuspendez la pastille de débris dans l’un des tubes d’ultracentrifugation avec 50 mL de tampon TND et prélez un échantillon de 30 μL.
    10. Placer les tubes sur un rotateur pendant 3-4 h à 4 °C pour obtenir une suspension homogène de billes. Regrouper les suspensions de billes dans une colonne de chromatographie vide de 25 mL. Laissez les perles décanter et retirez le tampon et les protéines non liées par écoulement par gravité. Prenez un échantillon de l’éluat pour analyse.
    11. Resuspendez les billes avec 20 mL de tampon TND et collectez l’éluat par écoulement gravitaire. Répétez cette étape deux fois pour laver complètement les perles. Mettre en commun les éluats collectés et conserver un échantillon de 30 μL pour une analyse plus approfondie.
      REMARQUE: Après une courte décantation, un volume d’environ 2 mL de suspension de billes, auquel est attaché GST-C2Lact, sédiments au fond de la colonne.
    12. Ajouter 1 mL de suspension de billes à deux tubes de microcentrifugation à capuchon de 2 mL. Remplissez chaque tube avec un tampon TND jusqu’à un volume final de 1,970 mL. Prenez un échantillon de 30 μL dans un tube pour une analyse plus approfondie (échantillon B1). Ajouter 10 μL de solution de CaCl2 de 10 mM et 25 μL à partir d’une solution mère de solution de protéase de thrombine humaine à 0,02 U/μL.
    13. Placez les deux tubes sur un rotateur à 4 °C pendant la nuit pour permettre à la thrombine de se détacher de l’étiquette GST du domaine C2Lact. Le lendemain, dans chaque tube, mélanger 10 μL de solution de PMSF de 200 mM avec la suspension de billes pour inhiber l’action de la thrombine.
    14. Centrifugez les tubes à 700 × g pendant 5 min, et collectez le surnageant, qui contient le domaine soluble C2Lact, de chaque tube, sans prendre les billes. Regrouper les surnageants dans un tube de microcentrifugation à capuchon de 2 mL (éluat E1) qui est maintenu sur la glace.
    15. Ajouter 1 mL de tampon TND à chaque tube pour ressuspender les perles et les laver; répétez l’étape 1.2.14. Effectuez cette étape trois fois de plus pour récupérer un maximum de protéines. Chaque fois, mettez en commun les surnageants collectés dans un nouveau tube de 2 mL (éluats E2, E3, E4 et E5) et prenez une aliquote pour une analyse plus approfondie. À la fin des étapes de lavage, prenez une aliquote de la suspension de perles (aliquote B2).
    16. Analyser les échantillons de 30 μL qui ont été prélevés aux différentes étapes du protocole de purification par séparation SDS-PAGE sur un gel d’acrylamide à 15%.
    17. Éliminer les billes potentiellement contaminantes en remettant en commun tous les surnageants(c.-à-d., ~ 10 mL) collectés au cours des étapes 1.2.14 et 1.2.15 dans une colonne de chromatographie de 10 mL. Recueillez l’éluat par écoulement gravitaire et retenez les perles au bas de la colonne.
    18. Concentrer l’échantillon de C2Lact à l’aide d’une unité de filtration centrifuge avec un seuil de poids moléculaire (MWCO) de 3 kDa et une vitesse de centrifugation de 2300 × g. Arrêtez la procédure de concentration lorsque le volume de l’échantillon de protéines est d’environ 1 mL.
  3. Préparation et purification du NBD-C2Lact
    1. Équilibrez une colonne de dessalement (voir la table des matériaux)avec un tampon TN. Chargez la colonne avec 1 mL d’échantillon concentré de C2Lact. Laissez l’échantillon pénétrer complètement dans le lit de gel, ajoutez 1,5 mL de tampon TN sans TNT fraîchement dégazé à la colonne et collectez l’éluat par écoulement gravitaire dans un tube de microcentrifuge à capuchon encliquetable de 2 mL.
    2. Diluer 50 μL d’éluat dans un volume final de tampon TN de 300 μL et enregistrer un spectre d’absorbance de 230 à 450 nm en utilisant un tampon TN pur comme blanc. Déterminer la concentration en C2Lact en fonction de l’absorbance mesurée à 280 nm, en considérant un coefficient d’extinction ε égal à 44 920 M-1,cm-1.
    3. Pour étiqueter la construction C2Lact avec un fluorophore NBD, mélanger la protéine avec un excès molaire dix fois supérieur de N,N'-diméthyl-N-(iodoacétyl)-N'(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)éthylènediamine (amide IANBD).
      1. Dissoudre 1 mg d’IANBD dans du diméthylformamide anhydre (DMF), en gardant à l’esprit que le volume final de DMF utilisé pour le labelage de la construction C2Lact ne doit pas dépasser 5 % (v/v) du volume de l’échantillon de protéines.
      2. Pour déterminer le volume de DMF (VDMF)pour dissoudre l’IANBD, calculez d’abord la quantité requise d’IANBD (m, exprimée en mg) pour étiqueter la protéine en utilisant la formule 1.
        m = 10 000 × C × V × MWIANBD (1)
        où C est la concentration de C2Lact mesurée à l’étape 1.3.2, V est le volume de l’échantillon de C2Lact, et MWIANBD est le poids moléculaire du fluorophore (420 g/mol).
      3. Calculer VDMF en utilisant les formules 2 (avec m0= 1) et 3.
        VDMF= (m0/m) × VIANBD (2)
        VIANBD= 0,05 × V (3)
        Où m0 est la quantité de poudre d’IANBD en mg, et VIANBD est le volume de solution d’IANBD à ajouter à l’échantillon de C2Lact.
      4. Ajouter le volume VIANBD de la solution IANBD fraîchement préparée à l’échantillon C2Lact et agiter le mélange réactionnel à 800-900 tr/min pendant 30 min à 25 °C à l’aide d’un thermomélangeur à l’abri de la lumière. Laissez la réaction se poursuivre pendant 90 min sur la glace. En attendant, nettoyez une unité de filtration centrifuge (MWCO = 3 kDa) avec 10 mL de tampon TN.
    4. Ajouter la L-cystéine (dans un excès molaire de 10 fois à l’IANBD) au mélange réactionnel pour inactiver l’IANBD libre.
    5. Ajouter 15 mL de tampon TN à la solution NBD-C2Lact et transférer la solution NBD-C2Lact à l’unité de filtration centrifuge. Concentrer l’échantillon à 2 mL pour séparer la majeure partie de la NBD libre de la protéine par centrifugation à 2300 × g. Répétez cette étape de lavage deux fois. Centrifuger l’échantillon dans un tube de centrifugeuse à capuchon encliquetable de 2 mL pendant 10 min à 19 000 × g à 4 °C pour granuler les agrégats potentiels, et prélever le surnageant.
    6. Diluer 50 μL d’éluat dans un volume final de 300 μL de tampon TN. Enregistrer le spectre d’absorbance de 230 à 650 nm en utilisant l’éluat recueilli pendant la procédure de concentration sous forme de blanc. Déterminer la concentration de NBD-C2Lact en utilisant l’absorbance maximale à λ=280 et 495 nm et les coefficients d’extinction ε= 44 920 M-10,cm -1 (protéine) et 25 000 M-1,cm-1 (fluorophore NBD).
      REMARQUE: Si les deux valeurs de concentration sont identiques, cela indique que la construction C2Lact est étiquetée à un rapport de 1: 1 avec le groupe NBD.
    7. Si la concentration de NBD-C2Lact estimée à partir de la mesure de l’absorbance nbD dépasse la concentration estimée à partir de l’absorbance des résidus de tryptophane (Trp), répétez l’étape 1.3.5 pour éliminer davantage les NBD libres.
    8. Ajouter le glycérol à l’échantillon pour obtenir une concentration finale de 10% (v/v) pour cryo-protéger la construction NBD-C2Lact pendant la congélation éclair. Mesurer la concentration finale en protéines.
    9. Préparer des aliquotes de protéines de 50 μL dans des tubes de microcentrifugation à capuchon de 0,5 mL. Congeler les tubes dans de l’azote liquide et les stocker à -80 °C.

2. Purification du NBD-PHFAPP

REMARQUE: La procédure de production et d’étiquetage du PHFAPP est identique à celle du NBD-C2Lact jusqu’au transfert de la solution nbD-C2Lact à une unité de filtration centrifuge à l’étape 1.3.4. À partir de cette étape, suivez le protocole décrit ci-dessous.

  1. Après l’étape de concentration, conserver 2 mL de NBD-PHFAPP à 4 °C dans l’obscurité pendant 1 jour au plus avant d’effectuer la chromatographie d’exclusion de taille. Avant la chromatographie d’exclusion de taille, vérifier qu’il n’y a pas de dépôt orange (agrégation pendant la concentration) au fond du tube. Si tel est le cas, centrifuger l’échantillon à 540 000 × g pendant 10 min à 4 °C et purifier le surnageant par chromatographie d’exclusion de taille.
    REMARQUE: La chromatographie d’exclusion de taille est réalisée sur une colonne remplie de copolymère dextran-acrylamide réticulé (voir la table des matériaux),préalablement équilibrée avec un tampon TND, à l’aide d’un système de chromatographie liquide à protéines rapides (voir la table des matériaux). La colonne doit être protégée de la lumière. Un débit de 1 mL/min a été utilisé, et l’élution de la construction NBD-PHFAPP a été suivie par l’enregistrement de l’absorbance à λ=280 (protéine) et 480 nm (NBD) à la sortie de la colonne.
    1. Injecter l’échantillon NBD-PHFAPP chargé dans une boucle d’injection de 2 mL sur la colonne et prélever immédiatement 2,5 mL de fractions d’éluat.
  2. Analyser toutes les fractions qui correspondent au pic principal détecté à 280 et 480 nm sur un gel SDS-PAGE à 15%. Mélanger un échantillon de 25 μL de chaque fraction avec 15 μL de tampon d’échantillon Laemmli avant de chauffer et de charger sur le gel.
    REMARQUE: Un pic principal, qui est détecté simultanément à λ = 280 et 480 nm, apparaît une fois qu’un volume de tampon d’environ 150 mL est passé à travers la colonne.
  3. Regrouper les fractions qui contiennent exclusivement la protéine NBD-PHFAPP (~12,2 kDa) et ajouter du glycérol à une concentration finale de 10% (v / v). Concentrer l’échantillon à l’aide d’une unité de filtration centrifuge avec un MWCO de 3 kDa à un volume final de 1 mL en utilisant une vitesse de centrifugation de 2300 × g.
  4. Préparez des aliquotes et enregistrez un spectre d’absorbance tel que décrit pour NBD-C2Lact. Utilisez un coefficient d’extinction ε= 29 450 M-1,cm -1 pour déterminer la concentration de la protéine en fonction de l’absorbance mesurée à λ=280 nm.

3. Préparation de liposomes pour l’extraction ou le transfert de PS et de PI(4)P

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à température ambiante, sauf indication contraire. Manipulez les solvants organiques, le rotavapor et l’azote liquide avec prudence.

  1. Préparer frais, filtré et dégazé 50 mM 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)-hydroxyde de potassium (KOH), pH 7,4, tampon d’acétate de potassium (HK) de 120 mM.
  2. Pour chaque type de liposome, prendre des quantités précises de différents lipides à partir de solutions d’origine et les mélanger dans une fiole en verre en forme de poire de 25 mL (Tableau 1). Ajouter le chloroforme pur pour ajuster le volume de chaque mélange à 1 mL. Étiquetez chaque flacon avec le nom du liposome. Envelopper les flacons contenant un mélange lipidique dopé au Rhod-PE avec du papier d’aluminium.
  3. Placez la fiole sur un évaporateur rotatif. Sécher les lipides sous vide et à 25 °C pendant au moins 30 min à une vitesse de rotation de 500 tr/min. Pour les films lipidiques contenant du PI(4)P, pré-prévenir le ballon à 32-34 °C pendant 5 min, sous une rotation douce, pour bien mélanger le PI(4)P avec les autres lipides avant de créer du vide dans le flacon pour éliminer le solvant, ce qui laissera derrière lui un film de lipides secs sur la paroi du flacon.
  4. Débranchez la fiole de l’évaporateur et placez-la dans une chambre à vide pendant 45 minutes pour éliminer les traces restantes de solvant. Remplissez la fiole avec 2 mL de tampon HK et ajoutez quelques billes de verre de 4 mm de diamètre à la solution. Tourbillonnez doucement la fiole pendant 2 min pour ressuspend les lipides et préparer des vésicules lipidiques multilamellaires (MLE) avec une concentration lipidique de 4 mM. Préparer des aliquotes de 0,5 mL de MLV dans des tubes de microcentrifugation à bouchon à vis de 1,5 mL.
  5. Congeler-décongeler les tubes 5x (en utilisant de l’azote liquide et un bain-marie à 37 °C, respectivement). Extrudez les liposomes ou stockez-les à -20 °C.
  6. Utilisez une mini-extrudeuse pour préparer les liposomes(c’est-à-dire les grandes vésicules unilamellaires) des MLV conformément aux directives du fabricant. Utilisez un filtre en polycarbonate avec des pores cylindriques uniformes de 200 nm de diamètre.
  7. Pour préparer chaque type de liposome, extruder au moins 250 μL de la suspension correspondante de MLV. Conserver les liposomes extrudés à 4 °C et dans l’obscurité s’ils contiennent du Rhod-PE. Utilisez les liposomes dans les 2 jours.
Composition lipidique (mol/mol)Lipide
Nom du liposomeDoPC
(25 mg/mL)		PAPA
(10 mg/mL)		16:0 Liss Rhod-PE
(1 mg/mL)		C16:0/C16:0-PI(4)P
(1 mg/mL)
Essais d’extractionLiposome 2 mol% PSPC/PS 98/2247 μL12,5 μL
Liposome 2 mol% PI(4)PPC/PI(4)P 98/2247 μL153 μL
Liposome PCPC 100252 μL
Essais de transportLA PC/PS/Rhod-PE 93/5/2234 μL31,4 μL200 μL
LA sans PSPC/Rhod-PE 98/2247 μL200 μL
LB PC/PI(4)P 95/5237 μL383 μL
LB sans PI(4)PPC 100252 μL
LA-Eq PC/PS/PI(4)P/Rhod-PE 93/2.5/2.5/2234 μL15,7 μL200 μL191 μL
LB-Eq PC/PS/PI(4)P 95/2.5/2.5239 μL15,7 μL191 μL

Tableau 1 : Volumes de solutions lipidiques à mélanger pour la préparation des liposomes. Abréviations: PS= phosphatidylsérine; PC = phosphatidylcholine; PI(4)P = phosphatidylinositol 4-phosphate; Rhod-PE = phosphatidyléthanolamine marquée à la rhodamine; DOPC = dioléoylphosphatidylcholine; POPS= 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycero-3-phospho-L-sérine; 16:0 Liss Rhod-PE = 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl).

4. Mesure de l’extraction PS ou PI(4)P

REMARQUE: Les mesures doivent être effectuées à l’aide d’une plaque noire de 96 puits et d’un lecteur de plaque de fluorescence équipé de monochromateurs: un pour l’excitation de fluorescence et un pour l’émission, avec une bande passante variable.

  1. Préparer un tampon HK frais, filtré et dégazé complété par 1 mM de MgCl2 (tampon HKM). Préparer des liposomes PC purs et des liposomes PC dopés avec 2 mol% PS ou 2 mol% PI(4)P (concentration lipidique finale de 4 mM, voir tableau 1).
    REMARQUE: Gardez les tubes remplis de la suspension de liposomes extrudés à température ambiante tout au long de l’expérience et gardez les protéines sur la glace. De plus, protégez les capteurs lipidiques de la lumière.
  2. Pour le dosage d’extraction PS, dans un puits, mélanger des liposomes contenant 2 mol% de PS (concentration lipidique finale de 80 μM, concentration de PS accessible de 0,8 μM) avec duLAct NBD-C2 (concentration finale de 250 nM) dans un volume final de 100 μL. Remplissez un deuxième puits avec la même quantité de liposome (80 μM, 2 mol% PS) et de NBD-C2Lact (250 nM) mélangé à 3 μM LTP (Osh6p comme témoin positif ou protéine d’intérêt).
    REMARQUE: Un temps d’incubation de 5 min est suffisant pour qu’Osh6p obtienne une extraction des lipides.
  3. Remplissez un troisième puits avec NBD-C2Lact (250 nM) mélangé à des liposomes PC purs (80 μM). Remplissez un quatrième puits uniquement avec des liposomes PC purs (80 μM). Répétez les étapes 4.2 à 4.3 pour préparer trois séries supplémentaires de quatre puits.
  4. Pour chaque puits, enregistrez un spectre NBD de 505 à 650 nm (bande passante 5 nm) lors de l’excitation à 490 nm (bande passante 5 nm) à 25 °C. Pour chaque série, soustrayez le spectre enregistré avec seulement des liposomes des autres spectres.
    NOTE: F et Fmax correspondent à l’intensité à 536 nm mesurée avec des liposomes contenant du PS en présence ou en l’absence de LTP, respectivement, tandis que F0 est l’intensité à la même longueur d’onde avec les liposomes PC purs. Pour chaque série, le pourcentage de PS accessible qui est extrait par la protéine est donné en utilisant la formule suivante.
    100 × (1-((F-F0)/(Fmax-F0))) (4)
  5. Pour le test d’extraction PI(4)P, préparer des liposomes dopés à 2 mol% PI(4)P, et effectuer des mesures avec la sonde NBD-PHFAPP. Effectuez des expériences de contrôle et déterminez le pourcentage d’extraction de la même manière que celle décrite ci-dessus.
    REMARQUE: La concentration en liposomes et en protéines est identique à celle utilisée dans le test d’extraction PS.

5. Mesure en temps réel du transport PS

REMARQUE: Un fluorimètre standard (format 90 °) équipé d’un support de cellule à température contrôlée et d’un agitateur magnétique est utilisé pour enregistrer la cinétique de transfert lipidique. Pour acquérir des données avec précision, il est essentiel de maintenir en permanence l’échantillon à la même température (réglée entre 25 et 37 °C selon l’origine de la protéine(par exemple,levure ou humain)) et de le remuer constamment. Le protocole décrit ci-dessous est destiné à la mesure du transport des lipides dans un échantillon de 600 μL contenu dans une cellule de quartz cylindrique.

  1. Préparer un tampon HKM fraîchement dégazé et filtré. Conservez les tubes contenant des liposomes extrudés à température ambiante. Enveloppez les tubes contenant des liposomes avec du Rhod-PE dans du papier d’aluminium et/ou conservez-les dans une boîte opaque pour éviter tout photobleachage.
  2. Ajustez les monochromateurs d’excitation et d’émission à λ = 460 nm (avec une bande passante courte (1-3 nm)) et à λ = 530 nm (avec une large bande passante (≥ 10 nm)), respectivement. Réglez le temps d’acquisition à 25 min avec une résolution temporelle ≤ 1 s.
  3. Dans la cuvette de quartz, diluer 30 μL de la suspension de liposomes LA et un volume de solution mère NBD-C2Lact dans un tampon HKM pré-averti pour préparer un échantillon de 570 μL contenant 200 μM de lipides totaux et 250 nM de NBD-C2Lact. Ajoutez une petite barre d’agitation magnétique et placez la cuvette dans le support du fluoromètre.
  4. Une fois que l’échantillon est équilibré thermiquement (après 3-5 min), déclenchez la mesure. Après 1 min, ajouter 30 μL de suspension de liposomes LB (concentration finale de 200 μM de lipides totaux) à l’échantillon. Après 3 min, injecter du LTP dans l’échantillon de sorte que la concentration finale du LTP soit de 200 nM, et acquérir le signal pour les 21 min restantes.
  5. Effectuer une expérience parallèle pour normaliser le signal NBD. Mélanger 30 μL de suspension de liposomes LA-Eq avec 250 nM NBD-C2Lact dans un tampon HKM (volume final de 570 μL). Après 1 min, injecter 30 μL de suspension de liposome LB-Eq.
    REMARQUE: La composition lipidique des liposomes LA-Eq et LB-Eq est similaire à celle des liposomes LA et LB utilisés dans le test de transfert, sauf que chacun d’eux contient 2,5 mol% PS et 2,5 mol% PI(4)P. En conséquence, le signal NBD mesuré, appelé FEq, correspond au signal qui doit être mesuré si PS a été complètement équilibré entre les liposomes LA et LB par un processus de transfert.
  6. Convertir les courbes cinétiques mesurées avec un LTP d’intérêt pour déterminer la quantité de PS (en μM) transférée des liposomes LA en LB au fil du temps. Normalisez chaque point de données (F) de la courbe à l’aide de la formule suivante.
    Norme F = (F-F0)/(FEq-F0) (5)
    dans lequel F0 correspond au signal NBD juste avant l’ajout d’un LTP, et FEq est le signal mesuré à l’étape 5.5.
    NOTE: La quantité de PS (en μM) transférée des liposomes LA à LB correspond à 2,5 ×normeF , étant donné que l’équilibre correspond à une situation où la moitié des molécules PS accessibles, contenues dans la feuillet externe des liposomes LA, (c’est-à-dire, correspondant à 5 mol% de 0,5 × 200 μM de lipides totaux) a été transférée dans les liposomes LB.

6. Mesure en temps réel du transport PI(4)P

  1. Réglez le fluorimètre (longueur d’onde d’excitation et d’émission, bande passante, temps d’acquisition, résolution temporelle) comme fait pour le test de transfert PS. De même, utilisez le même tampon, la même cuvette et les mêmes liposomes pour effectuer les expériences sous agitation constante à la même température.
  2. Dans la cuvette, mélanger 30 μL de suspension de liposomes LB et de NBD-PHFAPP avec un tampon HKM pré-averti pour obtenir un volume final de 570 μL (200 μM de lipides totaux, 250 nM NBD-PHFAPP). Une fois l’équilibre thermique de l’échantillon atteint, commencez la mesure et, après 1 min, injectez 30 μL de suspension de liposome LA. Après 3 min, injecter le LTP d’intérêt (concentration finale de 200 nM), et enregistrer le signal.
  3. Effectuez une deuxième expérience pour normaliser le signal NBD. Mélanger 30 μL de suspension de liposomeS LB-Eq avec 250 nM NBD-PHFAPP dans 570 μL de tampon HKM. Après 1 min, injecter 30 μL de suspension de liposome LA-Eq.
    NOTE: Ici, le signal NBD, appelé FEq, correspond à celui qui doit être mesuré si PI(4)P était entièrement équilibré entre les liposomes LA et LB.
  4. Convertir les courbes cinétiques pour déterminer la quantité de PI(4)P (en μM) transférée des liposomes LB en LA au fil du temps. Chaque point de données (F) est normalisé en utilisant la formule 5 dans laquelle F0 correspond au signal NBD avant l’ajout d’un LTP, et FEq est le signal mesuré à l’étape 6.3.
    NOTE: La quantité de PI(4)P (en μM) transférée des liposomes LB à LA correspond à 2,5 ×normeF , étant donné que l’équilibre correspond à une situation où la moitié du PI(4)P contenu dans la feuillet externe des liposomes LB (c’est-à-dire 0,5 × 5 μM) a été transférée dans les liposomes LA.

7. Analyse des courbes cinétiques

  1. Quantifier la mesure dans laquelle un LTP est efficace en déterminant la vitesse à laquelle ce LTP transfère les lipides d’une population de liposomes à l’autre dans les premières secondes suivant son injection dans la cuvette.
    1. Effectuer une régression linéaire des premiers points de données de la cinétique de transfert pour obtenir une pente. Divisez la valeur de pente par la concentration de LTP dans le mélange réactionnel pour déterminer le nombre de molécules lipidiques transférées par protéine par unité de temps (min ou s).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Figure 1: Description des capteurs lipidiques fluorescents et des essais in vitro. (A) Modèles tridimensionnels de NBD-C2Lact et NBD-PHFAPP basés sur la structure cristalline du domaine C2 de la lactadhérine bovine (ID PDB: 3BN648) et la structure RMN du domaine PH de la protéine FAPP1 h...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les résultats de ces tests reposent directement sur les signaux des capteurs lipidiques fluorescents. Ainsi, la purification de ces sondes marquées à un rapport de 1:1 avec NBD et sans contamination fluorophore NBD libre est une étape critique de ce protocole. Il est également obligatoire de vérifier si le LTP examiné est correctement plié et non agrégé. La quantité de LTP testée dans les essais d’extraction doit être égale ou supérieure à celle des molécules PS ou PI(4)P accessibles pour mesurer correctement si cette LT...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants à la Dre A. Cuttriss pour sa relecture attentive du manuscrit. Ces travaux sont financés par la subvention ExCHANGE de l’Agence nationale de la recherche Français (ANR-16-CE13-0006) et par le CNRS.

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Materials

FAPP

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  ; L-cystéine &ge ; 97 % (FG)  ;SigmaW326305-100GPréparez une solution mère de L-cystéine de 10 mM dans l’eau. Les aliquotes sont stockées à -20 ° ; C
Flacon ambré de 2 mL, PTFE/Rub Lnr, pour le stockage des lipides dans CHCL3WheatonW224681
billes de verre de 4 mm de diamètreSigmaZ265934-1EA
Tube à centrifuger conique de 50 mLFalcon
Ä ; Purificateur KTAGE healthcareFPLC
d’aluminium
Amicon Ultra-15 avec un MWCO de 3 et 10 kDaMerckUFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 avec un MWCO de 3 et 10 kDaMerckUFC800324, UFC801024
AmpicillinePréparez une solution mère de 50 mg/mL avec de l’eau filtrée et stérilisée et conservez-la à -20 & deg ;C.
BestatinSigmaB8385-10mg
BL21 Or Cellules CompétentesAgilent
C16:0 Liss  ; (Rhod-PE) dans CHCl3 (1 mg/mL)Avanti Polar Lipids810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P  ;   ;Echelon LipidsP-4016-3Dissoudre 1 mg de poudre de C16:0/C16:0-PI(4)P en 250 & micro ; L de MeOH et 250 µ ; L de CHCl3. Complétez ensuite avec CHCl3 à 1 mL. La solution doit devenir claire.
C16:0/C18:1-PS (POPS) dans CHCl3 (10 mg/mL)Avanti Polar Lipids840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) dans CHCl3 (25 mg/mL)Avanti Polar Lipids850375C-500mg
CaCl2sp ;SigmaPréparez 10 mM de solution mère de CaCl2 dans de l’eau.
Disrupteur cellulaireà dynamique
Chloroforme (CHCl3) RPE-ISOCarlo Erba438601
Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase sans EDTARoche5056489001
Eau
Diméthylformamide (DMF), anhydre, pure
à >99 %DNAse I Recombinante, sans RNAse, en poudreRoche10104159001
DTTEuromedexEU0006-BPréparer 1 M de solution mère de DTT dans de l’eau Milli-Q.  ; Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à -20 °C.
Colonnes de chromatographie Econo-Pac (1,5 & times ; 12 cm).Cuvetted’électroporation Biorad 7321010
2 mmOzymeEP102
Électroporateur Eppendorf 2510Eppendorf
Tubes Ti45 et Ti45BeckmanRotation des lysats
Seringues en verre (10, 25 et 50 & micro ; L) pour l’expérience de fluorescenceHamilton
Seringues en verre (25, 100, 250, 500 et 1000 & micro ; L) pour manipuler les solutions mères lipidiquesHamilton1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathion Sepharose 4B billesGE Healthcare17-0756-05
Glycérol (pur à 99 %)SigmaG5516-500ML
Tubes d’hémolyse avec capuchon
HEPES , >99 % purSigmaH3375-500G
Illustra Colonne de dessalage NAP 10GE healthcareGE17-0854-02
Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  ;EuromedexEU0008-BPréparer une solution mère d’IPTG à 1 M dans Milli-Qwater. Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à -20 °C.
K-AcétateProlabo26664.293
Lennox LB Bouillon moyen sans glucosePréparé avec de l’eau milli-Q et autoclave.
Azote liquideLinde
Methanol (MeOH) &ge ; 99,8 %VWR20847.24
MgCl2SigmaPréparez une solution de 2 M de MgCl2. Filtrer la solution à l’aide d’un 0,45 & micro ; m filtre.  ;
Microplaque 96 puits PS F-Botom Noir Non-ContraignantGreiner Bio-one655900
Mini-Extrudeuse avec deux seringues Hamilton étanches aux gaz de 1 mLAvanti Polar Lipids610023
Lecteur de plaques de fluorescence basé sur un monochromateurTECANM1000 Pro
N,N'-Diméthyl-N-(Iodoacétyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)Dissoudre25 mg d’IANBD dans 2,5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et préparer 25 aliquotes de 100 µ ; L dans des tubes à bouchon à vis de 1,5 mL. Ne vissez pas complètement le capuchon. Ensuite, retirez le DMSO dans un lyophilisateur pour obtenir 1 mg d’IANBD sec par tube. Les tubes sont fermés et stockés à -20 ° ; C dans l’obscurité.   ;
NaClSigmaS3014-1KG
PBS137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoclavé et stocké à 4 ° ;C.
Fioles en verre en forme de poire (25 mL, 14/23, verre Duran)Duran
Sigmap5318-25mg
pGEX-C2LACT>plasmide Disponible sur demande auprès de notre laboratoire
PlasmideDisponible sur demande auprès de notre laboratoire
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) &ge ; 98,5 % (GC)SigmaP7626-25gPréparer une solution mère de 200 mM de PMSF dans de l’isopropanol
PhosphoramidonSigmaR7385-10mg
Filtres en polycarbonate (19 mm de diamètre) avec une taille de pores de 0,2 & micro ; mAvanti Polar Lipids610006
Colonne de chromatographie Poly-Prep (avec un volume de lit de 0 à 2 ml et un réservoir de 10 ml)Biorad7311550
Préfiltres (10 mm de diamètre).Avanti Polar Lipids610014
PyMOLhttp://pymol.org/Construction des modèles 3D des protéines (Figure 1A)
Cuvette en quartz pour la fluorescence UV/visible (volume minimum de 600 µ ; L)Hellma
Cuvettes en quartzHellma
Centrifugeuse réfrigérée  ; Eppendorf 5427REppendorf
Évaporateur rotatifBuchiB-100
Tubes microcentriques à bouchon à vis (1,5 mL)Sarsted
Petite barre d’agitation magnétique PFTE (5 × ; 2 mm)
Tubes microcentriques à pression (0,5, 1 et 2 mL)Eppendorf
SYPRO orangecoloration fluorescente pour détecter les protéines dans le gel SDS-PAGE
ThermomixeurStarlab
THROMBIN, À PARTIR DE PLASMA HUMAINSigma10602400001Dissoudre 20 unités dans 1 mL d’eau milli-Q et préparer 25 µ ; L aliquotes dans des tubes Eppendorf de 0,5 ml. Ensuite, congelez et conservez à -80 °C.
Tris, ultra pureMP819623
Ultracentrifugeuse L90KBeckman
Spectrophotomètre d’absorbance UV/visibleSAFAS
Spectrofluorimètre UV/visible avec support de cellule à température contrôlée et dispositif d’agitationJasco ou ShimadzuJasco FP-8300 ou Shimadzu RF-5301PC
Chambre àvide
Bain-marieJulabo
XK 16/70 colonne rempli de Sephacryl S200HRGE healthcare
Feuille constantedéminéralisée (Milli-Q) Rotor à angle fixe batcérauxPépstatine du groupe pGEX-PH

References

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