Immunomarquage de rétines à monture entière avec la méthode de nettoyage tissulaire CLARITY

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour adapter la méthode CLARITY des tissus cérébraux pour les rétines de montage entier afin d’améliorer la qualité de la coloration immunohistochimique standard et de l’imagerie à haute résolution des neurones rétinins et de leurs structures subcellulaires.

Résumé

La méthode de dlipidation de l’hydrogel tissulaire (CLARITY), développée à l’origine par le laboratoire Deisseroth, a été modifiée et largement utilisée pour l’immunomarquage et l’imagerie d’échantillons de cerveau épais. Cependant, cette technologie de pointe n’a pas encore été utilisée pour les rétines à montage entier. Bien que la rétine soit partiellement transparente, son épaisseur d’environ 200 μm (chez la souris) limite toujours la pénétration des anticorps dans les tissus profonds et réduit la pénétration de la lumière pour l’imagerie à haute résolution. Ici, nous avons adapté la méthode CLARITY pour les rétines de souris à montage entier en les polymérisant avec un monomère d’acrylamide pour former un hydrogel nanoporeux, puis en les éliminant dans du sulfate de dodécyle de sodium pour minimiser la perte de protéines et éviter les lésions tissulaires. des rétines CLARTÉ-traitées immunostained avec des anticorps pour les neurones rétiniens, les cellules glial, et les protéines synaptiques, montés dans une solution d’appariement d’index réfractif, et imagés. Nos données démontrent que clarity peut améliorer la qualité de la souillure et de l’imagerie immunohistochemical standard pour les neurones rétiniennes et les cellules gliales dans la préparation de montage entier. Par exemple, la résolution 3D des structures axon-comme et dendritiques fines des cellules dopaminergiques d’amacrine ont été beaucoup améliorées par la CLARTÉ. Par rapport aux rétines à montage entier non traitées, CLARITY peut révéler une immunomarquage pour les protéines synaptiques telles que la protéine de densité postsynaptique 95. Nos résultats montrent que CLARITY rend la rétine plus transparente optiquement après l’élimination des lipides et préserve les structures fines des neurones rétiniennes et de leurs protéines, qui peuvent être couramment utilisées pour obtenir une imagerie à haute résolution des neurones rétiniennes et de leurs structures subcellulaires dans la préparation de montage entier.

Introduction

La rétine vertébrée est peut-être la partie la plus accessible du système nerveux central (SNC), et elle sert d’excellent modèle pour étudier le développement, la structure et la fonction du cerveau. Cinq classes de neurones de la rétine sont réparties en trois couches nucléaires séparées par deux couches plexiformes. La couche nucléaire externe (ONL) est constituée de photorécepteurs classiques (tiges et cônes) qui convertissent la lumière en signaux électriques. Les signaux électriques sont traités par les neurones de la couche nucléaire interne (INL), y compris les cellules bipolaires, horizontales et amacrines, puis transmis aux cellules ganglionnaires rétiniennes....

Protocole

Les soins de la souris et toutes les procédures expérimentales ont été effectués conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health pour les animaux de laboratoire et ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’Oakland (protocole no 18071).

NOTA : Les noms des solutions et de leurs compositions sont indiqués dans le tableau 1.

1. Préparation des tissus

1. Euthanasier la souris avec un surdosage de CO₂, suivi d’une luxation cervicale.
2. Enucleate les yeux avec des pinces incurvées et les tran....

Résultats

Les rétines modifiées traitées par CLARITY sont des tissus optiquement transparents.
Pour formuler une méthode de nettoyage des tissus compatible avec les applications immunohistochimiques dans la rétine tout en fournissant une délidation adéquate et en conservant l’intégrité structurelle des protéines cellulaires, nous avons adapté la méthode de nettoyage des tissus CLARITY aux rétines de souris à montage entier. Nous avons pu simplifier le protocole et le modifier pour les rétines à montage entier (.......

Discussion

Modification du protocole CLARITY pour les rétines à monture entière.
Nous avons simplifié le protocole CLARITY pour obtenir une polymérisation adéquate sans avoir besoin d’une chambre d’évacuation sous vide ou de dessiccation, comme cela est utilisé dans la plupart des études précédentes^7,9,11. Le processus de polymérisation est inhibé par l’oxygène, ce qui nécessite que l’échantillon soit isolé de l’air pen.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 % Paraformaldéhyde	Microscopie électronique Sciences	15710
Fixateur Acrylamide	Fisher Biotech	BP170	Hydrogel monomère
Axio Imager.Z2	Zeiss		Microscope à fluorescence
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Agent bloquant
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Balayage confocal microscope
KCl	VWR	BDH0258	Composant tampon
KH2PO4	Sigma	P5655	Composant tampon
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Composant tampon
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Composant tampon
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Composant tampon
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Conservateur bactériostatique
NDS	Aurion	900.122	Agent
bloquant NIS Elements AR Logiciel d’analyse d’images
SDS	BioRad	1610301	Agent de délipidation
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Composant tampon
Triton-X-100	Sigma	T8787	Tensioactif
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Tensioactif
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Initiateur thermique

Nikon