Article de méthode

Estimation des nanocristaux urinaires chez l’homme à l’aide de l’étiquetage des fluorophores de calcium et de l’analyse de suivi des nanoparticules

DOI :

10.3791/62192

⸱

9 février 2021

 ,  , 
1Department of Urology, University of Alabama at Birmingham

Dans cet article

Résumé

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L’objectif de cette étude était de déterminer si l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pouvait détecter et quantifier les nanocristaux urinaires contenant du calcium provenant d’adultes en bonne santé. Les résultats de la présente étude suggèrent que le NTA pourrait être un outil potentiel pour estimer les nanocristaux urinaires pendant la maladie des calculs rénaux.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les calculs rénaux sont de plus en plus répandus dans le monde entier chez les adultes et les enfants. Le type le plus commun de calcul rénal est composé de cristaux d’oxalate de calcium (CaOx). La cristallurie survient lorsque l’urine devient sursaturée avec des minéraux (p. ex. calcium, oxalate, phosphate) et précède la formation de calculs rénaux. Les méthodes standard pour évaluer la cristallurie dans les formeurs de pierre incluent la microscopie, la filtration, et la centrifugation. Cependant, ces méthodes détectent principalement les microcristaux et non les nanocristaux. Les nanocristaux ont été suggérés comme plus nocifs pour les cellules épithéliales rénales que les microcristaux in vitro. Ici, nous décrivons la capacité de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) à détecter les nanocristaux urinaires humains. Des adultes en bonne santé ont été alimentés un régime contrôlé d’oxalate avant de boire une charge d’oxalate pour stimuler des nanocristaux urinaires. L’urine a été rassemblée pendant 24 heures avant et après la charge d’oxalate. Les échantillons ont été traités et lavés à l’éthanol pour purifier les échantillons. Des nanocristaux urinaires ont été souillés avec le fluorophore de liaison de calcium, Fluo-4 AM. Après coloration, la taille et le nombre de nanocristaux ont été déterminés à l’aide de NTA. Les résultats de cette étude montrent que le NTA peut détecter efficacement la nanocristallurie chez les adultes en bonne santé. Ces résultats suggèrent que le NTA pourrait être une méthode de détection précoce valable de nanocristalluria dans les patients présentant la maladie de calcul rénal.

Introduction

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Les cristaux urinaires se forment lorsque l’urine devient sursaturée de minéraux. Cela peut se produire chez les personnes en bonne santé, mais est plus fréquent chez les personnes atteintes de calculs rénaux1. La présence et l’accumulation de cristaux urinaires peuvent augmenter le risque de développer un calcul rénal. Plus précisément, cela se produit lorsque les cristaux se lient à la plaque de Randall, se nucléent, s’accumulent et se développent au fil du temps2,3,4. La cristallurie précède la formation de calculs rénaux et l’évaluation de la cristallurie peut avoir une valeur prédictive dans les calculs rénaux3,5. Spécifiquement, le crystalluria a été suggéré pour être utile pour prévoir le risque de répétition de pierre dans les patients présentant une histoire d’oxalate de calcium contenant des pierres6,7.

Il a été rapporté que les cristaux ont un impact négatif sur la fonction épithéliale rénale et circulante des cellules immunitaires8,9,10, 11,12,13. On l’a précédemment rapporté que les monocytes de circulation de l’oxalate de calcium (CaOx) les formers de calcul rénal ont supprimé la bioénergétique cellulaire comparée aux individus en bonne santé14. De plus, les cristaux de CaOx réduisent la bioénergétique cellulaire et perturbent l’homéostasie redox dans les monocytes8. La consommation de repas riches en oxalate peut provoquer une cristallurie qui pourrait entraîner des dommages aux tubules rénaux et altérer la production et la fonction des macromolécules urinaires qui protègent contre la formation de calculs rénaux15,16. Plusieurs études ont démontré que les cristaux urinaires peuvent varier en forme et en taille en fonction du pH et de la température de l’urine17,18,19. De plus, il a été démontré que les protéines urinaires modulent le comportement cristallin20. Daudon et coll.19, ont proposé que l’analyse de la cristallurie pourrait être utile dans la prise en charge des patients atteints de maladie des calculs rénaux et dans l’évaluation de leur réponse aux thérapies. Quelques méthodes classiques actuellement disponibles pour évaluer la présence de cristaux comprennent la microscopie polarisée21,22,la microscopie électronique23,les compteurs de particules3,la filtration d’urine24,l’évaporation3,5 ou la centrifugation21. Ces études ont fourni la perspicacité valable au champ de calcul rénal concernant le crystalluria. Cependant, une limitation de ces méthodes a été l’incapacité de visualiser et de quantifier les cristaux de moins de 1 μm. Des cristaux de cette taille peuvent influencer la croissance des pierres de CaOx en se fixant à la plaque de Randall.

Il a été démontré que les nanocristaux causent des lésions importantes aux cellules rénales par rapport aux microcristaux plus grands25. La présence de nanocristaux a été signalée dans l’urine à l’aide d’un analyseur de nanoparticules26,27. Des études récentes ont utilisé des sondes bisphosphate marqués par fluorescence (alendronate-fluorescéine/alendronate-Cy5) pour examiner des nanocristaux à l’aide de la cytométrie en flux à l’échelle nanométrique28. La limitation de ce colorant est qu’il n’est pas spécifique et se liera à presque tous les types de calculs à l’exception de la cystéine. Ainsi, évaluer avec précision la présence de nanocristaux chez les individus peut être un outil efficace pour diagnostiquer la cristallurie et/ou prédire le risque de pierre. Le but de cette étude était de détecter et de quantifier les nanocristaux contenant du calcium (<1 μm) à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Pour ce faire, la technologie NTA a été utilisée en combinaison avec un fluorophore liant le calcium, Fluo-4 AM pour détecter et quantifier les nanocristaux contenant du calcium dans l’urine d’adultes en bonne santé.

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Protocole

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Toutes les expériences décrites dans ce travail ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de l’Alabama à Birmingham (UAB). Des adultes en bonne santé (33,6 ± 3,3 ans; n = 10) ont été inscrits à l’étude s’ils avaient un panel métabolique complet sanguin normal,des consommateurs non-tabac, non enceintes, un IMC compris entre 20 et 30 kg/m2 et exempts de problèmes de santé chroniques ou de maladies aiguës. Les participants en bonne santé ont signé un formulaire de consentement éclairé écrit avant le début de l’étude.

1. Protocole clinique et prélèvement d’urine

  1. Demandez aux participants de consommer un régime pauvre en oxalate préparé par le UAB Center for Clinical and Translational Sciences Bionutrition Core pendant 3 jours et de jeûner pendant la nuit avant de prélever leur urine (échantillon de 24 heures).
  2. Le lendemain, demandez aux participants de retourner leur échantillon d’urine de 24 heures (pré-oxalate) avant de consommer une charge d’oxalate (smoothie contenant des fruits et des légumes, ~ 8 mM d’oxalate). Demandez aux participants de prélever leur urine pendant 24 heures (échantillon post-oxalate) et de retourner leur urine le lendemain.
  3. Maintenir tous les échantillons d’urine à température ambiante (RT) avant le traitement, comme décrit ci-dessous et illustré à la figure 1.

2. Traitement de l’urine

NOTA : Tous les matériaux et équipements utilisés sont énumérés dans le Tableau des matériaux.
ATTENTION : Portez de l’équipement de protection individuelle en tout temps lorsque vous manipulez des échantillons cliniques et des réactifs. Plus précisément, les gants, les écrans faciaux et oculaires, les protections respiratoires et les vêtements de protection.

  1. Mesurer et enregistrer le pH et le volume de l’urine. Bien mélanger avant d’ajouter 50 mL d’urine dans un tube conique stérile marqué de 50 mL.
  2. Échantillon de centrifugeuse à 1200 x g pendant 10 min à RT à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse.
    REMARQUE: Conservez l’échantillon à RT pour éviter la formation de cristaux supplémentaires car des températures plus fraîches peuvent favoriser la cristallisation.
  3. Jetez le surnageant et lavez et ressuscitez le culot avec 5 mL d’éthanol à 100 %. Centrifuger l’échantillon à 1200 x g pendant 10 minutes à RT à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse.
  4. Jeter le surnageant et le ressusciter dans 1 mL d’éthanol à 100 %. Conserver l’échantillon à -20 °C pour un traitement ultérieur OU colorer l’échantillon comme décrit ci-dessous.
    NOTA : Il n’y a pas de différence significative dans les points de données (c.-à-d. la taille/concentration des particules) entre les échantillons entreposés ou fraîchement colorés.

3. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)

  1. Préparation de l’échantillon
    1. Nanoparticules d’or : Utilisez des nanoparticules d’or pour optimiser les paramètres de l’instrument. Diluer les nanoparticules d’or de taille 100 nm 1:1000 dans de l’eau ultrapure.
    2. Urine humaine: Diluer les échantillons d’urine 20 fois dans l’eau avant de tacher avec 5 mM Fluo-4 AM (un colorant de fluorescence du calcium) pendant 30 min dans l’obscurité. Analysez les échantillons à l’aide de NTA.
    3. Préparer les cristaux d’oxalate de calcium (CaOx) comme décrit précédemment29. Diluer la solution mère de 10 mM (14,6 mg dans 10 mL d’eau) à 50 μM dans l’eau et colorer les échantillons dilués à l’aide de 5 mM de Fluo-4 AM pendant 30 min dans l’obscurité avant l’analyse.
    4. Cristaux de phosphate de calcium (CaP) : Diluer la solution mère de 10 mM (50,4 mg dans 10 mL d’eau) à 50 μM dans l’eau et colorer les échantillons dilués à l’aide de 5 mM de Fluo-4 AM pendant 30 min dans l’obscurité avant l’analyse du NTA.
  2. Configuration de l’instrument, paramètres de la caméra et collecte de données
    Remarque : l’ordinateur et la configuration de l’instrument utilisés pour cette méthode sont illustrés à la figure 2.
    1. Allumez l’ordinateur, puis l’instrument. Ouvrez le logiciel et allumez l’appareil photo.
    2. Une fois la fenêtre du logiciel ouverte, cliquez sur l’icône de capture dans le coin supérieur gauche de la fenêtre pour démarrer le mode de capture. L’initialisation de la caméra prend quelques secondes.
    3. Nettoyez la plate-forme en y pompant d’abord de l’air à l’aide d’une seringue de 1 mL jusqu’à ce que la plate-forme semble propre. Ajoutez doucement de l’eau à l’appareil 2-3 fois à l’aide d’une autre seringue de 1 mL pour éliminer les bulles d’air.
      REMARQUE: Recherchez les bulles d’air dans la plate-forme ainsi que dans le tube. Il est important de ne pas avoir de bulles dans tout l’appareil avant et pendant l’exécution des échantillons. Si des bulles sont présentes, nettoyez à nouveau la plate-forme avec de l’air et de l’eau.
    4. Une fois que la plate-forme est propre, ajoutez de l’eau pour vérifier toute contamination à la surface en regardant la caméra. Ensuite, ajoutez des nanoparticules d’or comme contrôle à l’injecteur de la pompe de chargement de l’échantillon pour configurer l’instrument.
    5. Réglez le niveau de la caméra sur l’écran ou sur le bouton sur le côté droit de l’instrument jusqu’à ce que l’image commence à afficher des pixels colorés, puis réduisez le niveau de la caméra.
    6. Ajustez ensuite l’écran pour optimiser l’image. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’image vidéo. Maintenez le bouton gauche de la souris et faites glisser l’image de haut en bas pour obtenir la vue entière.
      REMARQUE: L’objectif et le filtre normaux de la caméra sont utilisés pour évaluer les nanoparticules d’or et les échantillons non colorés.
    7. Configurez la vitesse de perfusion et concentrez la caméra de sorte que les nanoparticules d’or soient visibles sur l’écran de la caméra. Régler la vitesse de perfusion à élevée (c.-à-d. 500 μL/min) pour la configuration initiale afin de s’assurer que les nanoparticules d’or sont détectées. Une fois détecté, réduisez la vitesse à 50 μL/min.
    8. Ajustez le niveau de la caméra pour visualiser les particules. Pour les échantillons non colorés, ajustez le gain d’écran au niveau 5 pour atteindre la mise au point de la caméra et réglez le niveau de la caméra à 8. Une fois la mise au point définie, enregistrez l’échantillon (c.-à-d. 1 mesure pendant 60 secondes seulement).
      REMARQUE: La mise au point et la vitesse d’écoulement continu sont importantes pour obtenir des images claires et nettes des particules pour le comptage.
    9. Après optimisation, nettoyez à nouveau l’appareil avec de l’eau avant d’évaluer les échantillons. Visualisez la caméra pour vous assurer que le tube est propre et que les particules ne sont pas présentes.
      REMARQUE: Lavez la chambre entre chaque échantillon jusqu’à ce qu’aucune particule ne soit détectée par la caméra.
    10. Pour analyser les échantillons colorés, ajustez la caméra à la position du filtre contenant le filtre fluorescent approprié. Chargez les échantillons dilués et colorés sur l’injecteur de la pompe de chargement de l’échantillon et réduisez la vitesse à 20 μL/min pour l’analyse de l’échantillon.
    11. Ajustez ensuite le gain d’écran et le niveau de la caméra car ce sont des paramètres importants. Pour les échantillons colorés (fluorescents), réglez le gain d’écran sur 5 et le niveau de la caméra au niveau 13.
      Remarque : ces paramètres varient en fonction du type d’échantillon et chaque échantillon devra être optimisé pour obtenir le focus.
    12. Utilisez la mesure standard pour mesurer les échantillons pour 5 captures par échantillon où une durée de capture est de 60 secondes.
    13. Enregistrez et stockez les données après chaque mesure. Le logiciel enregistrera des fichiers image et vidéo pour chaque mesure. Le logiciel fournit des données de sortie (par exemple, la taille du cristal: 10 nM - 1000 nM et la concentration) aux formats Excel et PDF.
    14. Calculer le nombre moyen de nanoparticules pour les 5 lectures pour chaque échantillon individuel. Analysez les données à l’aide de l’écart type ou de l’erreur type de la moyenne et utilisez des tests t pour l’analyse appariée.

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Résultats

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Les résultats de cette étude montrent que le NTA peut détecter efficacement la taille et la concentration moyennes de nanocristaux urinaires contenant du calcium dans l’urine humaine. Ceci a été réalisé en utilisant le fluorophore, Fluo-4 AM, et l’analyse de suivi des nanoparticules. Fluo-4 AM a pu se lier aux cristaux de CaOx et de CaP. Comme le montre la figure 3A,on a déterminé que les cristaux de CaOx avaient une taille comprise entre 50 et 270 nm et qu’ils avaient une concentration moye...

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Discussion

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Le NTA a été utilisé dans la présente étude pour évaluer les nanocristaux dans l’urine humaine à l’aide d’une sonde de liaison au calcium, Fluo-4 AM. Il n’existe pas de méthode standard pour détecter les nanocristaux dans l’urine. Certains groupes de recherche ont détecté des nanocristaux dans l’urine et se sont appuyés sur l’utilisation de protocoles ou de méthodes étendus qui sont limités dans leur capacité à quantifier les échantillons27,28. Cette étude montre...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Les auteurs remercient tous les participants à l’étude ainsi que le centre de bionutrition et le centre de services d’imagerie haute résolution de l’UAB CCTS pour leurs contributions. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH DK106284 et DK123542 (TM), et UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Centrifugeuse de paillasseCentrifugeuse JouanCR3-12
Oxalate de calcium monohydratésynthétisé en laboratoire comme décrit précédemment 29. Magasin chez RT ; Stock 10 mM
de cristaux de phosphate de calcium (nanopoudre d’hydroxyapatite)Sigma677418Store chez RT ; Stock 10 mM
d’éthanolFischer ScientificAC615095000Store chez RT ; Stock 100 %
Fluo-4 AM*AAT Bioquest, Inc.20550Conserver au congélateur (-20° ; C); Stock 5 mM
nanoparticulesd’or Sigma742031Stocker à 2-8° ; C
NanoSight InstrumentMalvern Instruments, Royaume-UniNS300
Pompe à seringueHarvard Apparatus98-4730
Virkon DisinfectantLanXESS Energizing Company, AllemagneLSP
*Les colorants à fluorescence sont sensibles à la lumière ; le stock et les aliquotes doivent être stockés dans l’obscurité à -20° ;C.
de

Références

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Mots-clés

Formation de calculs r nauxCristaux d oxalate de calciumD tection de la cristallurieUrine de 24 heuresNanoparticules d orLavage l thanolMarquage au Fluo 4 AM

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