Etudes à haute résolution de protéines dans des membranes naturelles par RMN à l’état solide

Résumé

Ce travail détaille des routines de base robustes sur la façon de préparer des échantillons de protéines membranaires marquées par des isotopes et de les analyser à haute résolution avec des méthodes modernes de spectroscopie RMN à l’état solide.

Résumé

Les protéines membranaires sont vitales pour le fonctionnement cellulaire et représentent donc des cibles médicamenteuses importantes. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire à l’état solide (RMNss) offre un accès unique pour sonder la structure et la dynamique de ces protéines dans des membranes biologiques de complexité croissante. Ici, nous présentons la spectroscopie RMN moderne à l’état solide comme outil pour étudier la structure et la dynamique des protéines dans les membranes lipidiques naturelles et à l’échelle atomique. De telles études spectroscopiques bénéficient de l’utilisation de méthodes de RMNs s à haute sensibilité, c’est-à-dire de RMNs en ss détectées par des protons (¹H) et de RMN en RSN (polarisation nucléaire dynamique) soutenue par la DNP. En utilisant la protéine bêta-baril de la membrane externe bactérienne BamA et le canal ionique KcsA, nous présentons des méthodes pour préparer des protéines membranaires marquées par isotope et pour obtenir des informations structurales et motrices par RMNs.

Introduction

Les études structurales et motrices des protéines membranaires dans des environnements physiologiquement pertinents posent un défi aux techniques traditionnelles de biologie structurale¹. Les méthodes modernes de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire à l’état solide (RMNs) offrent une approche unique pour la caractérisation des protéines membranaires^{2, 3, 4, 5, 6, 7} et sont utilisées depuis longtemps pour étudier les protéines membranaires, y compris les pompes à protéines intégrées à membrane⁸, les canaux^{9, 10, 11} ou les récepteurs^{12, 13,14,15}. Les progrès techniques tels que les champs magnétiques ultra-élevés >1 000 MHz, les fréquences de rotation à angle magique rapide >100 kHz et les techniques d’hyperpolarisation¹⁶ ont fait de la RMNs une méthode puissante pour l’étude des protéines membranaires dans des environnements de complexité croissante allant des liposomes aux membranes cellulaires et même aux cellules entières. Par exemple, le DNP est devenu un outil puissant pour de telles expériences (voir référence 17,18,19,20,21,22,23,24,25). Plus récemment, la ssNMR détectée à ¹H offre des possibilités croissantes pour étudier les protéines membranaires à haute résolution spectrale et sensibilité 25,26,27,28,29. Ce travail met en évidence deux protéines membranaires bactériennes impliquées dans des fonctions essentielles, à savoir l’insertion des protéines et le transport des ions. Les protéines correspondantes, BamA 25,30,31,32,33 et KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (ou des variantes chimériques de celles-ci ^10,40) ont été examinées par ssNMR méthodes depuis plus d’une décennie.

Un protocole représentatif pour la préparation et la caractérisation par RMNs des protéines membranaires d’origine bactérienne est présenté ici. Les différentes étapes du protocole sont illustrées à la figure 1. Tout d’abord, l’expression, le marquage isotopique, la purification et la reconstitution membranaire de BamA sont expliqués. Ensuite, un flux de travail général pour la caractérisation de la protéine membranaire par RMN ss est présenté ; plus précisément, l’attribution de squelettes de protéines membranaires à l’aide de la ssNMR détectée par ¹H à un spinning à angle magique rapide. Enfin, la configuration de base et l’acquisition d’expériences soutenues par la polarisation nucléaire dynamique (DNP), qui augmentent considérablement la sensibilité du signal RMNs, sont détaillées.

Protocole

1. Production de BamA-P4P5 étiquetés uniformément ²H, ¹³C, ¹⁵N

REMARQUE : Bien que ce protocole exige de travailler avec des bactéries à Gram négatif non pathogènes, le respect des procédures de sécurité biologique de base est indispensable, à savoir le port de lunettes de sécurité, de blouses de laboratoire, de gants et le respect des procédures opérationnelles standard de l’établissement pour le travail avec des micro-organismes.

1. Utiliser une seule colonie d’E. coli BL 21 Star (DE3) contenant le plasmide pET11aΔssYaeT codant pour E. coli BamA-P4P5 pour inoculer 50 mL de bouillon de Lysogeny complété par 50 μg/L d’ampicilline.
2. Cultivez la culture à 37 °C à 200 tr/min jusqu’à ce qu’une OD₆₀₀ de 0,6 soit atteinte. Essorage à 2 000 x g pendant 10 min. Remettre la pastille en suspension dans 50 mL de M9 (voir tableau 1) jusqu’à une DO maximale de₆₀₀ de 0,1.
   REMARQUE : Toutes les étapes de croissance futures se déroulent aux conditions énoncées ci-dessus, sauf indication contraire.
3. Cultivez la culture jusqu’à OD₆₀₀ de 0,5. Essorer à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Remettre la pastille en suspension dans 50 mL de M9 contenant 90 % de D₂O (voir le tableau 1 pour la recette) jusqu’à une DO maximale de₆₀₀ de 0,1. Cultivez la culture pendant la nuit à 30 °C à 200 tr/min.
4. Faites tourner la culture à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Remettre la pastille en suspension dans les 50 mL préchauffés à 90 % D₂O M9 jusqu’à une DO_{maximale de 600} de 0,1. Croître jusqu’à ce qu’un OD₆₀₀ de 1,0 soit atteint.
5. Faites tourner la culture à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Préparez 100 ml de milieu 100 % D₂O M9 avec des quantités enrichies en isotopes de glucose non enrichi et de chlorure d’ammonium. Remise en suspension à 100 % D₂O M9 milieu jusqu’à un maximum OD₆₀₀ de 0,1. Cultivez jusqu’à ce qu’un OD₆₀₀ de 0,7 soit atteint.
6. Faites tourner la culture à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 mL de milieu 100 % D₂O M9 avec des isotopes (voir le tableau 1) jusqu’à un maximum de_{DO 600} de 0,1.
7. Laissez la culture croître jusqu’à ce qu’une OD₆₀₀ de 0,6-0,9 soit atteinte. Induire avec 1 mM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Exprimer pendant 4 h et récolter les cellules à 4 000 x g pendant 15 min à température ambiante.

2. Purification, repliement et formation de protéo-liposomes BamA-P4P5

REMARQUE : Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées dans une hotte. Une prudence particulière doit être portée lors de l’ouverture des tubes après la centrifugation pour limiter les aérosols nocifs.

1. Décongelez la pastille sur de la glace. Remettre la pastille en suspension dans 20 mL de tampon 1 froid. Voir le Tableau 2 pour les tampons.
2. Faites tourner la solution à 4 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Remettre la pastille en suspension dans 20 mL de H₂O distillé à froid. Laisser incuber la suspension sur de la glace pendant 10 min.
3. Faites tourner la suspension à 4 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Remettre en suspension dans 10 mL de tampon froid 2 et laisser incuber sur de la glace pendant 30 min.
4. Complétez le mélange avec 10 ml supplémentaires de tampon froid 2 et incubez pendant 30 minutes supplémentaires sur de la glace. Ajouter 0,5 % de n-Dodécyl-B-D-Maltoside (DDM) et agiter doucement.
5. Sonicer l’échantillon sur de la glace à 13 kHz jusqu’à ce que des impulsions marche/arrêt de 10 s soient utilisées de manière vicieuse. Faites tourner à 25 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Laver trois fois avec 20 ml de tampon 3. Centrifugeuse à 25 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
6. Remettez la pastille en suspension dans 20 mL de tampon 4. Incuber à 37 °C pendant 30 min. Soniquer l’échantillon sur de la glace à 13 kHz, jusqu’à ce que des impulsions marche/arrêt de 10 s de longue durée soient dégagées.
7. Faites tourner l’échantillon à 25 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Répéter les étapes 2.4 à 2.6 en omettant l’ajout d’inhibiteur de protéase et l’incubation à 37 °C.
8. Lavez la pastille avec 20 ml d’eau et deux fois avec le tampon 3. Faites tourner à 25 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Aliquote la suspension dans des tubes de microcentrifugation de 1 mL et faites tourner les tubes de microcentrifugation à vitesse maximale sur une centrifugeuse de paillasse pendant 20 min. La pureté du corps de l’inclusion est évaluée par un gel SDS-Page à 10 %, voir Figure 2A. Le rendement attendu du BamA-P4P5 purifié trois fois (²H, ¹³C, ¹⁵N) étiqueté est de 30 mg/L.
9. Solubiliser les corps d’inclusion dans 200 μL de tampon 5 et 300 μL de H₂O. Ajouter du chlorure de guanidium 6M (GdnCl). Ajustez le volume du tube de microcentrifugation à 1 mL avec H₂O. Vortex le mélange et incubez pendant 4 h à température ambiante. Vortex les tubes de microcentrifugation périodiquement (toutes les 30 min).
10. Essorage à 100 000 x g pendant 1 h à 4 °C. Utilisez la loi de Beer-Lambert pour déterminer la concentration en protéines à 280 nm. Le coefficient d’extinction molaire est de 117 120 ^{M-1 cm-1}. Si la concentration est de >100 μM, diluer avec 1x Buffer 5 avec 6 M GdnCl. Diluer rapidement la protéine 10x dans Buffer 6. Incuber le mélange pendant la nuit à température ambiante.
    REMARQUE : Pour l’ultracentrifugation, utilisez des tubes de 1,5 ml de qualité ultracentrifugation.
11. Déterminez l’efficacité du repliement à l’aide d’un gel SDS-Page semi-natif. Prenez deux aliquotes de 10 μL de l’étape 2.10 et ajoutez 10 μL de tampon Lameili (tampon 8) à chaque aliquote. Faire bouillir un échantillon pendant 10 min à 95 °C ; Laissez l’autre aliquote sur de la glace. Ensuite, analysez les deux échantillons à 14 mA sur un gel SDS-Page à 10 %. Les parties d’empilement et de fonctionnement des gels manquent d’agent réducteur et de SDS. La coloration des protéines est réalisée à l’aide du colorant Coomassie. Les résultats attendus sont présentés à la figure 2B.
12. Faites tourner l’échantillon à 4 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Concentrez l’échantillon sur un volume de travail de 8 mL à l’aide d’un filtre centrifuge de 30 kDa. Faites tourner l’échantillon à 4 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Mesurer l’absorbance des protéines à 280 nm. Comme à l’étape 2.10, déterminez la concentration en protéines.
13. Calculez la quantité de lipides nécessaire pour obtenir un rapport lipides/protéines de 10:1 (LPR-mol/mol). À partir d’un stock de chloroforme, ajouter la quantité requise de lipides, calculée à l’étape 2.12, dans une fiole à fond rond de 100 mL. Évacuez le chloroforme du FBR sous un léger jet d’azote. Placez RBF sous vide poussé pendant 3 h. Hydratez le film lipidique avec 1 mL de tampon 7. Incuber le RBF pendant 10 min à 37 °C.
14. Ajouter le mélange de protéines (de l’étape 2.12) au FBR.
15. Diluer le mélange protéines/lipides (à partir de l’étape 2.14) jusqu’au volume final de 50 mL dans le FBR. Utilisez Buffer 7 complété par 1x inhibiteur de protéase dissous dans du DMSO et incubez pendant 30 min à 37 °C.
16. Dialalysez contre 100 volumes de Buffer 7 pendant 2 semaines (utilisez une tubulure de dialyse de 12 à 14 kDa de poids moléculaire). Pendant les premières 24 heures, effectuez la dialyse à température ambiante avec l’ajout de tampon 7 frais toutes les 8 heures. Ensuite, changez le tampon une fois par jour et effectuez une dialyse à 4 °C.

3. Remplissage du rotor ssNMR

1. Après l’étape 2.16, centrifuger pendant 30 à 60 min à 10 000 x g à 4 °C afin de former une pastille. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : La technique décrite ci-dessous a été optimisée pour un rotor de 3,2 mm, mais elle est applicable à presque tous les diamètres de rotor.
2. Pipetez l’échantillon dans le rotor et faites-le tourner doucement avec une centrifugeuse de table.
   REMARQUE : Selon la consistance de l’échantillon, on peut utiliser soit un outil de densification pour compacter l’échantillon, soit une spatule au lieu d’une pipette pour mettre l’échantillon dans le rotor.
3. Répétez ce processus 2 à 3 fois jusqu’à ce que le rotor soit rempli à la bonne hauteur et vérifiez s’il reste suffisamment d’espace pour le capuchon, comme indiqué par la ligne de marquage sur l’outil de densification. Fermez le rotor à l’aide de l’outil de positionnement du capuchon sur une surface plane. Marquez la moitié du bord inférieur du rotor.
   REMARQUE : Les nouvelles générations de rotors ssNMR sont livrées avec une marque laser durable sur le bord inférieur pour la détection optique de la fréquence de rotation du rotor. Sinon, l’utilisation d’un stylo sharpie est suggérée ; car le détecteur MAS a été optimisé spécifiquement pour l’encre Sharpie.
4. À l’aide d’une loupe, vérifiez si le capuchon est bien placé.

4. Caractérisation de l’échantillon par spectroscopie RMN 2D ^{13 C-13}C ssNMR

1. Insérez le rotor dans l’aimant, en utilisant la routine de rotation automatique de l’unité MAS, faites tourner l’échantillon jusqu’à la fréquence MAS souhaitée entre 10 et 20 kHz MAS tout en refroidissant l’échantillon à la température de consigne de 270 K. Réglez et faites correspondre les canaux ¹H et ¹³C.
   REMARQUE : Pour le choix de la fréquence MAS, évitez de faire correspondre accidentellement la distance de décalage chimique entre la région spectrale Cα et la région carbonyle à la fréquence de rotation, c’est-à-dire évitez la condition de résonance rotationnelle du premier ordre⁴¹.
2. Optimiser une expérience de polarisation croisée ^{1 H-13}C⁴² (CP) en faisant varier la puissance RF sur le canal du proton de 25 à 80 kHz. Les paramètres typiques sont une puissance RF de 45 kHz sur ¹³C, un découplage hétéronucléaire de ⁸⁰à 100 kHz, un découplage en H^{de 43} pendant l’acquisition, un délai de recyclage de 1,8 à 2,0 s et 64 balayages.
   1. Optimiser le temps de contact CP pour une sensibilité maximale du signal sur les carbones aliphatiques.
   2. Déterminer la longueur d’impulsion ^{de 1}H à 90° dans l’expérience ¹³C-CP en multipliant l’impulsion de départ par quatre, c’est-à-dire en optimisant une impulsion de 360°, et faire varier la longueur jusqu’à ce que le signal ait disparu. Inclure une impulsion rectangulaire directement après le transfert CP et optimiser la longueur d’impulsion de ¹³°C à 90° de manière analogue.
3. Exécutez une expérience de type diffusion de spin induite par des protons (PDSD) 2D ^{13 C-13}C telle que PARIS avec un temps de transfert d’aimantation de 30 ms pour détecter les corrélations intra-résiduelles et évaluer la qualité de l’échantillon. Transférez les niveaux de puissance, le temps de contact et les longueurs d’impulsion à 90° de l’expérience ¹³C-CP précédemment optimisée. Utilisez un temps d’acquisition de 4 à 6 ms dans la dimension indirecte. Traiter le spectre avec des fonctions de cloche de sinus carré (QSIN) ou, pour les échantillons insensibles, un élargissement exponentiel des raies dans les deux dimensions.
4. Extrayez des tranches de pics croisés isolés et déterminez la largeur de ligne à mi-hauteur. Une largeur de raie comprise entre ~0,3 et 1,0 ¹³C ppm est indicative d’un échantillon bien ordonné, idéal pour la caractérisation de la RMNs, tandis qu’une largeur de raie supérieure à 1,0 ¹³C ppm est indicative d’une hétérogénéité conformationnelle qui peut compromettre la caractérisation de la RMNs. Le spectre 2D CC PARIS de BamA illustré à la figure 3A est un exemple de protéine bien ordonnée qui donne des spectres de haute qualité.

5. Affectation du squelette par spectroscopie ssNMR 3D détectée en ^H

1. Acquisition d’empreintes spectrales NH 2D
   1. Remplissez l’échantillon dans un rotor de 1,3 mm, comme décrit ci-dessus. Insérez le rotor dans l’aimant, faites tourner l’échantillon à une MAS de 10-20 kHz et refroidissez l’échantillon à une température de consigne de 240-250 K ou moins, selon les spécifications de la tête de sonde ssNMR. Utilisez l’interface de l’unité MAS pour augmenter progressivement la fréquence MAS par paliers de 5 kHz à 60 kHz.
   2. Optimisez les amplitudes CP, les temps de contact et les longueurs d’impulsion à 90° dans des expériences CP ¹³C et ¹⁵N. Utilisez des amplitudes d’environ 30-50 ou 70-100 kHz sur les canaux hétéronucléaires et faites varier l’amplitude sur le canal ¹H de 80-180 kHz. Utilisez un délai de recyclage de 0,7 à 1,2 s, ainsi qu’un découplage de protons hétéronucléaires de faible puissance de 15 kHz⁴⁴. Voir également la référence⁴⁵ pour plus de détails pratiques sur la façon de configurer les expériences CP ssNMR.
   3. Acquérez une expérience NH 2D pour évaluer la résolution de ¹H. Transférez les ¹⁵paramètres N-CP et utilisez un temps d’acquisition d’environ 15 et 25 ms dans les dimensions directes et indirectes. Pour le premier transfert de ¹H à ¹⁵N CP, utilisez le temps de contact préalablement optimisé. Pour le rétrotransfert de ¹⁵N à ¹H, utilisez un temps de contact de 0,7 à 1,0 ms pour minimiser le transfert de magnétisation interrésiduel.
   4. Utiliser une eau de 50 à 250 ms MISSISSIPPI^{suppression 46}, en fonction de la teneur en eau de l’échantillon. Traitez le spectre avec des fonctions de cloche de péché au carré (QSIN) dans les deux dimensions. Extrayez des tranches de pics croisés isolés et déterminez la largeur de ligne à mi-hauteur. La figure 3B montre un exemple de spectre NH^2D de haute qualité pour le BamA-P4P5 intégré à membrane.
2. Affectations de l’épine dorsale
   1. Optimiser une expérience de CP spécifique 1D ¹⁵N à ¹³Cα⁴⁷. Placez le support ¹³C au milieu de la région Cα, autour de 55 ppm. Utilisez une amplitude rf ¹³C de 20 kHz et faites varier l’amplitude ¹⁵N de 35 à 45 kHz pour un transfert maximal vers les signaux Cα et un transfert minimal vers les signaux carbonyles. Optimisez le temps de contact de 3 à 10 ms par incréments de 1 ms.
   2. Exécutez une expérience 3D sur le CαNH. Transférez toutes les amplitudes CP, les temps de contact et les longueurs d’impulsion des étapes précédemment optimisées. Utilisez environ 10 ms et 30 ms dans les dimensions d’acquisition indirecte et directe. Traitez le spectre avec des fonctions de cloche de péché carrées (QSIN) dans les trois dimensions.
   3. Optimiser un transfert d’aimantation 1D Cα vers CO DREAM⁴⁸. Commencez par un transfert de CP spécifique de ¹⁵N à ¹³Cα. Ensuite, transférez l’aimantation de Cα à CO à l’aide d’un verrou de spin sur le canal ¹³C. Variez l’amplitude rf de 20 à 35 kHz pour un transfert optimal. Optimisez le temps de transfert de 4 à 10 ms.
   4. Effectuez une expérience 3D sur le Cα(CO)NH. Transférez toutes les amplitudes rf, les temps de contact et les longueurs d’impulsion des étapes précédemment optimisées. Utilisez environ 10 ms et 30 ms dans les dimensions d’acquisition indirecte et directe. Traitez le spectre avec des fonctions de cloche de péché carrées (QSIN) dans les trois dimensions.
   5. Répétez et adaptez les étapes 1 à 4 pour les expériences 3D analogues CONH et CO(Cα)NH. Utilisez ce quatuor d’expériences 3D pour des promenades séquentielles de Cα et de CO afin d’attribuer le squelette protéique, comme le montre l’exemple de KcsA dans la figure 4²⁸.

6. Dynamique des ^{protéines par}spectroscopie ssNMR 1 H détectée

1. Pour les études ¹⁵N T₁ , utilisez l’expérience NH 2D précédemment optimisée à 60 kHz MAS et incluez un retard après le premier pas de polarisation croisée ¹H à ¹⁵N. Acquérez une série d’expériences NH 2D et faites varier le retard de 0 à 16 s en utilisant des pas de, par exemple, 0, 2, 4, 8 et 16 s.
2. Tracez les intensités normalisées des signaux résolus en fonction de l’augmentation du temps de retard. Ajustez la décroissance T₁ à des exponentielles simples selon y = exp^(-x/T1), y étant l’intensité du signal au temps de décroissance x.
3. De même, pour les études ¹⁵N T_1rho, inclure une impulsion de verrouillage de spin dans le programme d’impulsions sur le canal ¹⁵N avec une amplitude rf comprise entre 15 et 20 kHz après le premier pas de ^{polarisation croisée de 1}H à ¹⁵N^26,49. Acquérez une série d’expériences NH 2D et faites varier le retard de 0 à 150 ms et ajustez la décroissance T_1rho des signaux résolus à des exponentielles simples. Des données illustratives ^{de 15}N T_1rho sont présentées pour les canaux K⁺ intégrés à la membrane dans les figures 5^{27 et 28}.

7. Polarisation nucléaire dynamique

REMARQUE : Les étapes de préparation suivantes concernent l’utilisation d’une configuration DNP commerciale utilisant des rotors MAS en saphir de 3,2 mm (Figure 6)²⁰. L’utilisation de rotors en zircone ou d’autres équipements DNP peut entraîner une réduction des améliorations du signal DNP.

1. Mettre en suspension la pastille de protéine membranaire (à partir de l’étape 3.1) dans 50 μL de tampon DNP deutéré (60 % (v/v) d8- et glycérol deutérés, et 15 mM d’AMUPol⁵⁰. Pour les expériences à 800 MHz, nous recommandons d’utiliser 10 mM NATriPOL-3⁵¹. Voir également la référence⁵² pour d’autres aspects pratiques des expériences DNP ssNMR.
2. Centrifuger pendant 10 à 20 min à 100 000 x g à 4 °C pour former une pastille. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
3. Prérefroidissez l’adaptateur centrifuge et les composants du rotor MAS saphir de 3,2 mm à <4 °C. Les étapes suivantes (7.4-7.7) doivent être effectuées le plus rapidement possible pour éviter que les agents DNP ne soient réduits.
4. Placez le rotor saphir de 3,2 mm dans l’adaptateur de centrifugeuse et remplissez-le avec la suspension de protéo-liposomes de l’étape 7.2.
5. Pipetez soigneusement l’échantillon de protéines membranaires remis en suspension contre la paroi interne du rotor à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL. Laissez la solution glisser vers le bas du rotor. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air.
6. Faites tourner l’échantillon dans le rotor pendant 5 à 10 minutes à 4 500 x g à 4 °C. Retirez le surnageant contenant l’excès de jus DNP en le pipetant avec précaution sans perturber la pastille cellulaire. Répétez les étapes 6.4-6.6 jusqu’à ce que le rotor soit plein.
7. Positionnez soigneusement l’entretoise en polytétrafluoroéthylène (PTFE) à l’aide de la vis d’espacement située sur le dessus du rotor.
8. Placez le rotor, capuchon vers le bas dans un piston de rotor⁵³ et plongez le rotor dans de l’azote liquide. Attendez au moins 30 à 60 s pour que le rotor et l’échantillon gèlent.
9. Démarrez l’unité d’échangeur de chaleur et refroidissez la sonde DNP à ~90K.
10. Réglez l’unité MAS sur le mode manuel et réglez la température variable (VT) sur 135 l/h et les débits de gaz des roulements et d’entraînement sur ~6 l/h.
11. Engagez Eject sur la console MAS.
12. Transvasez l’échantillon congelé de l’étape 7.8 du liquide N2 dans le récupérateur d’échantillons et placez-le dans la sonde (voir également référence⁵³).
13. Augmentez manuellement la pression de roulement de la sonde (Bp) à ~500 mbar avant d’engager l'"insert ». Ceci est conseillé pour une rotation stable et sûre du rotor.
14. Augmentez le taux de MAS à la valeur souhaitée en utilisant la procédure décrite dans la référence⁵³.
15. Vérifiez les améliorations DNP avec et sans micro-ondes à l’aide d’expériences PC 1D standard (voir également, par exemple, les références^51,54) (Figure 7) avant de procéder à des expériences multidimensionnelles, par exemple, les expériences CC 2D décrites dans la section 3 de cet article.

Résultats

La figure 2 montre des gels représentatifs pour la pureté du corps d’inclusion (panneau A) et le repliement des corps d’inclusion (panneau B3). La figure 2 confirme la purification réussie de BamA-P4P5 marqué au ^{13 C,15}N.

La figure 3A montre un spectre 2D ^{13 C-13}C typique d’une protéine membranaire bien ordonnée, et la figure 3B mon...

Discussion

Les protéines membranaires sont des acteurs clés dans la régulation des fonctions cellulaires vitales chez les organismes procaryotes et eucaryotes ; Il est donc essentiel de comprendre leurs mécanismes d’action à des niveaux de résolution atomiques. Les techniques de biologie structurale existantes ont poussé assez loin la compréhension scientifique des protéines membranaires, mais se sont fortement appuyées sur des données expérimentales recueillies à partir de systèmes in vitro dépour...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Molibdate d’ammonium	Merck	277908
Chlorure d’ammonium-15N	Cortecnet	CN80P50
Ampicilline	Sigma Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
Benzonase	EMD Millipore Corp	70746-3
Acide borique	Merck	B6768
Bleu de bromophénol	Sigma	B0126
Dichlorure de calcium	Merck	499609
Chlorure de choline	Sigma	C-1879
Chlorure de cobalt	Merck	449776
Sulfate de cuivre	Merck	C1297
D-Biotine	Merck	8512090025
Oxyde de deutérium	Cortecnet	CD5251P1000
Diméthyl sulfoxyde	Merck	D9170
Éthylènediaminetétraacétique	Sigma Aldrich	L6876
Acide folique	Sigma	F-7876
Glucose 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
Glycérol	Honeywell	G7757
Glycérol (12C3, 99,95 % D8, 98 %)	Eurisotope	CDLM-8660-PK
glycérol (non enrichi)	Honeywell	G7757-1L
Glycine	Sigma Aldrich	50046
Chlorhydrate de guanidine	Roth Carl	NR.0037.1
Sulfate de fer	Merck	307718
isopropyle &bêta ;-D-1-thiogalactopyranoside	Thermofisher	R0392
Bouillon de lysogénie	Merck	L3022
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876
Chlorure de magnésium hexahydraté	Fluka	63064
sulfate de magnésium	Merck	M5921
phosphate monopotassique	Merck	1051080050
Myoinositol	Sigma	I-5125
n-Dodecyl-B-D-maltoside	Acros Organics	3293702509
N,N-Diméthyldodécylamine N-oxyde	Merck	40236
Nicatinamide	Sigma	N-3376
Acide panthénique	Sigma	21210-25G-F
inhibiteur de protéase	Sigma	P8849
Pyridoxal-HCl	Sigma Aldrich	P9130
Riboflavine	Aldrich	R170-6
Chlorure de sodium	Merck	K51107104914
Dihydrogène phospahte de sodium - monohydraté	Sigma Aldrich	1,06,34,61,000
Dodécylsulfate de sodium	Thermo-scientific	28365
Hydroxyde de sodium	Merck	1,06,49,81,000
Saccharose	Sigma Life Science	S9378
Thiamine-HCl	Merck	5871
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10,70,89,76,001
Chlorure de zinc	Merck	208086
E.coli BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1,5 mL Ultra-tubes	Beckman Soc	357448
30 kDa filtre centrifuge	Amicon	UFC903024
3,2 mm saphir DNP rotor avec capuchons	Cortecnet	H13861
3,2 mm insert en téflon	Cortecnet	B6628
3,2 mm packer/déballeur d’échantillons	Cortecnet	B6988
3,2 mm Regular Wall MAS Rotor	Cortecnet	HZ16913
Rotor MAS à paroi régulière de 3,2 mm	Cortecnet	HZ09244
Kit d’outils pour rotor à paroi mince de 3,2 mm	Cortecnet	B136904
rotor MAS de 1,3 mm + capuchons	Cortecnet	HZ14752
outil de remplissage de 1,3 mm	Cortecnet	HZ14714
packer d’échantillons de 1,3 mm	Cortecnet	HZ14716
dissolvant	de bouchons de 1,3 mmCortecnet	HZ14706
1,3 mm capuchon set	Cortecnet	HZ14744
Tube de dialyse 12-14 kDa	Spectra/Por	132703
Sharpie - Noir	Merck	HS15094