Évaluation et quantification des lacunes micro-épithéliales dans la muqueuse colique à l’aide de la coloration par immunofluorescence

Summary

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode pour visualiser l’emplacement spécifique de l’endroit où la perméabilité transcellulaire et paracellulaire est renforcée dans la muqueuse colique enflammée. Dans ce test, nous appliquons un colorant fluorescent de 10 kDa conjugué à un dextran fixable à la lysine pour visualiser les régions à haute perméabilité (HPR) dans la muqueuse colique.

Abstract

Les cellules épithéliales qui tapissent la muqueuse intestinale créent une barrière physique qui sépare le contenu luminal de l’interstitium. L’altération de la barrière épithéliale a été associée au développement de diverses pathologies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). Dans la muqueuse enflammée, les érosions superficielles ou micro-érosions qui corrompent les monocouches épithéliales correspondent à des sites de haute perméabilité. Plusieurs mécanismes ont été impliqués dans la formation des micro-érosions, notamment la mue cellulaire et l’apoptose. Ces micro-érosions représentent souvent des trous épithéliales microscopiques répartis de manière aléatoire dans le côlon. La visualisation et la quantification de ces lacunes épithéliales sont devenues un outil important pour étudier la fonction de la barrière épithéliale intestinale. Ici, nous décrivons une nouvelle méthode pour visualiser l’emplacement spécifique de l’endroit où la perméabilité transcellulaire et paracellulaire est renforcée dans la muqueuse colique enflammée. Dans ce test, nous appliquons un colorant fluorescent de 10 kDa conjugué à un dextran fixable à la lysine pour visualiser les régions à haute perméabilité (HPR) dans la muqueuse colique. L’utilisation supplémentaire de marqueurs de mort cellulaire a révélé que les HPR englobent les foyers apoptotiques où l’extrusion/excrétion épithéliale se produit. Le protocole décrit ici fournit une approche simple mais efficace pour visualiser et quantifier les micro-érosions dans l’intestin, ce qui est un outil très utile dans les modèles de maladies, dans lesquels la barrière épithéliale intestinale est compromise.

Introduction

La muqueuse gastro-intestinale (GI) crée une barrière physique qui sépare l’environnement extracellulaire et le milieu interne de l’hôte, et participe à l’absorption des nutriments, de l’eau et des électrolytes. La barrière intestinale comprend une couche de mucus constituée de glycoprotéines, une monocouche de cellules épithéliales et la lamina propria sous-jacente sont des cellules immunitaires et stromales. Les cellules épithéliales intestinales formant la barrière physique sont reliées entre elles par différents complexes protéiques, notamment la jonction adhérente (AJ), la jonction serrée (TJ) et les desmosomes (DM). L’altération....

Protocol

Toutes les procédures ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (CICUAL) de CINVESTAV.

1. Préparation des matériaux et des réactifs

1. Préchauffer la solution de Hartmann (130 mM de NaCl, 28 mM de lactate, 4 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl₂) à 37 °C tout en bouillonnant avec 95 % d’O₂/5 % de CO₂. Maintenez le pH physiologique (7,4) de la solution.
2. Pour analyser la perméabilité paracellulaire passive, préparer une solution de travail en dissolvant 1 mg/mL de FITC-Dextran (4 kDa) et 1 mg/m....

Results

Dans la muqueuse enflammée, les érosions superficielles ou les microérosions compromettent l’intégrité de la monocouche de cellules épithéliales et représentent des sites de haute perméabilité ^7,8. Pour évaluer de telles possibilités, nous avons analysé la perméabilité passive dans la muqueuse colique enflammée dans un modèle murin de colite au sulfate de sodium dextran. En bref, pendant 5 jours, les souris C57BL/6J ont reçu 2,5 % de DSS (p/v, 40-50 kDa) dissous .......

Discussion

L’homéostasie épithéliale résultant de l’équilibre entre la prolifération cellulaire et l’apoptose épithéliale maintient une barrière intestinale correcte et fonctionnelle. De nombreux troubles cliniques, tels que les MICI, sont accompagnés ou caractérisés par des altérations de la perméabilité intestinale, une inflammation de la muqueuse et une perturbation de l’homéostasie épithéliale¹. L’interaction entre ces processus est encore très controversée. Par conséque.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorps actif caspase-3 (1:1000)	Signalisation cellulaire	9664	Caspase-3 clivée (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  ; anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
Microscope confocal (Leica TCS SP8x)	Détecteurs Leica		HyD et laser à lumière blanche
E-Cadhérine anticorps (1:750)	Sigma	MABT26	Rat monoclonal Delma-1
anticorps Ethanol 70 %	Générique
Fixable-Dextran	Invitrogen	D22914	Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, anionique,
fixable FITC Dextran	Sigma	46944	Fluorescéine isothiocyanate&ndash ; dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann’s Solution	PiSA	PiSA
(AutoFlow NU-8500)	Nuaire
(Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell Plaque en polystyrène noir et blanc	ThermoFisher Scientific
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phalloïdine (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloïdine
RITC Dextran	Sigma	R8881-100MG	Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
Anticorps secondaires (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		Anticorps secondaires conjugués HRP
Fils de suture	Générique		Soie tressée et polyester tressé Les sutures chirurgicales sont à privilégier.
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb anti-ZO-1