Ce protocole fournit des conseils détaillés pour l’allotransplantation générationnelle initiale et continue des tumeurs de la drosophile dans l’abdomen des hôtes adultes pour étudier divers aspects de la néoplasie. En utilisant un appareil d’auto-injecteur, les chercheurs peuvent obtenir une efficacité et des rendements tumoraux améliorés par rapport à ceux obtenus par des méthodes manuelles traditionnelles.
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Article de méthode
Allotransplantation tumorale chez Drosophila melanogaster avec un injecteur auto-nanolitre programmable
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole décrit l’allotransplantation des tumeurs chez Drosophila melanogaster à l’aide d’un appareil d’injection d’auto-nanolitres. Avec l’utilisation d’un appareil d’auto-injecteur, les opérateurs formés peuvent obtenir des résultats de transplantation plus efficaces et cohérents par rapport à ceux obtenus à l’aide d’un injecteur manuel. Ici, nous couvrons les sujets de manière chronologique: du croisement des lignées de drosophiles à l’induction et à la dissection de la tumeur primaire, en passant par la transplantation de la tumeur primaire dans un nouvel hôte adulte et la transplantation générationnelle continue de la tumeur pour des études approfondies. À titre de démonstration, nous utilisons ici des tumeurs de l’anneau imaginal induites par la surexpression du domaine intracellulaire Notch (NICD) pour la transplantation générationnelle. Ces tumeurs peuvent d’abord être induites de manière fiable dans un microenvironnement de zone de transition au sein des anneaux imaginaux des glandes salivaires larvaires, puis allogreffées et cultivées in vivo pour étudier la croissance tumorale continue, l’évolution et les métastases. Cette méthode d’allotransplantation peut être utile dans les programmes potentiels de dépistage de médicaments, ainsi que pour étudier les interactions tumeur-hôte.
Introduction
Ce protocole fournit un guide étape par étape pour l’allotransplantation des tumeurs de l’anneau imaginal des glandes salivaires larvaires (SG) de la drosophile dans l’abdomen d’hôtes adultes à l’aide d’un appareil d’injection d’auto-nanolitres (par exemple, Nanoject). Ce protocole fournit également des instructions pour la ré-allogreffe ultérieure des tumeurs dans de nouvelles générations d’hôtes adultes, ce qui offre des possibilités d’étude longitudinale continue des caractéristiques tumorales, telles que l’évolution tumorale et les interactions tumeur-hôte. Le protocole peut également être appliqué aux expériences de dépistage de drogues.
Cette méthode a été développée pour améliorer l’efficacité de l’allotransplantation tumorale chez la drosophile à l’aide d’injecteurs manuels1, qui sont souvent incohérents dans leurs forces d’aspiration et d’injection, conduisant à des résultats sous-optimaux pour l’allotransplantation tumorale. Un appareil d’auto-injection offre un meilleur contrôle et peut entraîner des taux plus faibles de mortalité des mouches après l’allogreffe. Un opérateur formé pourrait atteindre un taux de survie de l’hôte de plus de 90% avec l’auto-injecteur, contre environ 80% lorsque l’injecteur manuel était utilisé1. Le taux global d’acquisition tumorale est de 60% à 80% au jour 8-12 après l’allogreffe. Le temps d’injection moyen a également été amélioré, passant de 30 à 40 s par mouche à l’aide d’un injecteur manuel à 20 à 25 s par mouche à l’aide de l’auto-injecteur.
Ce protocole est l’un des premiers protocoles à utiliser l’appareil auto-injecteur dans l’allotransplantation tumorale de la drosophile . Une étude récente a également utilisé l’auto-injecteur pour l’allotransplantation de cellules souches neurales tumorales2. Auparavant, l’appareil d’auto-injecteur était utilisé chez la drosophile pour étudier la virulence bactérienne3, les infections parasitaires et la défense de l’hôte4, ainsi que le dépistage de la bioactivité de différents composés5. Notre protocole adapte l’appareil d’auto-injecteur pour l’utilisation de l’injection tumorale et cherche à fournir aux chercheurs de la drosophile une qualité supérieure et des résultats plus cohérents tout en leur faisant gagner un temps considérable. Ce protocole peut non seulement être utilisé pour l’allotransplantation de tumeurs, mais peut également être adapté à l’allotransplantation de tissus sauvages et mutants de calibre similaire6.
La tumeur NICD de drosophile utilisée dans ce protocole a été introduite pour la première fois par Yang et al.7 dans la zone de transition de l’anneau imaginal SG, un « point chaud tumoral » qui présente des niveaux élevés d’activité endogène Janus Kinase / Signal Transducer et Activateurs de transcription (JAK-STAT), et c-Jun N-terminal Kinase (JNK). De plus, la zone de transition présente des niveaux élevés de métalloprotéinase matricielle 1 (MMP1)7, ce qui rend cette région particulièrement propice à la tumorigenèse. L’activation de la voie notch par la surexpression de la NICD seule est suffisante pour initier systématiquement la formation de tumeurs. Ces tumeurs peuvent ensuite être allotransplantées pour permettre l’étude d’un large éventail de sujets, y compris la division des cellules tumorales, l’invasion et les interactions tumeur-hôte.
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Protocole
1. Préparation de la tumeur de l’anneau imaginal SG
- Croisez les mouches adultes avec les génotypes uas-NICD (mâle: 10-15 mouches) et Act-Gal4, UAS-GFP / CyO; tub-Gal80ts (femelle vierge: 10-15 mouches) et laissez-les se reproduire pendant 1 jour à 18 ° C. Les mouches adultes sélectionnées doivent être âgées de 5 à 9 jours pour assurer une fertilité élevée.
- Laisser les mouches adultes pondre des œufs dans la nourriture pour mouches contenue dans les flacons pendant 24 h à 18 °C, puis retirer les mouches adultes.
REMARQUE: Les aliments pour mouches sont préparés à l’aide de la recette standard de semoule de maïs du Drosophila Stock Center8. Chaque flacon doit contenir environ 10 ml de nourriture pour mouches. - Laisser les œufs incuber pendant 6 jours à 18 °C. Pendant cette période, les larves vont éclore.
- Transférer les flacons contenant des larves dans un incubateur à 29 °C et incuber pendant encore 7 jours.
REMARQUE: Cette étape d’incubation est facultative en fonction de la conception expérimentale spécifique.
2. Préparation de la drosophile sauvage adulte de type adulte pour l’allotransplantation
- Anesthésiez les mouches adultes de type sauvage ou mutantes appropriées avec 100% de CO2 et triez les mouches en fonction des sexes. Les mouches mâles et femelles peuvent être utilisées comme hôtes tumoraux.
- Fixez un morceau de ruban adhésif de 5 cm de long à une lame de microscope avec le côté collant vers le haut en le fixant avec deux plus petits morceaux de ruban adhésif, un à chaque extrémité.
- Immobilisez les mouches en collant leurs ailes à la bande. Utilisez des pinces lors de la manœuvre des mouches.
- Répétez l’étape ci-dessus pour 60 à 80 mouches adultes utilisées comme accepteurs d’allogreffes.
REMARQUE: Il est préférable d’organiser les mouches en rangées soignées, avec leur axe du corps aligné parallèlement les uns aux autres pour un processus d’injection plus rapide plus tard. La figure 1 montre des rangées de mouches hôtes scotchées de cette manière.
- Répétez l’étape ci-dessus pour 60 à 80 mouches adultes utilisées comme accepteurs d’allogreffes.
3. Assemblage de l’appareil d’auto-injecteur
- Connectez à la fois l’appareil d’auto-injecteur et le cordon d’alimentation au boîtier du contrôleur.
- Réglez le volume d’injection sur 59,8 nL. Cela aidera à maintenir la quantité appropriée de forces d’aspiration et d’injection pendant l’allotransplantation.
- Placez le boîtier du contrôleur et l’auto-injecteur sur les côtés opposés du microscope optique.
REMARQUE: Pour les opérateurs droitiers, le boîtier de commande doit être placé sur le côté gauche du microscope avec l’injecteur sur le côté droit. Inversement pour les opérateurs gauchers. - Préparez le capillaire en verre de 3,5 po pour l’utiliser en coupant l’extrémité fermée avec une pince.
- Traiter une extrémité du capillaire en verre à l’aide d’un extracteur de micropipette à quatre étapes et chauffer à une extrémité étroite et fermée en utilisant les spécifications suivantes dans l’instrument: Chaleur = 650, Force = 200 et Distance = 8. Placez soigneusement les capillaires dans l’appareil d’extraction et exécutez le programme après avoir entré les paramètres ci-dessus.
- Utilisez des pinces pour clipser le capillaire à un angle d’environ 60 ° afin de créer une extrémité plus nette pour une entrée facile dans l’abdomen de la mouche adulte1. Voir la figure 2 pour un exemple de capillaire bien coupé.
- Dévissez légèrement le capuchon de l’injecteur. Maintenez enfoncé le bouton Vide pour faire avancer l’aiguille de l’injecteur jusqu’à ce que 70% à 80% de sa longueur totale s’affiche. Pour accélérer l’avancement capillaire, appuyez une fois sur le bouton Remplir tout en maintenant enfoncé le bouton Vide .
- Utilisez une seringue pour remplir le capillaire en verre avec de l’huile minérale. Ensuite, insérez soigneusement le capillaire en verre sur l’aiguille de l’injecteur jusqu’à ce que le premier soit fermement attaché au bouchon en caoutchouc de l’injecteur. Maintenant, vissez bien le capuchon de l’injecteur.
- Essuyez les résidus d’huile minérale sur la surface externe du couvercle capillaire en verre pour éviter de contaminer le milieu pendant l’allotransplantation.
4. Dissection de la tumeur de l’anneau imaginal SG
- Sélectionnez l’une des larves et transférez-la sur une plaque de dissection remplie de 100 μL de milieu de Schneider pour préparer la dissection tumorale de l’anneau imaginal SG.
REMARQUE: Seuls les spécimens hébergeant la tumeur resteront sous forme de larves. En effet, la croissance tumorale retarde le développement et la progression des larves9. Les deux tiers des spécimens n’abriteront pas la tumeur et auront donc progressé vers des nymphes/adultes.- À des fins de dissection et d’allotransplantation, utilisez un stéréomicroscope avec une plage de grossissement de 10x-20x.
- En utilisant une paire de pinces pour tenir la section médiane du corps larvaire, pincez la tête larvaire à l’aide d’une autre paire de pinces et appliquez une force d’étirement dans le sens de la longueur.
- Localisez le SG en forme de Y des larves et isolez-le du reste du tissu larvaire10.
- Disséquez et isolez la tumeur de l’anneau imaginal SG en enlevant le tissu adjacent. Voir la figure 3 pour une représentation de ce processus de dissection.
- Répétez les étapes 4.1 à 4.4 pour 10 à 20 tumeurs à anneau imaginal SG supplémentaires en fonction des besoins de recherche.
5. Allogreffe de la tumeur primitive de l’anneau imaginal SG
- Immergez le capillaire dans le milieu de Schneider contenant les tumeurs primaires de l’anneau imaginal SG. Maintenez le bouton Fill enfoncé pour remplir le capillaire en verre avec le Medium de Schneider jusqu’au segment supérieur de 0,5 cm. Ce segment supérieur devrait rester rempli d’huile minérale.
REMARQUE: Accélérez ce processus en appuyant une fois sur le bouton Vide tout en maintenant le bouton Remplissage enfoncé. - Localisez une tumeur primaire et appuyez sur le bouton Fill jusqu’à ce que la tumeur soit aspirée dans le capillaire.
- Assurez-vous que la tumeur se trouve à l’extrémité du capillaire ou à plusieurs millimètres de l’extrémité du capillaire. Cela permet d’éviter que la tumeur ne dérive et ne se perde dans la solution contenue dans le capillaire. Voir la figure 4A pour une démonstration de l’emplacement approprié de la tumeur telle qu’elle se trouve dans le capillaire.
- Localisez une mouche adulte immobilisée sur la bande sur la lame du microscope. À l’aide d’une pince, maintenez doucement le bas-ventre enfoncé. Ensuite, percez la cuticule latérale inférieure de l’abdomen avec le capillaire. Appuyez sur le bouton Vider jusqu’à ce que la tumeur pénètre dans le nouvel abdomen hôte. Voir la figure 4B pour une démonstration de cette technique.
- À l’aide d’une pince, pincez doucement les ailes de l’hôte pour le retirer du ruban adhésif. Placez l’hôte dans un nouveau flacon avec des aliments frais. Il est préférable de placer le flacon latéralement pendant les 24 premières heures suivant l’injection. Chaque flacon ne doit contenir qu’un maximum de 20 mouches.
REMARQUE: Certaines mouches hôtes auront des ailes manquantes et d’autres plaies sur leur corps après l’injection et peuvent coller à la nourriture pour mouches si le flacon est placé à la verticale. - Répétez les étapes 5.2 à 5.4 pour transplanter les tumeurs primaires restantes dans leurs nouveauxhôtes adultes.
- Jetez les capillaires dans le récipient des objets tranchants et nettoyez les résidus d’huile minérale de l’extérieur de l’auto-injecteur avant de replacer l’appareil dans sa boîte.
- Conserver le flacon des hôtes à température ambiante pendant 1 jour, puis transférer le flacon dans une chambre d’incubation à 29 °C. Transférez les hôtes de mouches vers de nouveaux flacons tous les 2-3 jours.
- Surveillez quotidiennement les hôtes de mouches et calculez les taux de survie. Après une semaine, les tumeurs doivent être visibles sous un stéréomicroscope avec adaptateur de fluorescence et peuvent être surveillées en permanence pour leur taille et leur progression.
6. Ré-allogreffe de tumeurs transplantées
- Environ 10 à 14 jours après l’allogreffe, dépister les tumeurs qui se sont développées dans l’abdomen de l’hôte à l’aide d’un microscope à fluorescence.
- Anesthésier un hôte avec du CO2 et le placer dans une plaque de dissection remplie de 100 μL de milieu de Schneider. Disséquez la tumeur allogreffée cultivée hors de l’hôte à l’aide de deux paires de pinces.
- Utilisez une paire de pinces pour maintenir l’abdomen et l’autre paire pour inciser la cuticule abdominale, exposant la tumeur allogreffée1.
- Isolez soigneusement la tumeur des tissus hôtes attachés autant que possible en utilisant des marqueurs de fluorescence comme guide.
- Répétez l’étape 6.2 pour vous préparer à deux à trois tumeurs allogreffées supplémentaires.
- Transférer la plaque de dissection contenant les tumeurs récoltées sur le stade d’un microscope optique.
- Utilisez des aiguilles stériles et disséquez les tumeurs en plus petits morceaux adaptés à la taille capillaire.
- Répétez les étapes 4.1 à 4.5 pour préparer la nouvelle génération d’hôtes adultes et répétez les étapes 5.1 à 5.7 pour compléter l’allotransplantation des tumeurs.
REMARQUE: Les taux de réussite sont généralement plus élevés pour les tumeurs non primaires par rapport à ceux des tumeurs primaires. - Répétez les étapes 6.1 à 6.6 pour chaque génération ultérieure de mouches utilisée dans l’étude.
REMARQUE: Choisissez des lignées hôtes de drosophiles appropriées aux besoins expérimentaux.
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Résultats
Ici, nous avons effectué une allotransplantation générationnelle de tumeurs à anneau imaginal SG à l’aide de l’appareil d’auto-injecteur d’injection de nanolitres et avons ensuite effectué une imagerie en direct de la tumeur avec un microscope à balayage laser confocal, ce qui a permis une plongée plus profonde dans les sujets de la croissance tumorale, de la migration des cellules tumorales et des interactions tumeur-hôte. Lorsque le montage vole, collez-les sur une lame de microscope et retenez-les via un bloc de polyd...
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Discussion
L’allotransplantation tumorale peut aider les chercheurs à résoudre certains problèmes qui surviennent au cours de la croissance et de la progression de la tumeur de la drosophile. L’un de ces défis est le contournement des décès prématurés de larves ou d’adultes porteurs de tumeurs lors de la culture de tumeursprimaires 12. Dans ce contexte, l’allotransplantation tumorale continue permet aux tumeurs de se développer indéfiniment, ce qui facilite les études longitudinales de la croissance...
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Déclarations de divulgation
Il n’y a pas de conflits d’intérêts à déclarer entre les auteurs.
Remerciements
Nous remercions les anciens membres du laboratoire, le Dr Sheng-An Yang et M. Juan-Martin Portilla, pour leur contribution à l’élaboration de ce protocole. Nous sommes reconnaissants au laboratoire du Dr Yan Song à l’École des sciences de la vie de l’Université de Pékin d’avoir partagé son protocole sur l’allotransplantation manuelle. Nous remercions également M. Calder Ellsworth et M. Everest Shapiro pour leur lecture critique du manuscrit.
WMD a reçu un financement (GM072562, CA224381, CA227789) pour ce travail du National Institute of Health (https://www.nih.gov/) et un financement (IOS-155790) de la National Science Foundation (htps://nsf.gov/). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscope confocal à balayage laser | Zeiss | LSM 980 | Aussi connu sous le nom de « Zeiss LSM 980" |
| Nourriture pour mouches de semoule de maïs | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Aussi connu sous le nom de « BDSC Standard Cornseil Food"Aiguille |
| dissection (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Plaque de dissection | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Adaptateur de fluorescence pour microscope Stero | Microscopie | Sciences SFA-UV | Aussi connu sous le nom de « NightSea Fluorescence Adapter" |
| Microscope à fluorescence | Zeiss | 495015-0001-000 | Aussi connu sous le nom de « Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Aussi connu sous le nom de « Pince Dumont #5 » |
| Capillaire en verre (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Colle | Elmer | E305 | Aussi connu sous le nom de « Elmer Washabale Clear Glue" |
| Microscope optique | Zeiss | 435063-9010-100 | Aussi connu sous le nom de « Zeiss Stemi 305"Extracteur |
| micropipettes | World Precision Instruments | PUL-1000 | Aussi connu sous le nom de « Four Step Micropipette Puller« |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Aussi connu sous le nom de « Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"Seringue |
| Schneider’s Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
Références
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. Pseudomonas Methods and Protocols. , Springer. 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597(2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753(2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51(2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103(2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).
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Réimpressions et autorisations
