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Article de méthode

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules fœtales du syndrome de Turner (45XO) pour la modélisation en aval des déficits neurologiques associés au syndrome

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DOI :

10.3791/62240

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4 décembre 2021

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la génération de CSI sans intégration à partir de fibroblastes de tissu fœtal par administration de plasmides épisomiques par nucléofection suivie d’une description des méthodes utilisées pour la caractérisation de l’iPSC et la différenciation neuronale.

Résumé

Les aneuploïdies chromosomiques provoquent de graves malformations congénitales, notamment des malformations du système nerveux central et la mort fœtale. Le dépistage génétique prénatal est purement diagnostique et n’élucide pas le mécanisme de la maladie. Bien que les cellules des fœtus aneuploïdes soient du matériel biologique précieux portant l’aneuploïdie chromosomique, ces cellules sont de courte durée, ce qui limite leur utilisation pour les expériences de recherche en aval. La génération de modèles de cellules souches pluripotentes induites (CSIp) est une méthode efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des caractères aneuploïdes. Ils se renouvellent d’eux-mêmes et se différencient en cellules spécialisées qui rappellent le développement embryonnaire. Ainsi, les CSPe constituent d’excellents outils pour étudier les événements de développement précoces. Le syndrome de Turner (TS) est une affection rare associée à un chromosome X complètement ou partiellement manquant. Le syndrome est caractérisé par l’infertilité, la petite taille, les troubles endocriniens, métaboliques, auto-immuns et cardiovasculaires et les défauts neurocognitifs. Le protocole suivant décrit l’isolement et la culture de fibroblastes à partir de tissu fœtal TS (45XO), la génération de TSiPSC sans intégration par l’administration de plasmides de reprogrammation épisomique par nucléofection suivie d’une caractérisation. Les TSiPSC de reprogrammation ont d’abord été examinés par coloration de la phosphatase alcaline des cellules vivantes, suivie d’un sondage approfondi pour les biomarqueurs de pluripotence. Les colonies sélectionnées ont été disséquées mécaniquement, ont été croisées plusieurs fois et des cellules stables auto-renouvelées ont été utilisées pour d’autres expériences. Les cellules ont exprimé les facteurs de transcription de pluripotence OCT4, NANOG, SOX2, les marqueurs de surface cellulaire SSEA 4 et TRA1-81 typiques des cellules souches pluripotentes. Le caryotype 45XO original a été conservé après la reprogrammation. Les TSiPSC ont pu former des corps embryoïdes et se différencier en cellules d’endoderme, de mésoderme et d’ectoderme exprimant des biomarqueurs spécifiques à la lignée ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Les plasmides épisomiques exogènes ont été perdus spontanément et non détectés après le passage 15 dans les cellules. Ces TSiPSC sont une ressource cellulaire précieuse pour modéliser le neurodéveloppement moléculaire et cellulaire défectueux provoquant des déficits neurocognitifs associés au syndrome de Turner.

Introduction

Les aneuploïdiens entraînent des malformations congénitales et des pertes de grossesse chez l’homme. ~ 50% à 70% des échantillons de pertes de grossesse présentent des anomalies cytogénétiques. Les embryons aneuploïdes perdus au début de la grossesse ne peuvent pas être facilement obtenus pour une analyse expérimentale, ce qui soulève la nécessité de développer d’autres modèles représentant étroitement l’embryogenèse humaine. Des cellules souches pluripotentes induites (CSI) dérivées de cellules diagnostiquées avec des troubles génétiques ont été utilisées pour modéliser les irrégularités génétiques représentatives et leurs conséquences sur le développement du fœtus1,2,3,4. Ces CSPi ressemblent à des cellules épiblastiques de l’embryon en développement et peuvent récapituler les événements précoces de la formation de l’embryon. Ils permettent de comprendre et de caractériser le programme de développement des lignées cellulaires et des modèles chez les embryons de mammifères précoces. CSPi dérivées précédemment de fibroblastes cutanés et d’amniocytes provenant de tests de diagnostic prénatal de syndromes d’aneuploïdie comme la monosomie X (syndrome de Turner), la trisomie 8 (syndrome de Warkany 2), la trisomie 13 (syndrome de Patau) et la trisomie partielle 11; 22 (syndrome d’Emanuel) ont fourni des informations précieuses concernant l’échec du développement4.

Le syndrome de Turner (TS) est une maladie rare caractérisée par l’infertilité féminine, la petite taille, des troubles endocriniens et métaboliques, un risque accru de maladie auto-immune et une prédisposition aux maladiescardiovasculaires 5. Bien qu’il s’agit du seul syndrome de monosomie survivable, il est également mortel pour l’embryon en développement provoquant des avortements spontanés6. Les individus survivants atteints de TS présentent des degrés d’altération du matériel chromosomique X dans leurs cellules. Les caryotypes vont de la perte complète d’un chromosome X (45,XO) à des mosaïques comme 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la présence de chromosomes annulaires, la présence de matériel chromosomique Y,etc. 5.

Le diagnostic du syndrome se fait généralement par caryotypage du sang des individus symptomatiques et prélèvement de villosités chorioniques (CVS) pour détecter les syndromes d’aneuploïdie précoce. Étant donné que les syndromes d’aneuploïdie représentent environ 30% des avortements spontanés, il est courant de caryotyper le produit de la conception (POC) lors d’un avortement spontané. Ces cellules fœtales, y compris les villosités chorioniques possédant l’anomalie cytogénétique et les CSPi qui en sont dérivées, constituent une source précieuse de matériel biologique pour étudier les syndromes d’aneuploïdie4,6. Les CSI TS ont déjà été établies à partir d’amniocytes via la reprogrammation rétrovirale4,de fibroblastes de villosités chorioniques (obtenus par diagnostic prénatal) via une reprogrammation rétrovirale6,de cellules mononucléaires sanguines7 via la reprogrammation du virus Sendai et de fibroblastes cutanés d’individus TS via une reprogrammation lentivirale4 . Étant donné que l’objectif principal de notre laboratoire est de comprendre l’échec du développement, nous avons généré des CST iPSC à partir de POC, en particulier la composante des villosités chorioniques d’un avortement spontané8. Toutes les cellules isolées de ce tissu fœtal avaient un caryotype 45XO et produisaient des CS IPC avec le même caryotype. Ces CSPe sont uniques car elles sont les premières à être générées à partir d’un fœtus avorté et constituent une ressource précieuse pour étudier les échecs de grossesse liés à l’aneuploïdie. Cet article fournit une méthodologie détaillée de la génération de CSPic à partir de cette source cellulaire unique via la reprogrammation épisomique.

Les premières méthodes de génération d’iPSC utilisaient la transduction virale et les transposons pour fournir les facteurs de reprogrammation. Les méthodes d’induction des cellules à la pluripotence ont évolué de l’intégration des vecteurs rétroviraux9,des vecteurs lentiviraux excisables10,11 et des méthodes basées sur les transposons12 aux vecteurs adénoviraux non intégrateurs13 et aux vecteurs à base du virus Sendai14. La reprogrammation rétrovirale et lentivirale, bien qu’efficace, implique l’intégration des facteurs de reprogrammation dans les chromosomes de l’hôte, provoquant des mutations d’insertion qui ont des effets imprévus dans les CSI. De plus, la reprogrammation virale empêche l’application translationnelle des CSI. Les systèmes à base d’ARN15 et d’administration directe de protéines16 ont été explorés pour éliminer complètement les risques potentiels associés à l’utilisation de virus et de transfections d’ADN. Cependant, ces méthodes se sont avérées inefficaces.

En 2011, Okita et al. ont rapporté une amélioration de l’efficacité de la reprogrammation par des plasmides épisomiques augmentés par la suppression de TP53 via shRNA. Ils ont également remplacé le cMYC par un LMYC (MYC associé au carcinome pulmonaire à petites cellules) non transformant pour améliorer la sécurité des hiPSC. Ces plasmides épisomiques expriment 5 facteurs de reprogrammation : OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC et shRNA pour TP5317,18. Ces vecteurs sont maintenus extra-chromosomiquement et perdus des cellules reprogrammées lors d’une culture continue, rendant ainsi les lignes sans transgène dans 10-15 passages. La nucléofection est une forme spécialisée d’électroporation qui délivre des acides nucléiques directement dans le noyau des cellules hôtes. C’est une méthode efficace pour l’administration des plasmides de reprogrammation dans divers types de cellules. Les plasmides épisomiques sont rentables et compensent les coûts élevés de la nucléofection. Cette méthode est efficace et reproductible dans des conditions optimisées, produisant des CSP stables à partir d’une variété de cellules somatiques. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de génération de CSI i à partir de fibroblastes isolés du tissu fœtal par nucléofection de plasmides de reprogrammation épisomique. Voici les protocoles détaillés pour l’isolement des fibroblastes des villosités chorioniques fœtales, la purification des plasmides, la nucléofection, la cueillette des colonies à partir de la plaque de reprogrammation et l’établissement de CSI stables.

Il est essentiel de confirmer la présence de traits de pluripotence dans les IPSC nouvellement générés. Cela comprend la démonstration de facteurs liés à la pluripotence (par exemple, expression de la phosphatase alcaline, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadhérine; généralement montré avec des tests d’immunofluorescence ou d’expression génique), l’identification des trois couches germinales par des tests de différenciation in vitro pour valider leurs potentiels de différenciation, le caryotypage pour déterminer le contenu chromosomique, le typage STR pour établir l’identité avec les cellules mères, vérifier la perte de gènes exogènes, et des essais in vivo plus rigoureux tels que la formation de tératome et la complémentation tétraploïde. Nous décrivons ici les protocoles de caractérisation du caryotypage, la coloration de la phosphatase alcaline des cellules vivantes, la détection de biomarqueurs liés à la pluripotence par immunofluorescence, les tests de différenciation in vitro et la méthode pour démontrer la perte de gènes exogènes19.

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Protocole

Les FCV ont été obtenus de l’hôpital Manipal, à Bangalore, sous l’approbation du comité d’éthique des hôpitaux Manipal.

REMARQUE : Voir le tableau 1 pour la composition de tous les tampons et solutions.

1. Isolement des fibroblastes des villosités chorioniques fœtales (FCV)

  1. Prélèvement d’échantillons et désintégration tissulaire dans la collagénase
    1. Recueillir le FCV dans des conditions stériles dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et le transporter (à température ambiante) vers l’installation de culture cellulaire.
    2. Transférer les villosités dans une boîte de Petri de 60 mm et laver plusieurs fois (minimum 4 fois) dans du PBS contenant 1x solution antibiotique antimycotique (PBS-AA). Retirez complètement le PBS-AA par pipetage.
    3. Traiter les villosités chorioniques avec 1 mL de mélange de collagénase (5 mg/mL) pendant 5 min à 37 °C.
    4. Neutraliser avec un milieu de culture cellulaire contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS), transférer la digestion dans un tube de 15 mL et centrifuger à 225 x g pendant 5 minutes pour recueillir les villosités désintégrées et les cellules libérées sous forme de granulés.
  2. Sous-culture et expansion des stocks
    1. Les villosités désintégrées sur plaque ainsi que les cellules libérées dans une fiole de culture T25 contenant 5 mL de milieu complet (par exemple, AmnioMAX) et se développent jusqu’à l’obtention d’une culture de fibroblastes confluents.
    2. Développer les fibroblastes en culture pour préparer les stocks en pour les utiliser dans des expériences ultérieures de transfection et de caractérisation comme suit:
      1. Ajouter 2 mL de trypsine à 0,05 % dans une fiole de T25 contenant des fibroblastes FCV et incuber à 37 °C pendant 3 à 5 min pour dissocier les cellules.
      2. Après l’incubation, neutraliser la trypsine en ajoutant fbS (au même volume que la trypsine).
        REMARQUE: Le milieu de culture contenant du FBS peut également être utilisé pour neutraliser la trypsine, lorsqu’il est ajouté à un rapport trypsine: média de 1: 3.
      3. Prélever les cellules dissociées dans un tube de 15 mL et centrifuger à 225 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille de cellule.
      4. Décant surnageant et resuspendé la pastille de cellule dans 1 mL de milieu complet.
      5. Transférer 500 μL chacun dans des boîtes de 60 mm traitées par culture tissulaire et porter le volume à 5 mL. Ce rapport de division de 1:2 a également été utilisé pour les passages suivants.
  3. Cryoconservation
    1. Effectuer une dissociation enzymatique à l’aide de 0,05% de trypsine comme décrit aux étapes 1.2.2.1 - 1.2.2.3 et obtenir une pastille cellulaire.
    2. Jeter le surnageant et ressusser la pastille cellulaire dans 1 mL de mélange de congélation, comprenant du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) 1:9: FBS.
    3. Transférer le contenu dans un cryovial stérile et placer le flacon dans un récipient de congélation.
    4. Congeler pendant la nuit à -80 °C, puis transférer les flacons dans de l’azote liquide (-196 °C) le lendemain.

2. Isolement et vérification de l’ADN des plasmides

  1. Préparation de cellules bactériennes
    1. Strier les stocks de glycérol d’E. coli contenant les trois plasmides individuels pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK et pCXLE-hUL (d’Addgene) sur des plaques de gélose Luria Bertani-ampicilline séparées.
    2. Inoculer des colonies uniques dans des cultures de démarrage de 5 mL de milieu Luria Bertani-ampicilline. Incuber pendant 8 heures à 37 °C en agitant (10 x g).
    3. Inoculer 200 μL de cette culture de départ dans 100 mL de milieu Luria Bertani-ampicilline. Incuber toute la nuit à 37 °C en agitant.
    4. Récolter la culture bactérienne pendant la nuit en centrifugant à 6000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  2. Isolation plasmidique avec kit de purification plasmidique Midi
    1. Resuspendez la pastille bactérienne dans un tampon de resuspension de 4 mL.
    2. Ajouter 4 mL de tampon de lyse et bien mélanger en inversant vigoureusement 4 à 6 fois et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    3. Ajouter 4 mL de tampon de neutralisation pré-refroidi et inverser le tube 4 à 6 fois pour bien mélanger. Incuber sur de la glace pendant 15 min.
    4. Centrifuger à ≥20 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Recueillir le surnageant dans un tube frais et recentrififer à ≥20 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
    5. Équilibrez la colonne en appliquant 4 mL de tampon d’équilibrage.
    6. Appliquez le surnageant à la colonne.
    7. Lavez la colonne deux fois avec 10 mL de tampon de lavage.
    8. Elute ADN avec 5 mL de tampon d’élution chaud (65 °C).
    9. Précipiter l’ADN en ajoutant 3,5 mL d’isopropanol à l’ADN élué. Bien mélanger. Centrifuger à ≥15 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Décantantantant soigneusement.
    10. Laver la pastille d’ADN avec 2 mL d’éthanol à 70 % et centrifuger à ≥15 000 x g pendant 10 min. Décantantantant soigneusement.
    11. Sécher à l’air les granulés pendant 5 à 10 min et dissoudre l’ADN dans un volume approprié d’eau de qualité PCR pour obtenir une concentration finale de 1 μg/mL.
      REMARQUE: Ne dissolvez pas l’ADN dans les tampons car il ne convient pas à l’électroporation. Les anciennes préparations d’ADN plasmidique ne produisent pas de colonies reprogrammées.
  3. Vérification des plasmides par digestion de restriction EcoRI
    1. Combiner 15 μL d’eau sans nucléase, 2 μL de tampon 10x, 1 μg d’ADN plasmidique et 1 μL d’enzyme EcoRI. Mélanger doucement.
    2. Incuber le mélange à 37 °C pendant 15 min dans un bloc chauffant.
    3. Mélanger les échantillons de plasmides digérés avec 6x colorant de chargement de gel d’ADN et électrophorèse sur du gel d’agarose à 1% dans 1x tampon TAE avec 0,5 μg / mL de bromure d’éthidium. Inclure une échelle d’ADN standard. Imagez le gel après que l’ADN se soit résolu de manière appropriée. Les tailles de bande EcoRI attendues de pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F sont de 6 834 pb, 3 758 pb et 1 108 pb; pCXLE-hUL sont de 10 200 pb et 1 900 pb; pCXLE-hSK sont de 10 200 bp et 2 500 bp.

3. Nucléofection

  1. Granulation de cellules
    1. Cultiver les fibroblastes de villosités chorioniques fœtales isolés dans une fiole de T25 dans 5 mL de milieu complet jusqu’à 80-90% de confluence.
    2. Lavez les cellules deux fois avec du PBS et essayez-les comme décrit aux étapes 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. Retirer le surnageant, resussuspender la pastille dans 5 mL de milieu de sérum réduit (p. ex. Opti-MEM). Compter les cellules avec hémocytomètre et prendre 106 cellules pour la nucléofection. Centrifuger à 225 x g pendant 5 min. Retirez complètement le surnageant.
  2. Préparation et nucléofection de réactifs
    1. Préparer le réactif du nucléofectoriel en mélangeant 0,5 mL de supplément et 2,25 mL de solution de nucléofector (tous deux fournis dans le kit).
    2. Ajouter 100 μL de solution de nucléofectoriel dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 1μg de pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK et pCXLE-hUL au tube. Remettez doucement en question 106 cellules (à partir de l’étape 3.1.2) dans ce mélange.
    3. Transférer la suspension d’ADN cellulaire dans une cuvette, en veillant à ce que l’échantillon recouvre le fond de la cuvette (fournie en kit) sans bulles d’air. Coiuchez la cuvette et insérez-la dans le support. Sélectionnez le programme de nucléofectoriel U-23 (pour une efficacité élevée) et appliquez.
    4. Retirer la cuvette du support et ajouter 1 mL de support complet. Transférer doucement le contenu dans une boîte de Petri traitée par culture tissulaire de 60 mm remplie de 4 mL de milieu complet (pour un total de 5 mL de milieu). Incuber les cellules dans un incubateur à CO2 humidifié à 37 °C.
    5. Après 24 h, vérifiez si les cellules se sont attachées. Remplacez complètement le support.
      REMARQUE: Le taux de mort cellulaire est élevé en nucléofection, laissant peu de cellules viables qui se fixent.
    6. Maintenez les cellules dans un milieu complet pendant 10 jours et passez au milieu de pluripotence pendant les 20 prochains jours.
      REMARQUE: Visualisez régulièrement les cellules pour suivre les changements morphologiques qui se produisent dans les cellules de reprogrammation (comme la morphologie épithéliale et la formation de colonies compactes) pour confirmer si l’expérience fonctionne. Environ 25 colonies d’iPSC peuvent être observées après 20 jours de culture dans des milieux de pluripotence.

4. Cueillette et propagation des colonies de CS IPC

  1. Cueillette de la colonie à partir de la plaque de reprogrammation
    1. Disséquez manuellement les colonies embryonnaires ressemblant à des cellules souches formées dans le plat de reprogrammation à l’aide de pipettes en verre tiré ou d’aiguilles de seringue de 1 mL et transférez-les sur une plaque préalablement préparée avec des mangeoires de fibroblastes embryonnaires de souris inactivées avec milieu de pluripotence ou établissez des cultures sans mangeoire sur des plaques revêtues de Matrigel avec un milieu mTESR.
      REMARQUE: Les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ont été dérivés en utilisant l’isolement enzymatique d’embryons de souris (disséqués à partir de souris femelles enceintes de 13 à 14 jours) et ont été inactivés mitotiquement par le traitement à la mitomycine C. Établir des populations de clones uniques en cultivant des colonies uniques à partir de plaques de reprogrammation dans des plats séparés ou des populations de clones mixtes en transférant de nombreuses colonies de la plaque de reprogrammation à un seul plat.
  2. Transfert mécanique des colonies émergentes vers des mangeoires fraîches et passaging pour établir des CSPe stables
    1. Propager les CSPi dans un milieu de pluripotence en les nourrissant tous les deux jours et fractionner 1:3 tous les 5 à 7 jours. Préparer les stocks en cryoconservant dans un mélange de congélation de KnockOut Serum Replacement et de DMSO dans un rapport de 9:1.
      REMARQUE: KnockOut Serum Replacement est utilisé dans le mélange de congélation pour la cryoconservation des CSI au lieu de FBS, car les composants du FBS pourraient induire une différenciation des cellules pluripotentes pendant la conservation à long terme.

5. Caractérisation des CS IPC

NOTE: Des études de caractérisation, y compris la PCR et l’immunocoloration pour le biomarqueur de pluripotence, ont été effectuées après le cinquième numéro de passage. Le caryotypage a été effectué à un numéro de passage ultérieur.

  1. Caryotypage
    1. Traiter une boîte de Petri confluente de 60 mm de CSI avec du colcémide pendant 45 min dans un incubateur à CO2 humidifié à 37 °C.
    2. Récolte par 0,05% de traitement à la trypsine et centrifugeuse. Retirez le surnageant et pipetez les traces restantes de milieu pour desserrer la pastille de cellule.
    3. Ajouter 5 mL de solution hypotonique. Mélanger par tube inversé et incuber pendant 20 minutes à 37 °C. Centrifuger à 225 x g pendant 5 min.
      REMARQUE: Le granulé obtenu doit sembler moelleux.
    4. Ajouter lentement 2,5 mL de solution fixatrice de Carnoy, tout en tapotant pour desserrer la pastille.
    5. Préparez les tartinades pour le caryotypage en déposant la suspension cellulaire sur des lames de verre propres.
    6. Traiter les lames avec 0,15% de trypsine pendant 1 minute et laver une fois avec du PBS. Ensuite, tachez avec la solution de Giemsa pendant 4 min et terminez par un lavage à l’eau distillée. Acquérir et traiter avec un logiciel approprié.
  2. Démonstration du statut de transgène libre
    1. Isolement génomique de l’ADN
      1. Pipette 20 μL de protéase dans le fond d’un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
      2. Ajouter 200 μL de TSiPSCs mis enssais dans le PBS au tube de microcentrifugation.
      3. Ajouter 200 μL de Buffer AL à l’échantillon et mélanger pendant 15 s par vortex d’impulsions.
      4. Incuber pendant 10 min à 56 °C.
      5. Centrifugez brièvement le tube de microcentrifugation pour éliminer les gouttes de l’intérieur du couvercle.
      6. Ajouter 200 μL d’éthanol (96-100%) à l’échantillon, et mélanger à nouveau pendant 15 s par vortex d’impulsions. Après le mélange, centrifugez brièvement le tube pour éliminer les gouttes de l’intérieur du couvercle.
      7. Appliquez soigneusement le mélange de l’étape précédente sur la mini colonne de rotation (dans un tube de collecte de 2 mL) sans mouiller la jante. Fermez le bouchon et centrifugez à 6000 x g pendant 1 min. Jetez le tube contenant le filtrat et placez la mini colonne de spin dans un tube de collecte propre de 2 mL.
      8. Ouvrez soigneusement la mini colonne de rotation et sans mouiller la jante, ajoutez 500 μL de Buffer AW1. Fermer le bouchon et centrifuger à 6000 x g pendant 1 min. Placez la mini colonne de rotation dans un tube de collecte propre de 2 mL et jetez le tube de collecte contenant le filtrat.
      9. Ouvrez soigneusement la mini colonne de rotation et ajoutez 500 μL de Buffer AW2 sans mouiller la jante. Fermez le bouchon et centrifugez à pleine vitesse (20 000 x g) pendant 3 min.
      10. Placez la mini colonne de rotation dans un nouveau tube de collecte de 2 mL et jetez l’ancien tube de collecte avec le filtrat. Centrifugez à pleine vitesse pendant 1 min pour éliminer le risque de transfert possible du tampon AW2.
      11. Placez la mini colonne de rotation dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 mL et jetez le tube de collecte contenant le filtrat. Ouvrez soigneusement la mini colonne de rotation et ajoutez 200 μL de Buffer AE ou d’eau distillée. Incuber à température ambiante (15-25 °C) pendant 5 min, puis centrifuger à 6000 x g pendant 1 min.
    2. PCR d’état sans transgène (à l’aide du kit de PCR HiFi KAPA KR0368)
      1. Assurez-vous que tous les réactifs sont correctement décongelés et mélangés.
      2. Préparer un mélange maître PCR contenant le volume approprié de tous les composants de la réaction en fonction du tableau 2 (mettre en place des réactions sur la glace).
      3. Transférez les volumes appropriés de mélange maître, de gabarit et d’amorce de PCR dans des tubes pcR individuels.
      4. Capuchons les réactions individuelles, mélangez et centrifugez brièvement.
      5. Effectuez la PCR en suivant le tableau 3.
  3. Identification des biomarqueurs de pluripotence
    1. Coloration à la phosphatase alcaline (AP)
      1. Préparer une solution de travail de teinture vivante 1x AP en diluant 3 μL de solution mère 500x dans 1,5 mL de DMEM/F-12 pour chaque 10 cm2 de surface de culture.
      2. Retirez le milieu de la boîte de culture iPSC. Lavez la culture avec DMEM/F-12 une fois. Ajoutez la solution de coloration sous vie 1x AP sur les iPSC. Incuber à 37 °C pendant 45 min.
      3. Retirez la tache AP et lavez deux fois avec DMEM/F-12. Ajoutez du DMEM/F-12 frais et une image au microscope fluorescent à l’aide d’un filtre FITC standard dans les 30 à 90 minutes de coloration.
    2. Immunocoloration pour les biomarqueurs de pluripotence
      1. Fixer des cultures iPSC confluentes avec 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit à 4 °C. Laver trois fois avec PBS Tween 20 (PBST), chaque lavage pendant 5 min.
      2. Perméabiliser les cellules avec 0,3% de Triton X-100 dans PBST pendant 15 minutes à température ambiante. Laver trois fois avec PBST.
        REMARQUE: La perméabilisation ne doit être effectuée que pour les antigènes intracellulaires.
      3. Bloquer les cellules avec 3% d’albumine sérique bovine (BSA) dans le PBST pendant 30 min à température ambiante. Colorez les cellules avec des anticorps primaires (dilués 1:1000 dans 1% de BSA) pendant la nuit. Après l’incubation primaire des anticorps, laver trois fois avec pbST.
      4. Incuber les cellules avec l’anticorps secondaire (dilué 1:1000 dans 1% de BSA) pendant 5 h à température ambiante. Laver trois fois avec PBST.
      5. Étiqueter les noyaux avec 0,5 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 1 minute. Lavez les cellules une fois avec PBST.
      6. Capturez des images au microscope fluorescent.

6. Essais de différenciationin vitro

  1. Différenciation du corps embryoïde (EB)
    1. Couper les colonies d’iPSC en petits morceaux, recueillir et plaquer dans des boîtes de Petri à faible attachement dans un milieu de corps embryoïde. Cultivez les cellules pendant 15 jours en remplaçant le milieu tous les 3 jours.
      REMARQUE: Le jour 15 EBs peut être utilisé directement pour la détection des trois biomarqueurs de la couche germinale. Alternativement, des lignées cellulaires spécifiques peuvent être induites par des facteurs de croissance, suivies de la détection de biomarqueurs.
  2. Différenciation de l’endoderme (hépatocyte)
    1. Cultivez les iPSC dans des cultures monocouches en milieu de pluripotence.
    2. Une fois confluent, passez au milieu RPMI 1640 avec 1x sélénite de transferrine d’insuline et 100 ng / mL d’activine A pendant 2 jours, suivi d’une croissance du milieu RPMI 1640 avec 30 ng / mL bFGF et 20 ng / mL BMP4 pendant 9 jours. Remplacer le moyen tous les 2 jours.
    3. À partir du jour 10, complétez le milieu avec 0,1 μM de dexaméthasone. Terminez l’expérience le jour 20.
  3. Différenciation du mésoderme (cardiomyocyte)
    1. Plaque jour 8 EBs sur des plaques enduites de Matrigel à 0,5% dans un milieu de corps embryoïde. Autorisez les ABE à s’attacher et à se réduire.
    2. Complétez les milieux avec 20 ng / mL BMP4 et cultivez pendant 20 jours. Remplacer le milieu tous les 2-3 jours. Terminez l’expérience le jour 20.
  4. Différenciation ectodermique (neuronale)
    1. Plaque jour 4 EBs sur 2 μg/cm2 plaques enduites de collagène de type IV dans un milieu corporel embryoïde. Autorisez les ABE à s’attacher et à se réduire.
    2. Le lendemain, déplacez le milieu vers DMEM F-12 avec 2 mg / mL de glucose, 1x sélénite de transferrine d’insuline et 2,5 μg / mL de fibronectine. Terminez l’expérience le jour 15.
  5. Formation d’organoïdes cérébraux
    1. Cultivez des TSiPSC dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm sur des MEF jusqu’à 70-80% confluent. Coupez les colonies et collectez dans un tube de 15 mL. Centrifuger les cellules à 225 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
    2. Laver les morceaux de colonies en les remettant en jubasse dans 2 mL de PBS et centrifuger pour enlever le surnageant.
    3. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % et tapoter le tube pour déloger les cellules. Incuber le tube à 37 °C pendant 3-4 min pour dissocier les morceaux de colonie en une suspension à cellule unique.
    4. Neutraliser la trypsine par dilution avec 4 mL de milieux de pluripotence contenant 10 μg/mL d’inhibiteur de la protéine kinase rho-associée (ROCK) Y-27632 dichlorhydrate (ROCKi) pour prévenir la mort cellulaire induite par la dissociation.
    5. Centrifuger pour obtenir une pastille. Jeter le surnageant et ressusser les cellules dans un milieu de corps embryoïde de 2 mL contenant 10 μg/mL de ROCKi.
    6. Retirer 10 μL de suspension cellulaire pour le comptage cellulaire. Ajouter 10 μL de bleu trypan pour détecter les cellules mortes. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    7. Ajouter un volume approprié de milieu corporel embryoïde avec ROCKi à la suspension cellulaire pour obtenir 9 000 cellules vivantes par 150 μL.
    8. Plaque 150 μL dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à faible fixation et incuber dans un incubateur à CO2 humidifié à 37 °C. Vérifiez l’agrégation des plaques après 24 heures. Le jour 2, retirez doucement le milieu et remplacez-le par un milieu embryside frais sans ROCKi.
    9. Le jour 6, transférer les OE vers des puits d’une plaque de 24 puits à faible fixation contenant 500 μL de milieu d’induction neuronal composé de DMEM-F12 avec supplément de N2 à 1%, supplément de GlutaMAX à 2 mM et 1 mM d’acides aminés non essentiels et 1 μg/mL d’héparine. Changez le support tous les 2 jours.
    10. Après 5 jours dans un milieu d’induction neuronale, incorporez les agrégats neuroépithéliaux dans Matrigel en superposant un carré de parafilm de 2 cm x 2 cm sur un plateau de pointe vide de 200 μL. Appuyez sur le parafilm avec les doigts gantés sur chaque trou du plateau de pointe pour faire de petites bosses. Nettoyez le parafilm avec 70% d’éthanol à stériliser.
    11. Transférer le carré de parafilm dans un plat de 60 mm. Utilisez des pointes coupées de 200 μL pour transférer les agrégats neuroépithéliaux sur les bosses dans le parafilm. Enlever l’excès de milieu par pipetage.
    12. Ajouter 30 μL de Matrigel décongelé sur les agrégats neuroépithliens et positionner l’agrégat au centre du Matrigel à l’aide d’une pointe de pipette. Placez le plat de 60 mm pendant 20 à 30 min dans un incubateur à 37 °C pour que le Matrigel se polymérise.
    13. Ajouter 5 mL de milieu de différenciation organoïde cérébrale composé de 1:1 DMEM-F12: milieu neurobasal, supplément de N2 à 0,5%, 2,5 μg / mL d’insuline, supplément de GlutaMAX de 2 mM, 0,5 mM de NEAA, supplément de B27 à 1% et 2,5 mL de pénicilline-streptomycine.
    14. À l’aide d’une pince stérile, retournez la feuille de parafilm et agitez le plat jusqu’à ce que les agrégats incorporés par Matrigel tombent de la feuille dans le milieu. Cultivez les agrégats incorporés dans un incubateur à CO2 humidifié à 37 °C pendant 4 jours en donnant des changements de média un jour sur deux.
    15. Après 4 jours de culture statique, placez les plats de 60 mm sur un agitateur orbital installé à l’intérieur de l’incubateur à 50 tr / min. Culture des organoïdes pendant 3 mois en donnant des changements complets du milieu de milieu de différenciation organoïde cérébrale tous les 3 jours.

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Résultats

Génération de CSPe sans intégration à partir d’un fœtus avorté spontanément avec un caryotype 45XO
Nous avons isolé des fibroblastes de FCV avec un caryotype 45XO spécifique du syndrome de Turner (TS) et les avons nucléofectés avec des plasmides de reprogrammation épisomique pour générer des TSiPSC qui peuvent être utilisés pour la modélisation en aval du syndrome, en particulier les déficits neurologiques associés(Figure 1a& b). Nous avons utilisé de...

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Discussion

La génération de modèles cellulaires stables de tissu fœtal cytogénétiquement anormal est nécessaire pour perpétuer un phénotype défectueux. La voie iPSC est la méthode la plus efficace de préparation cellulaire pour la conservation perpétuelle des propriétés défectueuses20.

Les cellules souches pluripotentes (CSE) présentent des propriétés d’auto-renouvellement et de différenciation en cellules spécialisées qui rappellent les embryons de clivage précoce

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le soutien financier pour la recherche ci-dessus a été fourni par Manipal Academy of Higher Education. La caractérisation de la lignée a été réalisée en partie dans le laboratoire de M.M. Panicker au NCBS. Nous remercions Anand Diagnostic Laboratory pour son aide avec le caryotypage.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,15 % de trypsineThermo Fisher Scientific27250018G Banding
2-mercaptoéthanolThermo Fisher Scientific21985023Pluripotence et milieu corporel embryoïde
4', 6 diamidino-2-phénylindoleSigma AldrichD8417Immunocytochimie
Activine ASigma AldrichSRP3003Tests
de différenciationPhosphatase alcaline ColorationVivante Thermo Fisher ScientificA14353Coloration AP
AMAXA Nucleofector II
AmnioMAX II milieu completThermo Fisher Scientific, Gibco11269016Milieu spécifique pour les cultures de cellules de villosités choriales fœtales
AmpicillineHiMediaTC021Purification plasmidique
Anti souris IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11059Immunocytochimie
Anti IgG de lapin (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11034Immunocytochimie
Anti IgG de lapin (H+L) Alexa Fluor 546InvitrogenA11035Immunocytochimie
Antibiotique-AntimycotiqueThermo Fisher Scientific, Gibco15240096Contrôle de
la contaminationAnti-E-CadhérineBD Biosciences610181Immunocytochimie
Anti-NanogBD Biosciences560109Immunocytochimie
Anti-OCT3/4BD Biosciences611202Immunocytochimie
Anti-SOX17BD Biosciences561590Immunocytochimie
Anti-SOX2BD Biosciences561469Immunocytochimie
Anti-SSEA4BD Biosciences560073Immunocytochimie
Anti-TRA 1-81MilliporeMAB4381Immunocytochimie
basique Facteur de croissance des fibroblastes[FGF2]Sigma AldrichF0291Milieu de pluripotence
Facteur morphogénétique osseux 4Sigma AldrichSRP3016Tests de différenciation
bovin Albumine sériqueSigma AldrichA3059Blocage
collagène humain Type IVBD Biosciences354245Tests de différenciation
Mélange de collagénaseSigma AldrichC8051Digestion des villosités choriales fœtales
DexaméthasoneSigma AldrichD4902Tests de différenciation
DMEM F12Thermo Fisher Scientific11320033Tests de différenciation
FastDigest EcoR1Thermo ScientificFD0274Digestion de restriction
FibronectineSigma AldrichF2518Tests de différenciation
Giemsa StainHiMediaS011G Banding
Glacial Acetic AcidHiMediaAS001Fixateur pour le caryotype
GlucoseSigma AldrichG7528Tests de différenciation
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Pluripotence et milieu corporel embryoïde
Héparine sodiqueSigma AldrichH3149Tests de différenciation
Solution d’insuline humaineSigma AldrichI9278Tests de différenciation
Insuline Transferrine SéléniteSigma AldrichI1884Tests de différenciation
KAPA HiFi PCR kitKapa BiosystemsKR0368OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX ColcemidThermo Fisher Scientific15210040Arrêt mitotique pour caryotype
KnockOut DMEMThermo Fisher Scientific10829018Pluripotence et milieu de corps embryoïde
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Pluripotence et milieu corporel embryoïde
Luria Bertani AgarHiMediaM1151FPurification plasmidique
MatrigelBD Biosciences356234Tests de différenciation
MEM Acides aminés non essentiels ThermoFisher Scientific11140035Pluripotence et milieu corporel embryoïde
MéthanolHiMediaMB113Fixateur pour le caryotypage
Chaîne lourde ventriculaire de myosine &alpha ;/&beta ;MilliporeMAB1552Immunocytochemistry
NHDF Nucleofector KitLonzaVAPD-1001Nucleofection
Paraformaldehyde (PFA)Sigma AldrichP6148Cellules fixatrices
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-FAddgene27077Plasmide de reprogrammation épisomique
pCXLE-hSKAddgene27078Plasmide de reprogrammation épisomale
pCXLE-hULAddgene27080Reprogrammation épisomale du plasmidique
Pénicilline Streptomycine  ; Thermo Fisher Scientific,  ; 15070063Pluripotence et milieu corporel embryoïde
Phalloïdine- Tétraméthylrhodamine B isothiocyanateSigma AldrichP1951Immunocytochimie
Solution saline tamponnée au phosphateSigma AldrichP44171 X PBS 1 comprimé de PBS dissous dans 200 ml d’eau déminéralisée et stérilisé par autoclavage
Stockage : Température ambiante.
PBST- 0,05 % Tween 20 en 1X PBS.
Stockage : Température ambiante.
Kit de purification de plasmides - Préparation midiQIAGEN12143Purification de plasmides
Solution de chlorure de potassiumHiMediaMB043Solution hypotonique pour le caryotypage
QIAamp DNA Blood KitQiagen51104Isolation de l’ADN génomique
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093Milieu de différenciation des hépatocytes
Citrate de sodiumHiMediaRM255Solution hypotonique pour le caryotypage
Triton X-100HiMediaMB031Perméabilisation
Trypsine-EDTA (0,05 %)Thermo Fisher Scientific, Gibco25300054Sous-culture de   ; fibroblastes de villosités choriales fœtales
Tween 20HiMediaMB067Préparation de PBST
&beta ; III tubulineSigma AldrichT8578Immunocytochimie
Y-27632 dichlorhydrateSigma AldrichY0503Tests de différenciation
Lonza-Nucleofection du

Références

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