Détection de l’accumulation de β amyloïde par coloration immunofluorescente dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer

Résumé

Dans la neuropathologie de la maladie d’Alzheimer, l’une des caractéristiques les plus cruciales est le dépôt de β amyloïde. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de coloration immunofluorescente chez la souris transgénique 5×FAD pour détecter l’accumulation de β amyloïde dans les plaques. Le processus de perfusion, de cryosection, de coloration et de quantification sera décrit en détail.

Résumé

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative qui contribue à 60 à 70 % de la démence dans le monde. L’une des caractéristiques de la MA réside sans aucun doute dans l’accumulation de β amyloïde (Aβ) dans le cerveau. Aβ est produit à partir du clivage protéolytique de la protéine précurseur bêta-amyloïde (APP) par la β-sécrétase et la γ-sécrétase. Dans des circonstances pathologiques, l’augmentation du clivage β de l’APP conduit à une surproduction de Aβ, qui s’agrège en plaques Aβ. Étant donné que les plaques Aβ sont une caractéristique de la pathologie de la MA, la détection de la quantité de Aβ est très importante dans la recherche sur la MA. Dans ce protocole, nous introduisons la méthode de coloration immunofluorescente pour visualiser le dépôt d’Aβ. Le modèle murin utilisé dans nos expériences est le 5×FAD, qui porte cinq mutations trouvées dans la MA familiale humaine. Les déficits neuropathologiques et comportementaux des souris 5xFAD sont bien documentés, ce qui en fait un bon modèle animal pour étudier la pathologie Aβ. Nous présenterons la procédure comprenant la perfusion transcardique, la cryosection, la coloration immunofluorescente et la quantification pour détecter l’accumulation d’Aβ chez les souris 5×FAD. Grâce à ce protocole, les chercheurs peuvent étudier la pathologie Aβ dans un modèle murin de MA.

Introduction

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative qui provoque 60 à 70 % de démence dans le monde et coûte beaucoup de ressources sociales¹. Il est bien connu que l’accumulation de β amyloïde (Aβ) est une caractéristique pathologique de la maladie d’Alzheimer. La protéine précurseur de l’amyloïde (APP) est une protéine membranaire intégrale qui existe dans de nombreux tissus. Le peptide Aβ, composé de 36 à 42 acides aminés², est produit par le clivage ultérieur de la β- et de la γ-sécrétase dans l’APP ^3,4. Les modifications du clivage de l’APP et les mutations du gène APP entraînent une surproduction de Aβ. Les molécules Aβ peuvent s’agréger pour former des oligomères ou des fibrilles, que l’on pense être neurotoxiques ^5,6. Dans des études antérieures, il a été démontré que l’accumulation d’Aβ était corrélée à la mort neuronale dans AD^{7, 8, 9}.

Les souris transgéniques 5×FAD (C57BL/6J) contiennent 3 mutations de l’APP et 2 mutations de PSEN1. L’accumulation d’Aβ intracellulaire commence dès l’âge de 1,5 mois. Une accumulation extracellulaire d’Aβ a été constatée vers 2 mois, dans le cortex et l’hippocampe. L’accumulation a augmenté rapidement avec l’âge de¹⁰ ans. La pathologie Aβ bien documentée en fait un bon modèle animal pour notre protocole.

L’objectif de la méthode de coloration décrite est de visualiser et de quantifier le dépôt d’Aβ dans le cerveau d’un modèle de souris MA. La procédure comprenant la perfusion transcardique de paraformaldéhyde, la cryosection, la coloration immunofluorescente et la quantification pour détecter l’accumulation d’Aβ chez les souris 5×FAD sera introduite. Ce protocole est une méthode fiable et facile pour étudier la pathologie Aβ dans un modèle murin de MA.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées avec l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Xuzhou et conformément aux directives de la réglementation gouvernementale chinoise pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Perfusion de souris

REMARQUE : Plus de détails sur la procédure de perfusion peuvent se référer à la vidéo du laboratoire ¹¹ de Wiliam Shain.

1. Anesthésie des souris transgéniques 5×FAD (C57BL/6J) avec 1 % de pentobarbital sodique (50 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale^12,13. La perte de réponse au pincement de la patte arrière indique une anesthésie appropriée. Ne commencez pas la perfusion avant que la souris ne soit correctement anesthésiée.
2. Utilisez quatre goupilles pour fixer les membres sur la planche de polyfoam. Placez l’abdomen de la souris anesthésiée vers le haut, avec ses membres suffisamment étirés. Utilisez une paire de ciseaux à iris pour faire une incision au niveau du processus xiphoïde. Ensuite, le diaphragme sera exposé.
3. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision sur le diaphragme et continuez soigneusement l’incision du diaphragme jusqu’à la limite supérieure de la cage thoracique. Coupez les côtes et les muscles thoraciques, disséquez les tissus attachés pour exposer le cœur.
4. Trouvez l’oreillette droite de la souris. Ouvrez l’oreillette droite à l’aide de ciseaux à iris.
5. Injectez 20 mL de PBS à 37 °C (0,01 M, pH 7,2-7,4) à partir du ventricule gauche du cœur pour évacuer le sang. Injectez ensuite lentement 20 ml de PFA à 4 % de température ambiante à partir du ventricule gauche pour fixer les tissus. Le taux d’injection de PBS et de PFA à 4 % est d’environ 5 mL/min. Les tremblements de fixation doivent être observés en quelques secondes.
   ATTENTION : 4 % de PFA peut irriter les yeux et les voies respiratoires, et peut provoquer des réactions allergiques. Cette étape doit être effectuée dans des endroits ventilés et l’opérateur doit porter des lunettes de sécurité et des masques faciaux.
6. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la tête et retirez soigneusement le crâne, utilisez une pince à dissection et extrayez le cerveau. Ensuite, immergez le cerveau dans 4 ml de PFA à 4 % dans un tube en plastique de 5 ml pendant 12 à 24 h à 4 °C.

2. Intégration et cryosection

1. Après fixation dans 4 % de PFA, transférez le cerveau dans 4 ml de saccharose à 15 % dans un tube en plastique de 5 ml à 4 °C. Après 12-24 h, le cerveau devrait couler au fond.
2. Transvasez le cerveau dans 4 ml de saccharose à 30 % dans un tube de plastique de 5 ml à 4 °C pendant 12 à 24 h. Ensuite, le cerveau est prêt à être intégré. Le but du trempage par étapes à 15 % et 30 % de saccharose est de déshydrater le cerveau, ce qui évite la formation de cristaux de glace à l’intérieur des cellules lors de l’enrobage et de la cryosection. Le cerveau déshydraté peut être stocké à 4°C pendant une semaine.
3. Laissez environ 1 ml de saccharose avec le cerveau dans le tube. Ajoutez ensuite le même volume de composé à température de coupe optimale (OCT) dans le tube et mélangez correctement. Cela aide le composé OCT à envelopper le cerveau plus suffisamment.
4. Montez une épaisse couche de composé OCT sur la surface du bouton et congelez à -21 °C avant la cryosection. Coupez le cerveau sagittairement à partir du milieu ; Utilisez l’une ou l’autre moitié pour la coupe dans un cryostat.
5. Une fois que le composé OCT s’est solidifié, montez le bouton sur la tête de l’échantillon et coupez-le pour en faire une surface de plate-forme. Posez une moitié du cerveau sur la surface coupée avec le côté médian vers le bas.
6. Placez un anneau en papier d’aluminium autour du cerveau pour éviter les fuites de composé OCT, puis remplissez l’anneau avec du composé OCT jusqu’à ce que le cerveau soit immergé. Lorsque l’enrobage du composé OCT se solidifie, il est prêt pour le sectionnement.
7. Réglez l’épaisseur de la section à 20 μm. Réglez la température de la chambre sur -21 °C et la température de la tête de l’échantillon sur -19 °C. Sectionnez le cerveau de l’extrémité rostrale à l’extrémité caudale.
8. Brossez un peu de PBS sur les lames de verre. Pré-enduire les lames de verre de poly-lysine pour éviter que les sections ne se décollent. Fixez la section sur la glissière. Si la section est pliée, utilisez une brosse douce pour déplier les sections avec du PBS.
9. Séchez les sections pendant la nuit à température ambiante et conservez-les à -20 °C. Les sections peuvent être maintenues à -20 °C jusqu’à un mois avant la coloration Aβ.

3. Procédure de coloration Aβ

1. Réchauffez les sections à température ambiante, séchez la surface de la lame et utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la section pour l’incubation des anticorps.
2. Faites tremper la lame dans du PBS dans une boîte de coloration en plastique de 30 ml pour éliminer le composé OCT. Utilisez au moins 20 ml de PBS.
3. Ajouter 100 μL de solution de récupération d’antigène 1x pour les sections congelées sur la lame. Incuber 5 min à température ambiante.
4. Lavez la solution de récupération avec au moins 20 ml de PBS à température ambiante pendant 3 fois (5 minutes pour chacune).
5. Ajouter l’anticorps primaire dilué (6E10) sur les sections et incuber à 4 °C pendant 16 à 24 h dans une boîte humide et sombre (solution de dilution d’anticorps primaires : 1 % BSA, 0,3 % Triton X-100, 0,01 % d’azoture de sodium dans PBS, dilution 1:500). BSA fonctionne comme un agent de blocage.
6. Lavez les sections avec du PBS pendant 3 fois, 5 min à chaque fois.
   REMARQUE : Effectuez les étapes 3.7, 3.8 et 3.9 dans un endroit sombre.
7. Incuber des sections dans une solution d’anticorps secondaires (farine Alexa 594 anti-souris anti-souris IgG (H+L), diluée avec du PBS 1:200) pendant 1 h à température ambiante dans une boîte humide et sombre.
8. Lavez l’anticorps secondaire des sections avec au moins 20 ml de PBS pendant 3 fois, 5 minutes à chaque fois.
   REMARQUE : Ne versez pas de PBS sur les sections pendant le lavage pour éviter que les sections ne se décollent. Gardez les sections humides.
9. Absorbez le liquide autour des sections et ajoutez une goutte de support de montage sur chaque section. Scellez les sections avec du verre de protection, en évitant les bulles.
10. Observez les sections colorées à l’aide d’un microscope à fluorescence. Conservez la cohérence des paramètres d’imagerie pour éviter toute dérivation. Conservez les lames à 4°C dans un endroit sombre. Analysez les sections dans un délai d’une semaine, car les taches s’estomperont avec le temps.

4. Imagerie et quantification de l’accumulation d’Aβ par ImageJ

1. Capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence connecté à un appareil photo numérique et à un logiciel d’imagerie. Nous avons utilisé le logiciel Image Pro Plus et le paramètre d’imagerie a été réglé comme suit : Exp Pvw : 450 ms, Exp Acq : 450 ms ; Pvw : 1 × 1, Acq : 1 × 1 ; Résolution Pvw : Largeur 1 × Hauteur 1, acq Résolution : Largeur 1 × Hauteur 1 ; Profondeur de capture : mono 8 bits ; Gain : Pvw : 13, Acq : 13, Gamma : Pvw : 1, Acq : 1, Offse : Pvw : -700, Acq : -700.
2. Dans ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji), sélectionnez Plug-ins | Couture | MosaicJ dans le menu. Sélectionnez ensuite Fichiers | Ouvrir la séquence d’images pour ouvrir les images à assembler (Figure 1A).
3. Toutes les images sélectionnées seront affichées en bas. Après avoir assemblé les images manuellement, sélectionnez Fichier | Créez une mosaïque (Figure 1B, C, D).
4. Sélectionnez une image | Ajuster | Luminosité/Contraste..., et ajustez la luminosité et le contraste de l’image (Figure 3A). Ensuite, l’image peut être sauvegardée (Figure 1E).
5. Pour quantifier l’accumulation de Aβ, ouvrez l’image via Fichier | Ouvrir... dans le menu (Figure 2A).
6. Sélectionnez une image | Type | 8 bits pour ajuster l’image à 8 bits. Choisissez ensuite la zone à compter à l’aide de la sélection de polygones (Figure 2B).
7. Sélectionnez une image | Ajuster | Seuil pour sélectionner le seuil approprié de signaux. Le seuil peut être ajusté en faisant glisser les barres de défilement ou en modifiant les chiffres directement dans la zone de texte (maximum : 255, minimum : 0). Lorsque tous les signaux Aβ de la section sont devenus rouges, le seuil est approprié pour la mesure (Figure 2C). Assurez-vous que la case Fond sombre est cochée.
8. Sélectionnez Analyser | Définir la mesure... dans le menu pour choisir les paramètres qui seront affichés dans les résultats. Vérifiez que l’option Densité intégrée et Limiter au seuil est sélectionnée. La masse volumique intégrée (intensité totale) est la cible de la mesure (Figure 2D).
9. Sélectionnez Analyser | Mesurez pour obtenir les résultats. Les résultats seront affichés et prêts pour l’analyse statistique (Figure 2E).

Résultats

Nous avons utilisé les procédures de coloration immunofluorescente décrites ci-dessus pour étudier le dépôt de l’accumulation d’Aβ chez des souris 5×FAD d’âges différents. La figure 3 représente les résultats typiques et les résultats sous-optimaux obtenus à l’aide de notre protocole. Des coupes cérébrales de souris transgéniques hétérozygotes 5×FAD de 5 mois et 8 mois et de témoins de type sauvage de 4 à 6 mois ont été colorées avec l’anticorps 6E10 et détectées au microscope à fluorescence...

Discussion

La coloration immunofluorescente à l’aide de l’anticorps 6E10 peut détecter spécifiquement l’accumulation d’Aβ dans le cerveau, ce qui est facile à quantifier par l’image J. Ce qui vaut la peine de noter, c’est que certaines étapes cruciales de ce protocole peuvent affecter les résultats.

Pour éviter que les tranches ne se décollent ou ne se cassent comme le montre la figure 3C, quelques points clés doivent être remarqués. La perf...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue d’injection
	KLMEDICAL		1 mL
Pentobarbitual sodique	Sigma-Aldrich	P3761	1 % dans une solution saline pour injection i.p.
Thoracotomie :
IRIS-Fine Ciseaux à iris droits (~11,5 cm)	RWD	S12010-11
Ciseaux chirurgicaux incurvés tranchants(11.5 cm)	RWD	S14016-11
Pince à dissection droite (~10.5 cm)	RWD	F12010-10
Perfusion
Tube centrifuge (5 mL)	Biosharp
Seringue d’injection	KLMEDICAL		20 mL
Paraformaldéhyde	Vicmed	VIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) poudre	Vicmed	VC2001P	Ajouter de l’eau désionisée pour obtenir une solution
Fixation, déshydratation et Cryosectionnement
microscope	CITOTEST	188105	76,2 mm × ; 25,4 mm
Microtome Cryostat	LEICA	CM1950
Composé à température de coupe optimale (OCT)	Sakura Finetek	4583
Saccharose	VETEC	V900116
coloration par immunofluorescence
Microscope à fluorescence	OLYMPUS	IX-81
Anticorps secondaire anti-souris IgG (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11005	200X
Image-Pro Plus 7.0C	Media Cybernetics		Logiciel de graphisme et d’analyse de données scientifiques
Immunohistochemical Wet Box (noir)	Sinylab	Customized	300 mm × ; 100 mm × ; 38 mm, profondeur de rainure 27 mm, peut contenir 10 lames standard
Pipette	Thermo Scientific
Pointes	de pipette
Boîte de coloration en plastique	Sinylab	Personnalisée	30 mL, peut contenir 5 lames standard
Tampon de dilution d’anticorps primaire	fabriqué dans notre laboratoire		1 % BSA 1g, 0,3 % Triton X-100 300ul, 0,01 % azoture de sodium 10mg dans 100ml PBS
Purifié anti-bêta-amyloïde, anticorps 1-16 (6E10)	Biolegend	SIG-39320	500X
Solution de récupération rapide d’antigène pour congelé Sections	KeyGEN BioTECH	KGIHC005	5X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1	Graphpad		Logiciel de cartographie médicale
Image J Fiji 2.0.0	National Institute of Health		Scientific Logiciel de graphisme et d’analyse de données