Microgouttelettes à coquille de diméthyldioctadécylammonium à changement de phase en tant que système d’administration de médicament prometteur : résultats sur des sphéroïdes 3D de cellules tumorales de mammifères

Résumé

Les microgouttelettes de décafluoropentane développées avec une coquille de bromure de diméthyldioctadécylammonium présentaient une stabilité colloïdale exceptionnelle et une biointerface actractive. Les DDAB-MD se sont avérés être des réservoirs de médicaments efficaces caractérisés par une forte affinité pour les membranes plasmiques ainsi qu’une absorption accrue et une activité antitumorale de la doxorubicine contre le cancer du sein humain triple négatif (MDA-MB-231) modèle 3D.

Résumé

L’amélioration significative des microgouttelettes de perfluorocarbone (DM) à changement de phase dans le vaste scénario théranostique passe par l’optimisation de la composition des DM en ce qui concerne l’efficacité de synthèse, la stabilité et la capacité d’administration de médicaments. Dans ce but, des DM de décafluoropentane (DFP) stabilisés par une coquille de surfactant cationique au bromure de diméthyldioctadécylammonium (DDAB) ont été conçus. Une forte concentration de DDAB-MD a été facilement obtenue en quelques secondes par insonation pulsée de haute puissance, ce qui a donné lieu à des gouttelettes de faible polydispersion de 1 μm. Un potentiel ζ très positif, associé à de longues chaînes d’hydrocarbures saturées de la coquille DDAB, sont des facteurs clés pour stabiliser la gouttelette et la cargaison de drogue qu’elle contient. La haute affinité de la coquille DDAB avec la membrane plasmique cellulaire permet l’administration localisée de chimiothérapies en augmentant la concentration du médicament à l’interface des cellules tumorales et en stimulant l’absorption. Cela ferait des DDAB-MD un outil d’administration de médicaments pertinent présentant une activité antitumorale élevée à de très faibles doses de médicament.

Dans ce travail, l’efficacité d’une telle approche a été démontrée pour améliorer considérablement l’effet de la doxorubicine contre les sphéroïdes 3D de cellules tumorales de mammifères, MDA-MB-231. L’utilisation de cultures cellulaires tridimensionnelles (3D) développées sous la forme de sphéroïdes tumoraux multicellulaires (c’est-à-dire des cellules densément emballées de forme sphérique) présente de nombreux avantages par rapport aux cultures cellulaires 2D : en plus d’avoir le potentiel de combler le fossé entre les études in vitro conventionnelles et les tests sur les animaux, elle améliorera la capacité à réaliser des études in vitro plus prédictives des tests de criblage pour le développement préclinique de médicaments ou évaluer le potentiel de médicaments hors AMM et de nouvelles stratégies de co-ciblage.

Introduction

Les vecteurs d’administration de médicaments capables d’assurer une efficacité antitumorale élevée et de réduire les effets secondaires sont des objectifs principaux tout en restant un défi chimico-pharmaceutique sévère ^1,2. À ce jour, leur progression est limitée dans un premier temps par le contraste entre une libération insuffisante de médicament in situ et un niveau critique de toxicité non spécifique ^3,4,5. Ces dernières années, plusieurs systèmes d’administration de médicaments ont été mis en œuvre pour améliorer l’administration d’agents anticancéreux, notamment les liposomes, les micelles polymères, les polymères 6,7,8,9,10. Ces systèmes ont le potentiel d’augmenter le temps de circulation et la sélectivité des médicaments, tout en réduisant la distribution et l’accumulation dans les organes et les tissus sains. Quoi qu’il en soit, les formulations encapsulées de médicaments de chimiothérapie antinéoplasiques, tels que les anthracyclines, ont conduit à une efficacité d’internalisation des médicaments considérablement réduite. Récemment, les porteurs microniques et submicroniques sensibles aux stimuli, tels que les microbulles¹¹, les microgouttelettes, les nanoparticules d’or hybrides¹², les nano-hydrogels¹³, les échafaudages PLGA et les plateformes mésoporeuses¹⁴, ont suscité un intérêt pharmacologique pour leur grande polyvalence dans le ciblage et l’exercice d’effets inhibiteurs de tumeurs à l’aide de la doxorubicine (Dox) et du docétaxel. Des expériences pionnières visant à transformer ces porteurs en soldats anticancéreux efficaces pour des tâches multimodales (c’est-à-dire des approches chimiothérapeutiques, photothermiques et synergiques génétiques) et l’imagerie moléculaire¹⁵ ont ouvert la voie à la nanomédecine théranostique personnalisée.

Dans ce scénario, les microgouttelettes de perfluorocarbone (DM) à changement de phase ont été évaluées en fonction de l’opportunité clé qu’elles offrent pour conjuguer une charge élevée de médicaments, la polyvalence chimique de la coquille des DM abordant les barrières biologiques, la stabilité colloïdale et l’efficacité de synthèse^11,12. Comme atout supplémentaire, l’échogénicité des DM favorisée par la vaporisation acoustique ou optique du noyau perfluorocarboné (PFC) permet de gagner en imagerie in situ et en efficacité thérapeutique prometteuse. De plus, la vaporisation du noyau des MD obtenue par la libération d’énergie de faisceaux de particules ionisantes peut être exploitée pour le suivi de faisceau et la dosimétrie des rayonnements.

La présente étude vise à développer des microgouttelettes de décafluoropentane (DFP) stabilisées par une couche multiple utilisable de surfactant cationique au bromure de diméthyldioctadécylammonium (DDAB). Les DDAB-shelled-MD répondent à la fois aux attentes physico-chimiques et biologiques. Il a été démontré que les microgouttelettes à base de DFP sont de précieux agents de contraste à changement de phase pour obtenir des DM perfluorocarbonées biocompatibles et stables¹⁶. Le gel cristallin DDAB sature les longues chaînes à température physiologique, pénétrant profondément dans le noyau hydrophobe, stabilisant la gouttelette et la cargaison de drogue qu’elle contient. De plus, le potentiel de ζ positif élevé à l’interface de l’eau améliore la stabilité colloïdale des DM. L’attrait biologique de la surface de la coquille DDAB réside dans sa capacité à provoquer la mort de bactéries et de champignons, à des concentrations qui affectent à peine les cellules de mammifères, et à lier les membranes plasmiques, les protéines antigéniques chargées négativement, les nucléotides, l’ADN ou les nanoparticules. Les caractéristiques mentionnées ci-dessus peuvent être exploitées pour générer une action immunoadjuvante, génique et antitumorale remarquable dans les cellules de mammifères¹⁷.

Les DDAB-MD chargés en dox (Dox@DDAB-MD) décrits ici favorisent la libération de médicaments contre les cellules cancéreuses du sein triple négatif très agressives, invasives et peu différenciées. Un protocole simple et rapide est décrit ci-dessous, basé sur l’insonation de sonde de haute puissance pour obtenir des DDAB-MD stables et à haute densité avec une distribution de taille étroite avec une efficacité de charge élevée de Dox dans une formulation en une seule étape. De telles caractéristiques sont compétitives même pour d’autres méthodes de préparation telles que les dispositifs microfluidiques et les homogénéisateurs à haut cisaillement¹⁶.

L’autre problème majeur qui limite la conception de vecteurs d’administration de médicaments efficaces est que l’activité d’un médicament est fonction de divers paramètres (par exemple, l’absorption, la distribution, les concentrations) pouvant être obtenus dans une cible biologique réelle, qui ne peuvent pas être pris en compte par les modèles cellulaires monocouches¹⁸. Pour cette raison, l’histoire du développement de nouvelles formulations antitumorales est parsemée d’études in vitro qui se sont malheureusement révélées inefficaces déjà au niveau des modèles précliniques chez l’animal¹⁹.

En particulier, la nécessité de passer des cultures cellulaires à un système plus complexe et plus fiable que les études in vivo et ex vivo est liée aux limites inhérentes aux études pharmacologiques sur cultures 2D. Dans ce contexte, les systèmes 3D in vitro sont inclus, tels que les sphéroïdes, les organoïdes, les organes sur puce, qui simulent la morphologie, l’activité et la réponse physiologique de structures plus complexes que les monocouches^{2D 20}. D’un point de vue préclinique, les modèles cellulaires 3D imitant le microenvironnement cellulaire offrent la possibilité de mieux comprendre la biologie complexe dans un cadre physiologiquement plus pertinent dans lequel les cultures monocouches traditionnelles ne sont pas efficaces^21,22.

Après avoir prouvé que les DDAB-MD peuvent interagir avec la membrane cellulaire des cellules cancéreuses du sein humain, favorisant l’internalisation des médicaments et la mort cellulaire à très faible concentration de Dox (nanomolaires), l’efficacité d’une telle méthodologie contre les sphéroïdes 3D DE CELLULES TUMORALES DE MAMMIFÈRES, MDA-MB-231, a été testée.

Protocole

REMARQUE : Tous les réactifs et instruments sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Fabrication et caractérisation des microgouttelettes

1. Préparation de DDAB-MD chargés en Dox
   1. Dissoudre la poudre de DDAB dans de l’éthanol pour obtenir une concentration finale de 10 mM et un volume final de 1 mL. Préparez 1 ml de solution mère de Dox en dissolvant 2 mg de poudre de Dox dans de l’éthanol.
      ATTENTION : Le dox est connu pour avoir une toxicité orale aiguë, catégorie 4 et une cancérogénicité, catégorie 1B. Utiliser uniquement sous une hotte avec des gants et un masque de santé.
   2. Ajouter 250 μL de DFP à 300 μL de solution de DDAB (phase huileuse) dans un tube à centrifuger gradué en plastique de 15 mL.
      REMARQUE : La pureté du DFP est de 60 % (GC), la densité 1,6 g / mL (20 °C), le point d’ébullition est de 55 °C. La pureté du Dox est de 98, 0-102, 0 % (HPLC). La pureté de la DDAB est de ≥98 % (TLC). La pureté de l’éthanol est de 97 %.
   3. Ajoutez doucement 2,15 ml d’eau déminéralisée sur la phase huileuse, ce qui permet d’obtenir un mélange eau/huile biphasé. Injectez doucement 10 μL de solution de Dox directement dans la phase huileuse immédiatement avant l’insonation pour éviter la répartition d’une quantité importante de Dox dans la phase aqueuse.
   4. Émulsionner le mélange biphasique par sonance de sonde (avec une micropointe conique en titane de 1/8 po) à l’aide d’un processeur de liquide à ultrasons de haute intensité en mode impulsion (0,7 s allumé et 0,3 s éteint) à 20 kHz, 100 W pendant 10 s. Diluer immédiatement les DM fraîchement préparés avec de l’eau déminéralisée ultrafiltrée (p. ex., MilliQ) par un facteur de 1,8.
      REMARQUE : Le facteur de dilution est indicatif, choisi empiriquement. La solution de DM peut être diluée davantage à condition d’obtenir suffisamment de granulés à partir des centrifugations ultérieures.
   5. Prendre 1 mL de la suspension obtenue et centrifuger 3 fois, en remettant en suspension dans de l’eau ultrafiltrée et désionisée (par exemple, MilliQ) pour éliminer l’excès de Dox et d’éthanol. Effectuez la première centrifugation à 25 °C, 360 x g pendant 3 min, et la deuxième et la troisième à 280 x g à la même température et au même moment.
   6. Après le dernier lavage, retirer l’eau surnageante et prélever 5 μL des pastilles et les disperser dans 2 mL du milieu pour le traitement cellulaire, en obtenant une concentration équivalente de Dox de 10 nM.Les étapes du protocole pour la synthèse des Dox@DDAB-MDs sont illustrées à la figure 1.
      REMARQUE : La concentration équivalente de Dox est définie comme la quantité de Dox libre contenue dans le même volume d’une suspension de Dox@DDAB-MD.
2. Caractérisation des DDAB-MD chargés en Dox
   1. Mesurez la distribution granulométrique à l’aide d’un photomètre DLS (Dynamic Light Scattering) et analysez les corrélogrammes obtenus avec l’algorithme CONTIN pour extrapoler les temps de décroissance associés. Ensuite, utilisez les temps de décomposition pour déterminer la distribution des coefficients de diffusion des particules (D) et convertissez-les en une distribution de diamètres hydrodynamiques (2R_H) en utilisant la relation de Stokes-Einstein R_H = k_BT/6πηD, où k_BT est l’énergie thermique du système et η la viscosité du solvant.
   2. Vérifiez également la taille et la distribution granulométrique à l’aide de la microscopie à fond clair avec un logiciel d’analyse d’images (par exemple, Image J), en mesurant la taille d’au moins 100 gouttelettes par image (pour 3 ou 4 images), en obtenant une valeur moyenne et un écart-type.
      REMARQUE : Pour les mesures DLS, diluer la solution de DMs dans de l’eau désionisée ultrafiltrée (par exemple, MilliQ), du PBS et dans un milieu de culture cellulaire pour éviter la rétrodiffusion à une concentration fixe de 1,5 x 10⁸ DM / mL. Pour l’eau ultrafiltrée, désionisée et le PBS dans un milieu de culture cellulaire, nous avons obtenu des valeurs de taille moyennes de 1,1 ± 0,1 μm, 1,1 ± 0,25 μm et 1,2 ± 0,2 μm, respectivement. Les DM récupérés des granulés, après centrifugation, ne montrent aucun changement de taille dans les erreurs.
   3. Utilisez une lame de chambre de comptage cellulaire pour la microscopie afin d’évaluer la concentration des DM. La chambre est composée de deux zones de comptage différentes d’une épaisseur de 0,10 mm. Placez 10 μL de suspension de MDs sur la chambre. Comptez les DM à l’intérieur du carré 0,25 x 0,25 nm² de la chambre à l’aide d’un microscope optique avec un objectif longue distance 40x et analysez avec un logiciel gratuit d’analyse d’image.
   4. Calculer la concentration de DM, exprimée en nombre de DM/mL, selon l’équation :
      
   5. Vérifiez les images internes de Dox par microscope confocal à balayage laser (CLSM) exploitant l’autofluorescence de Dox à 590 nm. Mesurer la teneur en Dox à l’aide d’un test fluorimétrique, en dispersant les particules dans de l’eau ultrafiltrée, désionisée ou PBS, en les centrifugant à 25 °C, 360 x g pendant 3 min, puis en déterminant la quantité de médicament libre en évaluant la fluorescence du surnageant à 590 nm avec une courbe d’étalonnage (plage de linéarité pour la concentration de Dox : 2-20 μmol/mL, R² = 0,99).
      REMARQUE : Soustrayez la valeur obtenue de la concentration totale de Dox pour obtenir la quantité encapsulée de Dox. Réalisez l’expérience en trois exemplaires. L’efficacité d’encapsulation de Dox donne un taux de 28 % ± 2 %, calculé en divisant la quantité de médicament de Dox dans les DM par le contenu total de Dox déployé.
   6. Effectuer des expériences de libération de Dox au fil du temps, en centrifugant et en répétant la procédure selon l’étape 1.2.3 pour obtenir le pourcentage de Dox libéré dans le surnageant jusqu’au nombre de substances encapsulées. Après la première détermination, répétez la procédure en diminuant la vitesse de centrifugation à 280 x g pour éviter la rupture des DM. Tracez une courbe de relâchement au fil du temps. Vérifier que la concentration de Dox libérée dans les 24 h dans le surnageant atteint un maximum de 20 %.
   7. Mesurez le potentiel ζ à 37 °C à l’aide d’un appareil dédié (par exemple, NanoZetaSizer) et vérifiez que les valeurs obtenues sont d’environ 90-100 mV.

2. Fabrication de sphéroïdes dans des substrats non adhésifs micro-moulés

1. Coulée de micro-moules
   1. Placez de petits moules 3D et 1 g de poudre d’agarose pure dans des récipients adaptés à la stérilisation. Autoclavez-les pendant 30 min sur un cycle de séchage (121 °C).
   2. Dans une enceinte de sécurité biologique, ajoutez 50 ml de solution saline à 0,9 % (NaCl) dans la bouteille en verre contenant de l’agarose stérilisée et placez-la dans un four à micro-ondes pour faire bouillir et dissoudre la poudre. Laissez l’agarose fondue refroidir à 60 °C et ajoutez 500 μL à chaque micro-moule en évitant la création de bulles lors du pipetage.
      AVERTISSEMENT : L’agarose fondue peut provoquer de graves brûlures de la peau. Un équipement de protection individuelle approprié est nécessaire.
   3. Retirez l’agarose gélifiée en fléchissant soigneusement le moule et en retirant le substrat nouvellement formé. Mettez les substrats dans une assiette à 12 puits et ajoutez 2 ml de milieu de culture frais par puits. Incuber pendant au moins 15 min pour équilibrer chaque substrat.
      REMARQUE : Préparez le milieu de culture à l’avance et passez-le dans un filtre de 0,22 μm pour éliminer les particules ou contaminants possibles.
2. Ensemencement des cellules
   1. Cultivez des cellules MDA-MB 231 avec un milieu complet (DMEM complété par 1 % de Pen/Strep, 10 % de FBS et 1 % de L-Glu) dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5 % de CO₂. Lorsque les cellules atteignent environ 80 % de confluence dans une fiole T75, jeter le milieu, rincer avec 4 mL de DPBS et ajouter 3 mL de trypsine/EDTA. Placez le ballon dans l’incubateur et attendez que les cellules se détachent. Inspectez le détachement au microscope inversé (à 20x) toutes les 5 min.
   2. Prélever les cellules détachées avec 3 mL de DPBS avec 10 % de FBS dans un tube de 15 mL et centrifuger à 235 x g pendant 10 min. Jeter le surnageant contenant à la fois le DPBS et la trypsine/EDTA et remettre en suspension les cellules dans 3 mL de milieu frais. Pipetez 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de trypanblue et comptez les cellules à l’aide d’une chambre Neubauer.
      REMARQUE : Lors de la récolte des cellules, neutralisez la trypsine/EDTA avec du DPBS contenant 10 % de FBS pour éviter que la trypsine n’endommage les cellules pendant l’étape de centrifugation.
   3. Pour obtenir un diamètre sphéroïde nominal de 50 μm (~15 cellules/sphéroïde), diluez la suspension cellulaire à une concentration finale de 3 840 cellules/190 μL, ce qui donne 256 sphéroïdes dans le petit moule. Alternativement, pour un sphéroïde de 200 μm de diamètre (~1 000 cellules/sphéroïde), diluer à une concentration finale de 81 000 cellules/190 μL, ce qui donne 81 sphéroïdes dans le grand moule, selon les instructions du fabricant.
   4. Retirez le milieu de culture de la plaque à 12 puits et inclinez les substrats pour retirer soigneusement le milieu de la chambre d’ensemencement cellulaire. Ajouter 190 μL de suspension cellulaire à chaque substrat (en goutte à goutte) et attendre que les cellules se déposent pendant 10 min dans l’incubateur de culture tissulaire.
   5. Ajouter 2 ml du milieu environnant par puits et remettre le multipuits dans l’incubateur. Inspectez la formation de sphéroïdes toutes les 24 heures. Remplacez-le par un milieu frais au besoin.
3. Récolte et transformation des sphéroïdes
   1. Placez une boîte de Pétri de 35 mm contenant 2 ml de milieu frais dans l’incubateur pour équilibrer pendant 10 à 15 minutes.
   2. Retirez le milieu de culture cellulaire entourant le substrat. À l’aide d’une pince à épiler stérile, retirez le substrat du puits et retournez-le dans la boîte de Pétri. Tapotez doucement le fond du substrat pour faire tomber les sphéroïdes par gravité.
   3. Remettez la boîte de Pétri contenant les sphéroïdes dans l’incubateur pour un traitement ultérieur. Les étapes du protocole pour la fabrication des sphéroïdes sont illustrées à la figure 2.

3. Traitement sphéroïde

1. Retirer le surnageant du moule et le remplacer par 200 μL de dispersion de Dox@DDAB-DMs, préparée comme décrit à l’étape 1.1.6.
2. Après 5 min, ajouter 2 ml/puits du milieu environnant pour équilibrer. Après le temps de traitement souhaité, procédez comme indiqué à l’étape 2.1.

4. Caractérisation de la taille et de la morphologie des sphéroïdes

1. Vérifiez la taille du sphéroïde après le temps d’incubation souhaité à l’aide d’un objectif 40x combiné au logiciel de traitement d’images du microscope.
2. Mesurez la taille d’au moins 10 sphéroïdes pour recueillir suffisamment de données pour établir des statistiques appropriées et analysez leurs volumes comme indiqué à l’étape 7.

5. Essai de prolifération/viabilité : microscopie à fluorescence avec coloration de cellules vivantes

REMARQUE : Suivez les instructions de fabrication de sphéroïdes jusqu’à l’étape 2.2.5.

1. Retirer le surnageant du moule et le remplacer par 200 μL de 4 μM de calcéine-AM dans du PBS et incuber pendant 3 h à température ambiante dans l’obscurité. Pendant les 20 dernières minutes d’incubation, ajoutez 10 μg/mL d’iodure de propidium pour colorer les cellules mortes.
2. Récoltez les sphéroïdes en inversant le substrat dans la boîte de Pétri conformément à l’étape 2.3.2.
3. Imagez les sphéroïdes en solution de coloration à l’aide de CLSM avec des objectifs 40x/60x et un laser Ar+, en réglant le gain et le sténopé de manière appropriée pour obtenir des images nettes.

6. Analyse et acquisition d’images

1. Images 2D en transmission et confocales
   1. Ouvrez le logiciel confocal (Fichier supplémentaire A) et sélectionnez l’objectif (60x, 40x, etc.). Dans le panneau de droite, cliquez sur Trans pour sélectionner le canal de transmission.
   2. Cliquez sur Live pour visualiser l’image et rechercher la mise au point optimisée. Cliquez sur Single pour arrêter l’acquisition.
   3. Pour les images confocales, cliquez sur les canaux laser rouge ou vert en fonction du colorant fluorescent utilisé. Sur la section sténopé, sélectionnez S-aperture dans le menu déroulant et réglez la section de gain sur 6,00 B.
   4. Cliquez sur Live et réglez l’ouverture et le gain du sténopé pour optimiser le contraste. Cliquez sur Single pour arrêter l’acquisition et enregistrer l’image. Superposez l’image de transmission et l’image confocale en sélectionnant le canal approprié dans la barre d’outils supérieure.
2. Images 3D confocales
   1. Cliquez sur Z dans le panneau de droite (Fichier supplémentaire B). Cliquez sur le bouton rouge pour réinitialiser les paramètres.
   2. Sélectionnez la section Réf , cliquez sur En direct et recherchez le plan médian à l’intérieur de l’objet en déplaçant le focus. Sélectionnez la section supérieure et déplacez le focus vers le haut jusqu’à ce que l’objet soit flou et disparaisse.
   3. Répétez l’étape 6.2.2 pour la partie inférieure en descendant dans la mise au point.
   4. Réglez la taille du pas sur 0,75 μm. Cliquez sur Z-stack puis sur Single pour lancer le scan. Enregistrez les images au format .ics.
3. Images optiques et analyse
   1. Ouvrez le logiciel du microscope optique, capturez l’image avec une mise au point longue 40x ou un objectif 20x en appuyant sur Play dans la barre d’outils supérieure. Appuyez sur Stop et enregistrez l’image.
   2. Dans la barre d’outils supérieure, cliquez sur Affichage, Contrôle d’analyse, Annotations et mesures , ce qui ouvre un panneau avec différentes options (Fichier supplémentaire C). Dans le panneau Annotations et mesures , sélectionnez Demi-axe et cliquez sur Ellipse.
   3. Dans la recherche d’images, recherchez l’axe qui correspond le mieux à la forme de l’objet et appuyez sur la touche Entrée du clavier pour transférer la valeur obtenue sur la table du panneau de droite.
   4. Répétez l’étape 6.3.3 pour au moins 10 objets afin d’obtenir suffisamment de données. Cliquez sur Exporter vers la feuille de données Excel pour exporter les données et les enregistrer.
4. Visualisation d’images 3D Z-Stack et calcul numérique du volume
   1. Ouvrez l’image 3D capturée avec la microscopie confocale dans le logiciel du microscope optique (fichier supplémentaire D).
   2. Pour voir la reconstruction 3D, cliquez sur Afficher la vue en volume dans la barre d’outils de l’image ; L’objet peut être pivoté dans n’importe quelle direction en cliquant sur le bouton gauche de la souris. Pour sélectionner une partie du volume, maintenez les touches ctrl + gauche de la souris (Fichier supplémentaire E).
   3. Appuyez sur la touche x du clavier pour prendre un instantané de l’image 3D et l’enregistrer.
   4. Pour calculer le volume de l’objet, cliquez sur Mesurer, mesures d’objet 3D pour ouvrir un panneau (Fichier supplémentaire, Image F). Cliquez sur la barre d’outils du panneau Définir le seuil 3D et définissez le seuil optimisé à l’aide des filtres lisses et propres (Fichier supplémentaire, Image G). Cliquez sur OK pour obtenir dans le panneau de mesures de l’objet 3D différents paramètres, y compris le volume.
   5. Cliquez sur Exporter vers Excel pour exporter les données et les enregistrer.

7. Analyse des données sphéroïdes

1. Pour le calcul du volume des sphéroïdes, approximez la structure 3D avec un ellipsoïde prolate, en estimant le grand et le petit axe par la projection 2D, comme le montre l’encart de la figure 3.
2. Validez l’approximation de l’ellipsoïde prolate en comparant le volume calculé numériquement comme indiqué à l’étape 6.4 et la formule du volume de l’ellipsoïde prolate avec b>a=c où a, b et c sont l’axe de l’ellipsoïde).
3. Calculez le volume moyen d’au moins 10 sphéroïdes et les écarts-types respectifs. Si la distribution volumique du sphéroïde est normale, appliquez le test de Dixon pour identifier et rejeter la valeur aberrante. Ensuite, calculer le rapport volumique entre l’échantillon traité et l’échantillon ainsi que la propagation de l’erreur, comme indiqué à la figure 6A.

Résultats

Les Dox@DDAB-DM ont été élaborées conformément au protocole (section 1) décrit schématiquement à la figure 1. Les DM obtenus sont constitués d’une monocouche de DDAB encapsulant le noyau DFP (Figure 1A). La charge cationique du DDAB et le processus de sonication évitent la formation de couches multilamellaires DDAB empilées à l’interface DFP et eau²³.

La micrographie CLSM (...

Discussion

Pour améliorer l’efficacité des anthracyclines en tant que médicaments antitumoraux, ce travail présente la formation de gouttelettes de PFC décortiquées de DDAB encapsulant le médicament chimiothérapeutique doxorubicine (Dox) et l’effet d’une telle formulation interagissant avec les cellules cancéreuses du sein triple négatif hautement agressives, MDA-MB-231.

Renforcement des DOX@DDAB-DM
Les MD chargés de Dox ont été formulés par la méthod...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
µ ;-Boîte de Pétri	Ibidi	81156	35mm de haut, IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-Décafluoropentane	Sigma-Aldrich	138495-42-8	b.p. 55° ; C
Plaque de culture 12 puits	Corning Tube à
centrifuger 15 ml	Falcon	89039-664
Boîtes de Petri 3D 12:256	Microtissus (Sigma-Aldrich)	Z764000-6EA	Petites
boîtes de Petri 3D 12:81	Microtissus (Sigma-Aldrich)	Z764019-6EA	Grand
incubateur de culture à 5 % de CO2, 37° ; C	Thermo Scienific		HERAcell 150i
50 ml tube à centrifuger	Falcon	352070
Armoire de sécurité biologique, niveau
Calcein	Sigma-Aldrich
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	148504-34-1	solution mère 4mM dans came DMSO
sCMOS Andor Zyla 4.2	Andor Instruments
Centrifugeuse Hettich Universal 320R	Hettich Lab. Technology
DAPI	SIgma-Aldrich
Poudre de bromure de diméthyldioctadécylammonium	Sigma-Aldrich	3700-67-2
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Corning	15-013-CV
Chlorhydrate de doxorubicine	Sigma-Aldrich	25316-40-9
DPBS (PBS modifié de Dulbecco)	Corning	21-030-CV	pH 7,4
Éthanol 70 %	Sigma-Aldrich
EZ-C1 numérique ecliplse	Nikon Instruments		Version argentée 3.91
Sérum de bovin fœtal (FBS)	Corning	35-079-CV
Goniomètre BI-200SM	Brookhaven Instruments Corporations
Laser Ar+  ;	Spectra Physics
Laser He-Ne	Melles-Griot
L-Glutammine	Corning	25-005-CI
Mcroscope Nikon Eclipse Ti	Nikon Instruments
MDA-MB 231 lignée cellulaire	ATCC
Microsoft Excel	Microsoft
Lecteur de microplaques Spark	Tecan groupe
NanoZetaSizer ZS	Malvern Instruments LTD
Neubauer chambre		718605
logiciel NIS Elements Nikon	Instruments		AR 4.30
Pen/Strepto	Corning	30-002-CI
Photocorrélateur BI-9000 AT	Brookhaven Instruments Corporations	62927-1
Photomètre HC120	Brookhaven Instruments Corporations	N° ; 1275
Pipettes et pointes, différentes tailles	Gilson
Propidium	Iure SIgma-Aldrich
Pipettes sérologiques, différentes tailles	Corning
Laser à semi-conducteurs	Suwtech Laser	N° ; 22368
T25 Fioles	Sarstedt	83.3910.002
T75 Flacons	Sarstedt	83.3911.002
Trypsine/EDTA 0.05 %	EuroClone	ECB3052D
Vibra-Cell VCX-400	Sonics & Matériaux, y compris
		d’eau	37° ; L