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L’établissement et l’utilisation de modèles de xénogreffes dérivés de patients de métastases du système nerveux central

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DOI :

10.3791/62264

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7 mai 2021

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1Department of Translational Genomics, Keck School of Medicine, University of Southern California

Dans cet article

Résumé

Les modèles PDX de métastases du système nerveux central représentent les caractéristiques phénotypiques et moléculaires des métastases humaines, ce qui en fait d’excellents modèles pour les études précliniques. Décrit ici comment établir des modèles PDX et les voies d’inoculation qui sont les mieux utilisées pour les études précliniques.

Résumé

Le développement de nouvelles thérapies pour les métastases du système nerveux central (SNC) a été entravé par le manque de modèles précliniques qui représentent fidèlement la maladie. Il a été démontré que les modèles de xénogreffe dérivée du patient (PDX) de métastases du SNC représentent mieux les caractéristiques phénotypiques et moléculaires de la maladie humaine, ainsi que l’hétérogénéité et la dynamique clonale des tumeurs des patients humains par rapport aux modèles de lignées cellulaires historiques. Il existe plusieurs sites qui peuvent être utilisés pour implanter des tissus dérivés du patient lors de la mise en place d’essais précliniques, chacun avec ses propres avantages et inconvénients, et chacun adapté à l’étude de différents aspects de la cascade métastatique. Ici, le protocole décrit comment établir des modèles PDX et présente trois approches différentes pour l’utilisation des modèles PDX de métastases du SNC dans les études précliniques, en discutant de chacune de leurs applications et limites. Ceux-ci comprennent l’implantation de flanc, l’injection orthotopique dans le cerveau et l’injection intracardiaque. L’implantation sous-cutanée du flanc est la plus facile à surveiller et, par conséquent, la plus pratique pour les études précliniques. En outre, des métastases au cerveau et à d’autres tissus provenant de l’implantation de flancs ont été observées, indiquant que la tumeur a subi plusieurs étapes de métastases, y compris l’intravasation, l’extravasation et la colonisation. L’injection orthotopique dans le cerveau est la meilleure option pour récapituler le microenvironnement tumoral cérébral et est utile pour déterminer l’efficacité des produits biologiques à traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE), mais contourne la plupart des étapes de la cascade métastatique. L’injection intracardiaque facilite les métastases au cerveau et est également utile pour étudier le tropisme des organes. Bien que cette méthode renonce aux étapes antérieures de la cascade métastatique, ces cellules devront toujours survivre à la circulation, extravaser et coloniser. L’utilité d’un modèle PDX est donc influencée par la voie d’inoculation de la tumeur et le choix de celui à utiliser doit être dicté par la question scientifique et les objectifs généraux de l’expérience.

Introduction

L’incidence des métastases au système nerveux central (SNC) a augmenté au cours des dernières années 1,2,3. Les thérapies traditionnelles pour les métastases du SNC, telles que la résection tumorale, la radiothérapie du cerveau entier et la radiochirurgie stéréotaxique, ont été en grande partie palliatives et rarement curatives, et peuvent entraîner des effets secondaires débilitants, tels que la détérioration cognitive1. Récemment, de nombreuses nouvelles thérapies ciblées et immunologiques sont en cours de développement pour le traitement des métastases du SNC qui semblent prometteuses pour être des traitements plus efficaces, tout en ayant moins d’effets secondaires4.

La traduction des résultats précliniques en critères d’évaluation cliniques significatifs nécessite souvent des stratégies de modélisation efficaces et prédictives. Historiquement, les modèles de xénogreffe de lignées cellulaires étaient la norme pour la recherche préclinique dans la recherche sur les métastases du SNC. Cependant, ces modèles de lignées cellulaires ne reflètent pas le véritable comportement tumoral de la tumeur hôte ou ne représentent pas l’hétérogénéité histologique ou moléculaire de la maladie. De plus, les modèles de lignées cellulaires sont capables de s’adapter aux conditions de croissance in vitro et, par conséquent, de perdre les propriétés originales de la tumeur hôte. Les xénogreffes dérivées de patients (PDX), qui greffent la tumeur d’un patient dans une souris immunodéficiente ou humanisée, sont de plus en plus utilisées dans la recherche translationnelle sur le cancer. Les chercheurs ont montré que les modèles PDX peuvent généralement récapituler fidèlement la croissance tumorale, les caractéristiques histologiques, maintenir l’hétérogénéité tumorale, le potentiel métastatique et les caractéristiques génétiques moléculaires. En outre, les modèles PDX sont des pronostics dans lesquels la période de latence tumorale PDX est en corrélation avec la survie globale du patient et il a également été démontré qu’ils prédisaient avec précision la réponse thérapeutique dans les essais sur les patients 5,6.

Il y a eu une émergence de métastases du SNC PDX. La plupart du temps, ceux-ci ont été développés représentant des tumeurs provenant d’une origine unique, telles que le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC)7, le cancer du sein8,9 et le mélanome 10,11. Plus récemment, une collection importante et diversifiée de modèles PDX a été développée et caractérisée, représentant huit sous-types histologiques différents12. Il a été démontré que les modèles PDX pour les métastases du SNC ressemblent étroitement à leur tumeur d’origine chez le patient, à la fois histologiquement et moléculairement et ont également démontré des différences et des similitudes histologiquesuniques 10,12. En outre, alors que la plupart des modèles PDX de métastases du SNC maintiennent l’hétérogénéité clonale des tumeurs humaines, certains présentaient des signes de succession clonale12, ce qui les rend également idéaux pour étudier la résistance aux thérapies en surveillant les changements clonaux après le traitement.

Les protocoles décrits ici décrivent les méthodes d’établissement de PDX et les différentes voies d’inoculation utilisées dans les études précliniques des métastases du SNC (Figure 1). Ces méthodes d’implantation varient dans leur capacité à imiter la croissance et les métastases. Ici, le protocole met en évidence les applications pour chaque voie d’implantation et démontre comment elles pourraient être utilisées pour l’étude des métastases du SNC.

Protocole

Voici une série de protocoles étape par étape utilisés à la fois pour établir des modèles PDX par implantation sous-cutanée du flanc et pour mettre en place des études précliniques qui permettent de tester les traitements, ce qui peut aider à évaluer les changements biologiques et les différentes étapes de la cascade métastatique. Toutes les études et tous les modèles ont utilisé des souris NOG femelles âgées de 3 à 8 semaines. Tous les échantillons de tissus ont été prélevés avec un consentement éclairé conformément à un protocole approuvé par le Comité d’examen des établissements (CISR). Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC).

1. Etablissement et propagation de modèles PDX par implantation de flanc

  1. Mise en place de modèles PDX
    1. Après la résection chirurgicale de la tumeur du patient dans la salle d’opération, stockez les tissus tumoraux frais dans une solution appropriée (telle que DMEM) et placez-la immédiatement sur de la glace. Utilisez un excès de solution d’entreposage (>10 ml) pour vous assurer que le tissu est complètement immergé.
    2. Transférer le tissu dans une boîte de culture tissulaire et rincer avec 5 ml de DPBS.
      REMARQUE : Cette étape doit être effectuée dans une enceinte de biosécurité à l’aide de techniques aseptiques. Des précautions doivent être prises en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié pour se protéger contre d’éventuels agents infectieux humains.
    3. Enlever les régions nécrotiques de la tumeur.
      REMARQUE: Cela peut être reconnu comme une région pâteuse blanche vers le centre du tissu.
    4. Couper le reste du tissu en morceaux d’environ 2 x 2 x 2 mm.
    5. Transférer les tissus dans un tube microcentrifuge contenant la matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit et les stocker sur de la glace. S’assurer qu’une matrice membranaire basale suffisante (>200 μL) est utilisée pour submerger complètement chaque morceau de tissu.
    6. Cryoconserver les tissus restants qui ne seront pas implantés selon le protocole décrit à l’étape 1.3.
    7. Anesthésiez l’animal dans une chambre d’induction avec 2 à 5% d’isoflurane et d’oxygène. Une fois anesthésié, transférer l’animal dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie à 1,5-2,5% d’isoflurane avec un apport continu d’oxygène. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale. Appliquez la pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Fournir un soutien thermique à l’animal tout au long de la procédure jusqu’à ce que l’animal se rétablisse.
    8. Identifiez le site d’implantation sur la souris.
      REMARQUE: Cela devrait être sur le flanc droit ou gauche de la souris, généralement marqué latéralement sur le côté de la région abdominale, caudale à la cage thoracique.
    9. Pour préparer la zone chirurgicale, rasez la fourrure et désinfectez avec trois gommages alternés de povidone iodée et d’éthanol à 70%.
    10. À l’aide de forceps, soulevez la peau de la souris et faites une incision de 0,5 à 1 cm sur la peau.
    11. Insérez lentement une paire de ciseaux chirurgicaux sous la peau au site de l’incision pour créer une poche (0,5 à 1 cm de profondeur) dans l’espace sous-cutané.
    12. Placez soigneusement un morceau de tumeur dans la poche et poussez-le au fond de la poche pour empêcher la tumeur de glisser.
    13. Fermez l’incision à l’aide de sutures chirurgicales en nylon 4-0.
      REMARQUE: D’autres méthodes de fermeture de la plaie telles que les sutures et les clips de plaie non résorbables ou résorbables peuvent également être utilisées.
    14. Remettez la souris dans la cage et surveillez le rétablissement de l’animal après l’anesthésie, jusqu’à ce qu’il soit ambulatoire.
      REMARQUE: Les analgésiques ne sont pas nécessaires, mais peuvent être administrés si une douleur est observée chez les souris.
    15. Surveillez la croissance tumorale chaque semaine. Une tumeur est attendue par souris.
      REMARQUE: Le volume de la tumeur à la transplantation semblera diminuer initialement, mais ce n’est pas une source de préoccupation. Une tumeur est considérée comme ayant pris une fois qu’elle devient palpable et entre dans une phase de croissance logarithmique. Ce premier passage représente la génération F0.
    16. Une fois que les tumeurs commencent à se développer, mesurez les tumeurs trois fois par semaine. Mesurez la longueur et la largeur des tumeurs avec un pied à coulisse. Pour calculer le volume de la tumeur, utilisez la formule: longueur x largeur x largeur / 2.
    17. Euthanasier les souris implantées avec des tumeurs PDX lorsque les tumeurs ont un diamètre supérieur à 15 mm en utilisant le côté le plus long de la tumeur. Effectuer l’euthanasie par inhalation de CO 2 dans une chambre d’induction de CO2, suivie d’une luxation cervicale comme méthode secondaire.
    18. Réséquer la tumeur du flanc de l’animal en faisant une incision. Disséquez doucement la tumeur excisée avec des ciseaux émoussés et des pinces. Pour ce faire, coupez d’abord la peau au-dessus de la tumeur, puis coupez la tumeur loin de la couche musculaire en dessous.
    19. Transférer le tissu tumoral à >10 mL d’une solution de stockage appropriée (telle que le DMEM). Placez-le immédiatement sur la glace. Cette tumeur peut être cryopréservée ou transmise à un autre groupe de souris. Considérez ce passage comme F1.
      REMARQUE: Passer à nouveau rendrait le passage de la tumeur F2 et ainsi de suite.
  2. Propagation des modèles PDX
    1. Commencez par la tumeur réséquée conservée dans une solution de stockage à partir de l’étape 1.1.19.
    2. Transférer le tissu dans une boîte de culture tissulaire et rincer avec 5 ml de DPBS.
    3. Retirez les régions nécrotiques de la tumeur.
    4. Couper le tissu en morceaux d’environ 2 x 2 x 2 mm.
    5. Transférer les tissus dans un tube microcentrifuge contenant une matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit (>200 μL) et conserver sur de la glace.
    6. Cryoconserver le tissu restant qui n’est pas utilisé pour la multiplication selon le protocole décrit à l’étape 1.3.
    7. Anesthésiez l’animal dans une chambre d’induction avec 2 à 5% d’isoflurane et d’oxygène. Une fois anesthésié, transférer l’animal dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie à 1,5-2,5% d’isoflurane avec un apport continu d’oxygène. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale. Appliquez la pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Fournir un soutien thermique à l’animal tout au long de la procédure jusqu’à ce que l’animal se rétablisse.
    8. Identifiez le site d’implantation sur la souris.
      REMARQUE: Cela devrait être sur le flanc droit ou gauche de la souris, généralement dans la région abdominale, caudale à la cage thoracique.
    9. Pour préparer la zone chirurgicale, rasez la fourrure et désinfectez avec trois gommages alternés de povidone iodée et d’éthanol à 70%.
    10. Faites une incision de 0,5 à 1 cm sur un flanc de la souris.
    11. Insérez lentement une paire de ciseaux chirurgicaux sous la peau au niveau de l’incision pour créer une poche (0,5 à 1 cm de profondeur) dans l’espace sous-cutané.
    12. Placez soigneusement un morceau de tumeur dans la poche et poussez-le au fond de la poche pour empêcher la tumeur de glisser.
    13. Fermez l’incision à l’aide de sutures chirurgicales en nylon 4-0 ou d’autres méthodes de fermeture de la plaie.
    14. Transférez la souris dans la cage et surveillez sa récupération de l’anesthésie, jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire.
      REMARQUE: Les analgésiques ne sont pas nécessaires, mais peuvent être administrés si une douleur est observée chez les souris.
    15. Pendant la latence (phase de non-croissance), surveillez la croissance tumorale chaque semaine. Une tumeur est attendue par souris.
      REMARQUE: Le volume de la tumeur à la transplantation semblera diminuer initialement, mais ce n’est pas une source de préoccupation. Une tumeur est considérée comme prise une fois qu’elle devient palpable et commence à croître continuellement.
    16. Une fois que les tumeurs commencent à se développer, mesurez les tumeurs trois fois par semaine. Mesurez la longueur et la largeur des tumeurs avec un pied à coulisse. Calculez le volume de la tumeur en utilisant la formule: longueur x largeur x largeur / 2.
    17. Euthanasier les souris implantées avec des tumeurs PDX lorsque les tumeurs ont un diamètre supérieur à 15 mm en utilisant le côté le plus long de la tumeur. Pratiquer l’euthanasie par inhalation de CO2 dans une chambre d’induction de CO2, suivie d’une luxation cervicale comme méthode secondaire.
    18. Réséquez la tumeur du flanc de l’animal en faisant une incision et en disséquant doucement la tumeur avec des ciseaux et des pinces émoussés.
    19. Transférer le tissu tumoral à >10 mL d’une solution de stockage appropriée (telle que DMEM), puis placer immédiatement sur de la glace.
  3. Cryoconservation des tumeurs PDX
    1. Euthanasier les souris implantées avec des tumeurs PDX lorsque les tumeurs ont un diamètre supérieur à 15 mm en utilisant le côté le plus long de la tumeur. Pratiquer l’euthanasie par inhalation de CO 2 dans une chambre d’induction de CO2, suivie d’une luxation cervicale comme méthode secondaire.
    2. Réséquez la tumeur du flanc de l’animal en faisant une incision et en disséquant doucement la tumeur avec des ciseaux et des pinces émoussés.
    3. Transférer le tissu tumoral à >10 mL d’une solution de stockage appropriée (telle que DMEM), puis placer immédiatement sur de la glace.
    4. Transférer le tissu dans une boîte de culture tissulaire et rincer avec 5 ml de DPBS.
    5. Enlever les régions nécrotiques de la tumeur.
    6. Couper le tissu en morceaux d’environ 2 x 2 x 2 mm.
    7. Transférer le tissu dans des cryotubes contenant 20% de DMEM, 70% de FBS et 10% de DMSO.
    8. Transférer les cryotubes dans un récipient de cryoconservation et les placer dans un congélateur à -80 °C.
    9. Lorsque les cryotubes sont refroidis à -80 °C, transférez-les dans un stockage d’azote liquide.

2. Voies d’inoculation pour les études précliniques

  1. Implantation sous-cutanée du flanc.
    REMARQUE: L’implantation sous-cutanée du flanc peut être utilisée pour faciliter et peut être utile pour étudier toutes les étapes de la cascade métastatique.
    1. Utilisez des tumeurs PDX en croissance ou des tumeurs PDX cryoconservées pour l’implantation initiale du flanc.
    2. Pour les tumeurs PDX en croissance, euthanasier les souris en utilisant une méthode approuvée par l’IACUC lorsque les tumeurs ont une longueur supérieure à 15 mm; réséquer la tumeur et transférer le tissu tumoral vers une solution de stockage appropriée (telle que DMEM) et placer immédiatement sur de la glace.
    3. Pour les tumeurs PDX cryoconservées, décongeler rapidement le tissu PDX cryoconservé en l’immergeant dans un bain-marie à 37 °C.
    4. Suivez les étapes 1.2.2-1.2.19.
  2. Implantation orthotopique par injection intracrânienne dans le cerveau.
    REMARQUE: Ce modèle peut être utilisé pour tester l’efficacité des médicaments à traverser la BHE et pour étudier la colonisation tumorale. Cette section fait principalement référence à l’utilisation du kit de dissociation tumorale (voir Tableau des matériaux). Différents types de tissus nécessitent différents protocoles de dissociation. Il est recommandé que l’utilisateur teste et optimise le protocole pour maximiser l’efficacité de la dissociation.
    1. Euthanasier les souris implantées avec des tumeurs PDX en utilisant une méthode approuvée par l’IACUC lorsque les tumeurs ont une longueur supérieure à 15 mm.
    2. Dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité, réséquer chirurgicalement les tumeurs PDX et les stocker dans du DMEM sur de la glace.
    3. Préparer la solution de dissociation dans le tube approprié en ajoutant le mélange enzymatique dans le DMEM comme indiqué par le protocole du fabricant.
    4. Laver la tumeur dans 5 mL DPBS dans un plat de culture tissulaire.
    5. Retirez les régions nécrotiques de la tumeur.
    6. Coupez la tumeur en petits morceaux de 2 à 4 mm de longueur.
    7. Transférer les morceaux tumoraux dans le tube contenant le mélange d’enzymes.
    8. Fixez le tube au dissociateur tissulaire et exécutez le programme adapté au type de tissu. Consultez le protocole du fabricant pour connaître le programme approprié à exécuter et le temps de dissociation requis.
    9. Une fois le programme terminé, filtrer les cellules à travers une passoire cellulaire de 70 μm.
    10. Lavez la passoire cellulaire avec 20 ml de DMEM.
    11. Centrifuger les cellules dissociées à 300 x g pendant 7 min.
    12. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans DPBS.
    13. Compter les cellules et diluer à la concentration requise.
    14. Installez le cadre stéréotaxique selon les instructions du fabricant et préparez un coussin chauffant pour les souris. Désinfectez toutes les zones avec de l’éthanol à 70%.
    15. Anesthésiez l’animal dans une chambre d’induction avec 2 à 5% d’isoflurane et d’oxygène. Une fois anesthésié, transférer l’animal dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie à 1,5-2,5% d’isoflurane avec un apport continu d’oxygène. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale. Appliquez la pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Fournir un soutien thermique à l’animal tout au long de la procédure jusqu’à ce que l’animal se rétablisse.
    16. Préparez la zone chirurgicale en rasant la fourrure sur la tête de la souris pour exposer le cuir chevelu.
    17. Fournir à la souris l’analgésique approprié, tel qu’une dose de 1 mg / kg de buprénorphine à libération prolongée (SR) administrée par injection sous-cutanée.
    18. Transférez la souris sur le cadre stéréotaxique. Assurez-vous que la souris mord sur le bloc de morsure. Utilisez les barres d’oreille pour fixer fermement la tête de la souris.
      REMARQUE: La souris est correctement fixée si la tête ne bouge pas lorsqu’elle est poussée doucement avec une pince.
    19. Désinfectez la zone rasée avec trois gommages alternés de povidone iodée et d’éthanol à 70%.
    20. Faites une incision longitudinale de 5 à 7 mm sur le cuir chevelu pour exposer le crâne et rétracter le cuir chevelu.
    21. Grattez le périoste avec un instrument chirurgical contondant tel qu’une pince.
    22. Localisez le bregma sur le crâne.
    23. Placez l’aiguille du cadre stéréotaxique sur le dessus du bregma et réinitialisez les coordonnées à 0 ou notez la coordonnée sur le bras.
    24. Déplacez le bras de 1 mm vers l’arrière (caudale) et de 1 mm latéralement, à droite de la ligne médiane.
    25. Marquez cet emplacement avec un marqueur permanent. Si le bras contient une fente pour la seringue, fixez un marqueur à la fente de la seringue pour marquer l’emplacement.
    26. Percez un petit trou de bavure dans le crâne à cet endroit. N’appliquez pas trop de pression pour éviter de percer dans le cerveau.
    27. Charger une seringue Hamilton de 5 μL, 26 G avec 5-10 x 104 cellules, dans un volume de 1-2 μL, et fixer au bras stéréotaxique.
    28. Insérez lentement l’aiguille de la seringue Hamilton de 2 mm dans le cerveau.
    29. Commencez à injecter les cellules à la vitesse désirée, généralement 0,2-0,5 μL / min.
    30. Une fois l’injection terminée, retirez lentement l’aiguille du cerveau.
    31. Remplissez le trou de bavure avec de la cire d’os.
    32. Fermez l’incision avec des sutures chirurgicales ou de la colle chirurgicale.
    33. Remettez la souris dans la cage et surveillez sa récupération après l’anesthésie.
    34. Surveiller régulièrement l’état des animaux et les euthanasier lorsque les critères d’évaluation sans cruauté sont atteints dans le protocole approuvé.
      REMARQUE: Une croissance tumorale réussie dans le cerveau entraîne une détérioration de l’état de l’animal, qui se manifeste souvent par une inclinaison de la tête, un pelage rugueux, un corps voûté, des yeux plissés, une activité réduite et un faible score d’état corporel (BCS < 2).
    35. Effectuer une nécropsie sur les animaux euthanasiés, suivie d’une analyse histologique pour confirmer la présence de tumeurs dans le cerveau. Notez le temps qu’il faut entre l’implantation et l’euthanasie.
  3. Implantation de modèles PDX par injection intracardiaque
    REMARQUE: Ce modèle peut être utilisé pour étudier le tropisme des organes une fois que les cellules tumorales sont en circulation. Cette section utilise également le kit de dissociation tumorale et nécessite une optimisation par type de tissu.
    1. Suivez les étapes 2.2.1-2.2.13.
    2. Anesthésiez l’animal dans une chambre d’induction avec 2 à 5% d’isoflurane et d’oxygène. Une fois anesthésié, transférer l’animal dans un cône nasal pour maintenir l’anesthésie à 1,5-2,5% d’isoflurane avec un apport continu d’oxygène. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pédale. Appliquez la pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Fournir un soutien thermique à l’animal tout au long de la procédure jusqu’à ce que l’animal se rétablisse.
    3. Ensuite, placez la souris en décubitus dorsal.
    4. Pour préparer la zone chirurgicale sur la poitrine, rasez la fourrure et désinfectez-la avec trois gommages alternés de povidone-iode et d’éthanol à 70%.
    5. Aspirer 0,5-10 x 105 cellules dans une seringue sur une aiguille de 28 G, jusqu’à un volume de 100 μL.
      REMARQUE : Le nombre de cellules requises varie en fonction de l’agressivité du modèle et le nombre optimal de cellules doit être déterminé empiriquement pour chaque modèle.
    6. Localisez le site d’injection (légèrement à gauche du sternum de la souris et à mi-chemin entre l’encoche sternale et le processus xyphoïde).
    7. Insérez l’aiguille verticalement dans la souris au site d’injection.
    8. Observez l’entrée réussie dans le ventricule gauche par un reflux de sang entrant dans la seringue. Distribuez lentement les cellules dans le ventricule gauche sans bouger l’aiguille.
    9. Retirez lentement l’aiguille verticalement de la souris.
    10. Appliquez un morceau de gaze stérile sur le site d’injection et appliquez une pression pendant environ 1 min jusqu’à ce que le saignement cesse, tout en permettant le mouvement de la poitrine pour la respiration.
    11. Retirez la souris de l’anesthésie et laissez-la récupérer sur un coussinet chauffant.
      REMARQUE: Une croissance tumorale réussie entraîne une détérioration de l’état de l’animal, qui se manifeste souvent par un pelage ébouriffé, un corps voûté, des yeux plissés, une activité réduite et un faible score d’état corporel (BCS < 2).
    12. Surveiller régulièrement l’état des animaux et les euthanasier lorsque les critères d’évaluation sans cruauté sont atteints dans le protocole approuvé.
    13. Effectuer une nécropsie pour identifier les métastases sur les animaux euthanasiés, suivie d’une analyse histologique pour confirmer la présence de tumeurs dans l’organe cible. Notez le temps qu’il faut entre l’injection intracardiaque et l’euthanasie.

Résultats

Les tumeurs PDX propagées par le flanc sont les plus faciles à implanter, à surveiller et à réséquer, et sont généralement recommandées pour l’établissement initial et la propagation des tumeurs PDX (Figure 1). Lors de l’établissement ou de la propagation de tumeurs PDX, il est prudent d’implanter des tumeurs chez plusieurs animaux, car le taux de prise tumorale peut varier et tous les morceaux de tumeur ne prendront pas toujours chez la souris. Des méthodes ont été développées pour l’établissement et la propagation de métastases du SNC PDX directement dans le cerveau13. Cependant, ces méthodes sont encore plus difficiles avec des taux de prélèvement plus faibles et les tumeurs sont significativement plus difficiles à propager et à surveiller que l’implantation de flanc.

Si les tumeurs des patients ne sont pas facilement disponibles, les tumeurs PDX métastases du SNC peuvent également être obtenues à partir de diverses sources, y compris les dépôts de laboratoires universitaires ou de sociétés commerciales. Après l’acquisition des tumeurs, la première priorité serait de propager et de cryoconserver autant de matériel que possible, en veillant à ce qu’un grand nombre de tumeurs à passage bas soient préservées. Cela garantit que suffisamment de matériel est disponible pour un nombre indéfini d’études ultérieures avec les modèles PDX. Tout comme les lignées cellulaires immortalisées, les tumeurs PDX doivent être cryoconservées et utilisées à faible nombre de passages, car la dérive génétique entraîne des modifications du phénotype et du génotype des PDX au fil du temps12,14,15. Quelle que soit la source des tumeurs PDX, il est important d’effectuer un dépistage fréquent des colonies de PDX et de souris pour les agents pathogènes humains et de souris, tels que le VIH et l’hépatite pour les humains et Corynebacterium bovis pour les souris. Cela limitera la propagation des agents pathogènes indésirables du PDX à la fois à la personne qui les manipule et aux autres souris de l’étude et du vivarium.

Les méthodes d’implantation décrites ici peuvent être utilisées pour étudier la biologie tumorale, évaluer de multiples aspects de la cascade métastatique et pour des études précliniques. Le principal avantage de l’implantation de flanc est la facilité de surveillance tumorale au fil du temps, car les tumeurs sont visibles et sa croissance peut être facilement mesurée à l’aide d’un pied à coulisse. Cette méthode peut être un bon point de départ pour établir la faisabilité d’une cible médicamenteuse. L’implantation intracrânienne est préférable si la présence du microenvironnement cérébral est importante et pourrait altérer la croissance ou le profil moléculaire de la tumeur. De plus, l’implantation intracrânienne place la tumeur derrière la barrière hémato-encéphalique (BHE), ce qui la rend essentielle pour les études précliniques examinant l’efficacité des médicaments nécessaires pour traverser la BHE. Cependant, il est difficile de surveiller la croissance des tumeurs PDX et nécessite une imagerie radiologique ou bioluminescente si les cellules sont marquées. Savoir quand commencer le traitement médicamenteux précliniquement nécessiterait soit des données d’imagerie pour surveiller la croissance, soit la connaissance de la survie moyenne des souris porteuses d’une tumeur PDX particulière. De plus, l’implantation intracrânienne contourne toutes les étapes essentielles de la cascade métastatique, ce qui la rend uniquement adaptée à l’étude de l’efficacité des médicaments et du microenvironnement tumoral dans le cerveau. Malgré les différences dans le microenvironnement tumoral, la morphologie des tumeurs PDX est similaire quel que soit le site d’implantation comme on peut le voir dans cette tumeur PDX (CM04) dérivée d’une métastase cérébrale provenant d’une tumeur primitive du cancer du poumon à petites cellules (Figure 2). La morphologie du cancer du poumon à petites cellules des cellules tumorales avec de petits noyaux et peu de cytoplasme peut être observée dans la tumeur du flanc, la tumeur intracrânienne et les métastases abdominales résultant de l’injection intracardiaque. En outre, des métastases spontanées de tumeurs implantées dans le flanc ont déjà été observées12, ce qui suggère que les processus métastatiques tels que l’intravasation, l’extravasation et la colonisation peuvent être récapitulés et étudiés dans les tumeurs du flanc, ce qui ne serait autrement pas possible avec les tumeurs orthotopiques du cerveau. En général, on observe que l’implantation de flancs est une méthode appropriée pour étudier la biologie des métastases du SNC et mener des études précliniques.

L’injection intracardiaque est le plus souvent utilisée pour étudier le tropisme des organes et le potentiel métastatique des tumeurs. Les cellules tumorales injectées devraient subir plusieurs étapes de la cascade métastatique, y compris la circulation survivante, l’extravasation et la colonisation du site métastatique. Tout comme l’injection orthotopique dans le cerveau, il peut être difficile de suivre la progression des métastases tumorales sans imagerie radiologique ou marquage cellulaire. Cependant, comme pour l’implantation orthotopique, une inoculation réussie entraîne une détérioration de l’état des animaux au fil du temps à mesure que la tumeur se propage. La figure 3A montre des métastases au cerveau après injection intracardiaque dans le modèle PDX de métastases du SNC, M2, provenant d’un mélanome. L’injection intracardiaque de la tumeur PDX (CM04) a entraîné des métastases dans la cavité abdominale et le foie (Figure 3B). D’autres organes évalués, tels que les poumons, les reins et les ovaires, n’avaient pas de métastases visibles.

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Figure 1 : Organigramme montrant le flux de travail général de l’établissement, de la propagation et de l’utilisation de PDX pour les études précliniques. Pour chaque méthode d’inoculation, les étapes de la cascade métastatique impliquée sont énumérées sous chaque méthode. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Histologie des tumeurs PDX suivant différentes méthodes d’inoculation. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) d’une tumeur PDX métastase du SNC provenant d’un cancer du poumon à petites cellules (CM04) implantée chez des souris immunodéprimées par les trois méthodes présente des caractéristiques pathohistologiques et morphologiques tumorales similaires à celles des cancers du poumon à petites cellules, avec de petits noyaux et peu de cytoplasme. Le panel d’injection intracardiaque montre une métastase abdominale. Des nids de cellules de petite taille et un rapport nucléaire / cytoplasmique élevé sont évidents dans les trois images. Les images ont été prises sur un scanner de diapositives et agrandies à 10x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Ill. 3 : Métastases observées après injection intracardiaque. Coloration H&E des tissus avec métastases visibles lors de l’évaluation par nécropsie après injection intracardiaque de (A) M2 et (B) CM04. Les images ont été prises (A) sur un scanner de lames et agrandies à 1x (gauche) ou 20x (droite) ou (B) sur un microscope ordinaire à un grossissement de 10x. Ce chiffre a été modifié par rapport à notre publication précédente12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans le présent manuscrit, les méthodes d’établissement et de propagation du PDX ont été détaillées. Trois méthodes d’inoculation différentes pouvant être utilisées pour mettre en place des études précliniques lors de l’évaluation des métastases du SNC ont également été démontrées. La méthode choisie devrait dépendre des objectifs de l’expérience. Dans certains cas, il serait avantageux d’utiliser plus d’une voie d’inoculation. Par exemple, l’implantation sous-cutanée du flanc fournit une approche simple pour étudier l’efficacité d’un médicament sur la croissance tumorale et évaluer le médicament sur sa cible et fournit également un visuel pour la taille de la tumeur qui est facilement surveillé et mesuré. Cependant, une fois que la faisabilité de la cible et les propriétés de croissance antitumorale sont établies, on pourrait mettre en place une étude orthotopique pour évaluer l’efficacité du produit biologique à traverser la BHE et étudier son effet dans le microenvironnement de la tumeur cérébrale. En outre, la survie est mieux évaluée dans les études d’injection orthotopique et intracardiaque.

L’injection intracrânienne de modèles PDX de métastases cérébrales est souvent le modèle préclinique de choix en raison de la présence du microenvironnement cérébral et de la BHE. Cependant, des études ont montré que les métastases cérébrales ont la capacité de modifier la BHE, ce qui affecte la perméabilité des molécules à la tumeur16. Ces changements dans la BHE ne seraient pas reflétés par des tumeurs implantées par voie intracrânienne et, en raison de cela, les études précliniques sur les médicaments pourraient ne pas refléter pleinement la réponse des tumeurs des patients. Même avec cette mise en garde, l’injection intracrânienne reste la meilleure méthode pour tester la perméabilité et l’efficacité des médicaments pour traverser la BHE dans des modèles précliniques. Un autre défi avec les modèles intracrâniens est qu’ils sont difficiles à surveiller la croissance tumorale et nécessitent l’utilisation de techniques d’imagerie. La transduction virale des PDX avec des marqueurs fluorescents ou bioluminescents est traditionnellement utilisée, mais peut être difficile à réaliser. Cependant, plusieurs techniques d’imagerie sont en cours de développement pour une utilisation chez la souris qui ne nécessitent pas l’introduction de marqueurs, ce qui pourrait améliorer la facilité de surveillance de ces tumeurs cérébrales orthotopiques pour les études précliniques. Il s’agit notamment de technologies d’imagerie telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et la tomographie par émission de positrons (TEP) et la microtomodensitométrie (micro-TDM). Enfin, l’injection intracrânienne peut ne pas refléter avec précision le microenvironnement des métastases du SNC à l’extérieur du cerveau, comme dans les métastases leptoméningées. Dans ce cas, l’injection dans la citerne magna pourrait être réalisée pour représenter plus précisément les métastases leptoméningées17.

La caractérisation des caractéristiques phénotypiques et moléculaires du modèle PDX est importante pour sélectionner les meilleurs modèles pour les études précliniques. La latence tumorale peut aller de 7 à 140 jours et les taux de prise peuvent également être très variables12. Le nombre optimal d’animaux à implanter et le moment du début du traitement devraient être basés sur les caractéristiques de chaque modèle PDX et doivent être déterminés empiriquement. En outre, le profil moléculaire des tumeurs PDX est également important pour la sélection des modèles PDX les plus représentatifs pour les études précliniques. Plus le modèle représente moléculairement le tissu du donneur, plus il est susceptible d’être prédictif de la réponse clinique. En outre, il est essentiel de s’assurer que les cibles sélectionnées à partir des données humaines sont présentes dans les PDX choisis pour les études et sont maintenues pendant quelques générations, comme le montre la succession clonale est associée à un profil génomique différent du clone dominant titulaire. À la lumière de cela, les profils phénotypiques et moléculaires des tumeurs PDX métastases du SNC ont été largement caractérisés sur plusieurs générations12.

Malgré les nombreux avantages de l’utilisation de modèles PDX de métastases du SNC, leur utilisation présente plusieurs limites. Tout d’abord, un microenvironnement tumoral alternatif et surtout l’absence d’un système immunitaire sont des limites bien documentées des modèles PDX18. La xénogreffe d’une tumeur humaine chez la souris entraîne le remplacement du stroma humain par le stroma de souris à chaque passage ultérieur et le stroma humain est généralement complètement remplacé après plusieurs passages19. Cependant, les différences dans le microenvironnement tumoral n’entraînent pas de grandes différences dans le profil moléculaire des tumeurs PDX implantées à flanc par rapport à la tumeur du patientd’origine 12, ce qui suggère que les modèles de flanc représentent toujours de bons modèles expérimentaux pour étudier les métastases du SNC. Deuxièmement, l’utilisation d’animaux immunodéprimés entraîne un manque d’infiltration de cellules immunitaires dans la tumeur et une réponse immunitaire générale de l’hôte, limitant une manière fondamentale dont l’hôte tente de lutter contre la croissance du cancer12. Alors que des souris humanisées greffées avec des cellules immunitaires humaines sont disponibles pour étudier les interactions de cellules immunitaires spécifiques avec la tumeur, il y a encore beaucoup de questions et de controverses sur les approches, les méthodes et l’interprétation de ces résultats20.

Alors que la majorité des PDX se sont révélés génétiquement stables, nous et d’autres avons montré que dans de rares cas, même en l’absence de traitements ou d’autres pressions sélectives externes, il pourrait y avoir des changements dans les clones des tumeurs, tels que la prise de contrôle de clones mineurs12,14,15. Cela pourrait entraîner des changements spectaculaires dans le profil moléculaire, ce qui finirait par rendre la tumeur ne reflétant pas les clones dominants dans la tumeurdu patient 12. Alors que les PDX présentant une succession clonale peuvent être utilisés dans les études précliniques, de nombreux gènes destinés au ciblage (par exemple, Her2) pourraient être perdus avec la succession clonale. Par conséquent, un dépistage fréquent des modèles PDX pour déterminer s’ils maintiennent toujours le profil moléculaire du clone souhaité est encouragé.

En résumé, les modèles PDX représentent un excellent système modèle pour l’étude non seulement des métastases du SNC, mais aussi d’autres types de tumeurs. Le développement de ces modèles a montré qu’ils reflètent en grande partie le profil phénotypique, moléculaire et l’hétérogénéité des métastases du SNC humain 8,9,10,12. Ils servent de modèles efficaces pour étudier à la fois la biologie des métastases du SNC et servent également de modèles précliniques physiologiquement pertinents, remplaçant les modèles de lignées cellulaires surutilisés historiquement utilisés pour les études in vivo des métastases du SNC. Sans aucun doute, les différences entre le PDX et la tumeur du patient donneur existent12,18. Il est important de connaître ces différences pour une planification et une exécution appropriées des études précliniques. Enfin, en choisissant entre plusieurs voies d’inoculation, les modèles PDX sont polyvalents dans leur utilisation permettant l’étude de multiples aspects de la maladie. Les modèles PDX joueront sans aucun doute un rôle important dans l’avancement de notre compréhension des métastases du SNC et le développement de nouvelles thérapies.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Remerciements

La figure 3A a été tirée de notre publication précédente12 et a été générée dans le laboratoire du Dr Jann Sarkaria à la Mayo Clinic.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille 25GVWRBD305122
70 & micro ; m Passoire cellulaireVWR21008-952
Lingettes à l’éthanol 70 %VWR470106-486
Cire d’osMedVetW31G-RL
CIEA NOG sourisTaconicNOG-F
DMEMThermoFisher11965092
Ethiqa XR (buprénorphine SR)MWI072117
FBSThermoFisher
douxMACS C TubeMiltenyi130-093-237
douxMACS Octo DissociateurMiltenyi130-095-937
Seringue HamiltonSigma20919
Matrigel facteur de croissance réduit (DFG)Corning354230
Pommade ophtalmiqueMedVetPH-PURALUBE-VET
PBS/DPBSThermoFisher14040133
Povidone : écouvillons iodésVWR15648-906
Cadre stéréotaxiqueStoelting51730
Foret chirurgicalStoelting58610
Colle chirurgicaleMedVetVG3
Sutures chirurgicalesMedVetMMV-661-V
SeringueVWR53548-001
Kit de dissociation tumoraleMiltenyi130-095-929
16000044

Références

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Mots-clés

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