Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

Résumé

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Résumé

L’actine, le composant principal du cytosquelette, joue un rôle essentiel dans le maintien de la structure et de la fonction neuronales. Sous les états physiologiques, l’actine se présente en équilibre sous ses deux formes : globulaire monomère (G-actine) et filamenteuse polymérisée (F-actine). Aux bornes synaptiques, le cytosquelette d’actine forme la base des fonctions pré- et post-synaptiques critiques. De plus, les changements dynamiques dans le statut de polymérisation de l’actine (interconversion entre les formes globulaires et filamenteuses d’actine) sont étroitement liés aux altérations liées à la plasticité de la structure et de la fonction synaptiques. Nous rapportons ici une méthodologie basée sur la fluorescence modifiée pour évaluer le statut de polymérisation de l’actine dans des conditions ex vivo. Le test utilise de la phalloïde marquée par fluorescence, une phallotoxine qui se lie spécifiquement aux filaments d’actine (F-actine), fournissant une mesure directe de l’actine filamenteuse polymérisée. Comme preuve de principe, nous fournissons des preuves de la pertinence de l’essai à la fois dans les homogénats de tissu cérébral humain de rongeur et post mortem. En utilisant la latrunculinE A (un médicament qui dépolymérise les filaments d’actine), nous confirmons l’utilité du test dans la surveillance des altérations des niveaux de F-actine. De plus, nous étendons le dosage aux fractions biochimiques des terminaux synaptiques isolés dans lesquels nous confirmons une polymérisation accrue de l’actine lors de la stimulation par dépolarisation avec un K⁺extracellulaire élevé.

Introduction

L’actine protéique cytosquelettique est impliquée dans de multiples fonctions cellulaires, y compris le soutien structurel, le transport cellulaire, la motilité cellulaire et la division. L’actine se présente en équilibre sous deux formes : l’actine globulaire monomère (G-actine) et l’actine filamenteuse polymérisée (F-actine). Les changements rapides dans l’état de polymérisation de l’actine (interconversion entre ses formes G et F) entraînent un assemblage et un désassemblage rapides du filament et sous-tendent ses rôles régulateurs dans la physiologie cellulaire. L’actine forme le composant majeur de la structure cytosquelettique neuronale et influence un large éve....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux règlements du Comité d’éthique de l’Université d’Otago sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (Protocole d’éthique No. AUP95/18 et AUP80/17) et le parlement néo-zélandais. Les tissus cérébraux humains ont été obtenus à partir de la banque de tissus neurologiques de la biobanque Clínic-IDIBAPS de l’hôpital de Barcelone, en Espagne. Tous les protocoles de prélèvement de tissus ont été approuvés par le comité d’éthique de l’hôpital Clínic de Barcelone et le consentement éclairé des familles a été obtenu.

1. Préparation des tampons et des réactifs

Résultats

Linéarité du test pour l’évaluation des niveaux de F-actine
Tout d’abord, une courbe standard pour l’augmentation linéaire de la fluorescence de la phalloïde Alexa Fluor 647 a été établie et répétée pour chaque ensemble d’expériences(Figure 1). Pour étudier la plage linéaire de l’essai, différentes quantités d’homogénats cérébraux provenant de rongeurs(figures 2A et 2B)et de sujets humains post mortem(figures 3A

Discussion

Le dosage décrit ici, essentiellement adapté d’une étude précédente³⁰ avec des modifications, utilise une phallotoxine, la phalloïde marquée d’une étiquette fluorescente. Les analogues de la phalloïde fluorescente sont considérés comme l’étalon-or pour la coloration des filaments d’actine dans les tissus fixes^47,48,49. En fait, ce sont les outils les plus anciens pour identifier spécifiquement les filamen.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube en polycarbonate à paroi épaisse de 3,5 mL	Beckman Coulter	349622	Pour la centrifugation par gradient (préparation des synaptosmes)
Alexa Fluor 647 Phalloïdine	Thermo Fisher Scientific	A22287	Ligand spécifique de l’actine F
Anticorps contre   ; b-actine	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	Pour l’évaluation des taux d’actine totale par immunobuvard
Anticorps contre le GAPDH	Abcam	Ab181602	Pour l’évaluation des taux de GAPDH par immunobuvardage
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Bradford Estimation des protéines basée sur
chlorure de calcium dihydraté (CaCl2· ; 2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Composant tampon Krebs
cOmplete, Mini, sans EDTA Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich	4693159001	Pour l’inhibition de l’activité de la protéase endogène pendant la préparation de l’échantillon
Corning 96 puits Polystyrène transparent à fond plat	Corning	3596	Pour les mesures de diffusion de la lumière
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Composant tampon de Krebs
Sulfoxyde de diméthyle	Sigma-Aldrich	D5879	Solvant pour la phalloïdine et la latrunculine A
Scanner à plat fluorescent (scanner infrarouge Odyssey)	Li-Cor Biosciences		Pour la détection de signaux immunoréactifs sur les immunoblots
Solution de glutaraldéhyde (25 % dans l’eau) Grade II	Sigma-Aldrich	G6257	Fixateur
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Ingrédient tampon pour la préparation d’échantillons et composant tampon Krebs
Latronculine A	Sigma-Aldrich	L5163	Dépolymériseur de filaments d’actine
Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2· ; 6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Composant tampon Krebs
Microplaques
Filtre à membrane Mitex 5 mm	Millipore	LSWP01300	Préparation des synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate	Thermo Fisher Scientific	237105	Pour les mesures fluorométriques
Filtre en nylon 100 mm	Millipore	NY1H02500	Préparation de synaptoneurosomes
Cocktail inhibiteur de la phosphatase IV	Abcam	ab201115	Pour l’inhibition de l’activité de la phosphatase endogène pendant la préparation de l’échantillon
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Composant tampon de Krebs et pour la dépolarisation des terminaisons synaptiques
Phosphate de potassium monobasique ((KH2PO4 )	Sigma-Aldrich	P9791	Composant tampon Krebs
Borohydrure de sodium (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Composant du tampon de perméabilisation
Chlorure de sodium (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Composant tampon Krebs
Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Composant tampon Krebs
SpectraMax i3x	Dispositifs		Pour les mesures fluorométriques
Saccharose	Fisher Chemical	S/8600/60	Ingrédient tampon pour la préparation d’échantillons
Porte-filtre Swimnex	Millipore	Sx0001300	Préparation de synaptoneurosomes
Broyeur de tissus 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	Pour l’homogénéisation des tissus
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Composant du tampon de perméabilisation
Base Trizma	Sigma-Aldrich	T6066	Ingrédient tampon pour la préparation des échantillons

le moléculaires