Method Article

Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

DOI:

10.3791/62268

⸱

June 3rd, 2021

 , 
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’actine, le composant principal du cytosquelette, joue un rôle essentiel dans le maintien de la structure et de la fonction neuronales. Sous les états physiologiques, l’actine se présente en équilibre sous ses deux formes : globulaire monomère (G-actine) et filamenteuse polymérisée (F-actine). Aux bornes synaptiques, le cytosquelette d’actine forme la base des fonctions pré- et post-synaptiques critiques. De plus, les changements dynamiques dans le statut de polymérisation de l’actine (interconversion entre les formes globulaires et filamenteuses d’actine) sont étroitement liés aux altérations liées à la plasticité de la structure et de la fonction synaptiques. Nous rapportons ici une méthodologie basée sur la fluorescence modifiée pour évaluer le statut de polymérisation de l’actine dans des conditions ex vivo. Le test utilise de la phalloïde marquée par fluorescence, une phallotoxine qui se lie spécifiquement aux filaments d’actine (F-actine), fournissant une mesure directe de l’actine filamenteuse polymérisée. Comme preuve de principe, nous fournissons des preuves de la pertinence de l’essai à la fois dans les homogénats de tissu cérébral humain de rongeur et post mortem. En utilisant la latrunculinE A (un médicament qui dépolymérise les filaments d’actine), nous confirmons l’utilité du test dans la surveillance des altérations des niveaux de F-actine. De plus, nous étendons le dosage aux fractions biochimiques des terminaux synaptiques isolés dans lesquels nous confirmons une polymérisation accrue de l’actine lors de la stimulation par dépolarisation avec un K+extracellulaire élevé.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’actine protéique cytosquelettique est impliquée dans de multiples fonctions cellulaires, y compris le soutien structurel, le transport cellulaire, la motilité cellulaire et la division. L’actine se présente en équilibre sous deux formes : l’actine globulaire monomère (G-actine) et l’actine filamenteuse polymérisée (F-actine). Les changements rapides dans l’état de polymérisation de l’actine (interconversion entre ses formes G et F) entraînent un assemblage et un désassemblage rapides du filament et sous-tendent ses rôles régulateurs dans la physiologie cellulaire. L’actine forme le composant majeur de la structure cytosquelettique neuronale et influence un large éventail de fonctions neuronales1,2. Il convient de noter que le cytosquelette d’actine fait partie intégrante de la plate-forme structurelle des terminaux synaptiques. En tant que tel, il est un déterminant majeur de la morphogenèse et de la physiologie synaptiques et joue un rôle fondamental dans le contrôle de la taille, du nombre et de la morphologie des synapses3,4,5. En particulier, la polymérisation-dépolymérisation dynamique de l’actine est un déterminant clé du remodelage synaptique associé à la plasticité synaptique sous-jacente aux processus de mémoire et d’apprentissage. En effet, tant les fonctions présynaptiques (telles que la libération de neurotransmetteurs6,7,8,9,10)que postynaptiques (remodelage dynamique lié à la plasticité11,12,13,14)s’appuient de manière critique sur des changements dynamiques dans le statut de polymérisation du cytosquelette d’actine.

Dans des conditions physiologiques, les niveaux de F-actine sont régulés dynamiquement et étroitement par une voie multimodale impliquant une modification post-traductionnelle4,15,16 ainsi que des protéines de liaison à l’actine (ABPs)4,17. Les AOP peuvent influencer la dynamique de l’actine à plusieurs niveaux (tels que l’initiation ou l’inhibition de la polymérisation, l’induction de la ramification des filaments, la section des filaments en morceaux plus petits, la promotion de la dépolymérisation et la protection contre la dépolymérisation), et sont à leur tour sous un contrôle modulatoire rigoureux sensible à divers signaux extra- et intracellulaires18,19,20. De tels contrôles de réglementation à plusieurs niveaux dictent une réglementation stricte de la dynamique d’actine au cytosquelette synaptique, en affinant les aspects pré- et postsynaptic de la physiologie neuronale à la fois aux états basiques et induits par l’activité.

Compte tenu des rôles importants de l’actine dans la physiologie neuronale, il n’est pas surprenant que plusieurs études aient fourni des preuves d’altérations de la dynamique de l’actine en tant qu’événements pathogènes critiques liés à un large éventail de troubles neurologiques, y compris la neurodégénérescence, les maladies psychologiques ainsi que les affections neurodéveloppementales3,21,22, 23,24, 25,26,27. Malgré la richesse des données de recherche pointant vers des rôles clés de l’actine dans la physiologie neuronale et la physiopathologie, cependant, des lacunes importantes subsistent dans la compréhension de la dynamique de l’actine, en particulier au niveau du cytosquelette synaptique. D’autres études de recherche sont nécessaires pour avoir une meilleure compréhension de l’actine neuronale et de ses altérations dans des conditions pathologiques. L’un des principaux domaines d’intérêt dans ce contexte est l’évaluation de l’état de polymérisation de l’actine. Il existe des trousses commerciales occidentales à base de buvards (trousse biochimique d’essai in vivo de G-Actine/F-Actine; Cytosquelette SKU BK03728,29) et des tests faits maison pour l’évaluation des niveaux de F-actine6. Cependant, parce que ceux-ci exigent l’isolement biochimique de la F-actine et de la G-actine et parce que leur quantification suivante est basée sur des protocoles d’immunoblotting, ils peuvent prendre du temps. Nous rapportons ci-dessus un dosage spectroscopie-basé sur la fluorescence adapté d’une étude précédente30 avec des modifications qui peuvent être employées pour évaluer les deux niveaux basiques de F-actine, aussi bien que les changements dynamiques de son assemblage-démontage. Notamment, nous avons modifié efficacement le protocole original qui exige des échantillons adaptés à une cuvette de 1 mL au format actuel de plaque de 96 puits. Le protocole modifié a donc considérablement réduit la quantité de tissu/échantillon requise pour l’essai. De plus, nous fournissons des preuves que le protocole convient non seulement aux homogénats de tissu cérébral, mais également aux fractions subcellulaires telles que les terminaux synaptiques isolés (synaptosomes et synaptoneurosomes). Enfin, le test peut être utilisé pour les tissus cérébraux de rongeurs fraîchement disséqués et les échantillons de cerveau humain post mortem stockés à long terme. Il convient de noter que, bien que le test soit présenté dans un contexte neuronal, il peut être étendu de manière appropriée à d’autres types de cellules et processus physiologiques qui leur sont associés.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux règlements du Comité d’éthique de l’Université d’Otago sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (Protocole d’éthique No. AUP95/18 et AUP80/17) et le parlement néo-zélandais. Les tissus cérébraux humains ont été obtenus à partir de la banque de tissus neurologiques de la biobanque Clínic-IDIBAPS de l’hôpital de Barcelone, en Espagne. Tous les protocoles de prélèvement de tissus ont été approuvés par le comité d’éthique de l’hôpital Clínic de Barcelone et le consentement éclairé des familles a été obtenu.

1. Préparation des tampons et des réactifs

  1. Préparer les tampons suivants pour l’homogénéisation du tissu cérébral et la préparation d’une fraction enrichie de terminaux synaptiques:
    Tampon d’homogénéisation : HEPES 5 mM, pH 7,4 complété par du saccharose 0,32 M
    Tampon de remise en suspension : Tris 5 mM, pH 7,4 complété par du saccharose 0,32 M
    Tampon de lavage: 5 mM Tris, pH 8.1
    1,2 M saccharose
    1,0 M saccharose
    0,85 M saccharose
  2. Ajouter un mélange maison ou commercial d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.
    REMARQUE: Nous avons utilisé la version sans EDTA du mélange Complete Protease Inhibitor (1 comprimé par tampon de 10 mL) et du cocktail IV d’inhibiteurs de phosphatase (1:100; volume: volume).
  3. Préparer les tampons et réactifs suivants pour la fixation, la perméabilisation et la liaison de la phalloïde:
    Tampon de Krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0,1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4
    1 M KCl
    Glutaraldéhyde à 25 % (solution mère)
    Tampon de Krebs contenant 0,1 % de Triton X-100 et 1 mg/mL de NaBH4
    400x Alexa Fluor 647 Phalloïde dans DMSO
    Tampon de Krebs contenant 0,32 M de saccharose
    50 μM de latrunculinE A dans le DMSO (solution mère)
    1 M KCl (solution mère)
    ATTENTION : La phalloïde est toxique(DL 50 = 2 mg/kg) et doit être manipulée avec précaution. L’inhalation de glutaraldéhyde est toxique et doit être manipulée dans une hotte.
  4. Conserver les tampons à 4 °C et la phalloïde et la latrunculine A à -20 °C pour un stockage à long terme.
    Remarque : stockage à long terme des tampons n’est pas recommandé. Le protocole peut être suspendu ici.

2. Homogénéisation des tissus cérébraux

  1. Homogénéiser le tissu cérébral de rat cryoconservé ou fraîchement disséqué dans 10 volumes de tampon d’homogénéisation dans un tube de verrePotter-Elvehjem et un pilon sur glace.
    REMARQUE: L’homogénéisation optimale est obtenue par 15-20 coups du pilon à la main pour les tissus cérébraux. L’homogénéisation réussie peut être confirmée par un écoulement fluide de la suspension à travers le tube de verre. Le protocole peut être suspendu ici.
  2. Déterminer la concentration en protéines dans l’homogénat à l’aide d’un dosage de Bradford31.
    REMARQUE: D’autres tests faits maison ou commerciaux pour l’estimation des protéines peuvent également être utilisés.
  3. Diluer les échantillons homogénésés dans le tampon de Krebs à une concentration de 2-3 mg de protéines/mL dans un volume de 50 μL.
    REMARQUE: Dans certaines de nos expériences, nous incubons des homogénats avec de la latrunculine A ou DMSO (témoins) à 2 μM à 37 °C pendant 1 h. Pour cela, les homogénats sont remises en suspension dans 48 μL de tampon de Krebs, et 2 μL de latrunculinE A de 50 μM ou 2 μL de DMSO sont ajoutés. De plus, pour l’immunoblotting, une petite quantité d’échantillon (10 μg) est prélevée après l’incubation.
  4. Fixer les échantillons homogénésés (section 5).

3. Préparation de terminaux nerveux isolés

  1. Préparation de synaptosomes
    REMARQUE: Les protocoles alternatifs32,33 pour les synaptosomes peuvent également être utilisés.
    1. Le cerveau de la centrifugeuse s’homogénéate à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
    2. Jetez la pastille, qui est la fraction nucléaire brute.
    3. Centrifuger ensuite le surnageant (S1) obtenu à l’étape 3.1.1 à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
    4. Retirez le surnageant (S2), qui est la fraction cytosolique soluble.
    5. Ressusciter la pastille (P2) obtenue à l’étape 3.1.3, qui est la fraction synaptosomale brute dans le tampon de resuspension.
      REMARQUE: Le volume du tampon de remise en suspension dépend de la quantité de tissu de départ et de la quantité de granulés obtenue. Par exemple, en commençant avec 150-300 mg de tissus cérébraux, la pastille obtenue peut être remise en suspension dans 200 μL de tampon de remise en suspension.
    6. Chargez les synaptosomes bruts ressuscités sur un gradient de saccharose discontinu constitué de volumes égaux de saccharose de 0,85-1,0-1,2 M de saccharose.
      REMARQUE: Nous utilisons généralement 1 mL de chacune des solutions de saccharose (pour 150-300 mg de tissu). Cela peut être modifié en fonction de plus grandes quantités de tissus. Les gradients discontinus peuvent être réalisés à l’aide d’une seringue 25G pressée contre la paroi interne du tube ultracentrifuge et d’une couche douce des couches de saccharose.
    7. Centrifuger à 85 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
      REMARQUE: En raison de la vitesse élevée de centrifugation, une ultracentrifuge capable de créer un vide pour réduire le chauffage est nécessaire.
    8. Recueillir la fraction synaptosomique à l’interface entre 1,0 et 1,2 M de saccharose à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
    9. Laver la fraction synaptosomique avec un tampon de lavage glacé par centrifugation à 18 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C.
      NOTA : Pour le lavage, la fraction synaptosomique obtenue à l’interface de saccharose 1,0 et 1,2 M est recueillie dans un tube frais de 1,5 mL, et un volume égal de tampon de lavage est ajouté, assurant l’élimination du saccharose élevé du milieu.
    10. Laver à nouveau le culot synaptosomal avec un tampon d’homogénéisation glacé à 12 000 g pendant 10 minutes à 4 °C.
    11. Ressusciter les synaptosomes dans le tampon d’homogénéisation sur la glace.
      Remarque : le protocole peut être brièvement suspendu ici.
    12. Déterminer la concentration en protéines à l’aide d’un test de Bradford.
    13. Ressusciter les synaptosomes dans le tampon de Krebs à une concentration de 2-3 mg de protéines/mL dans un volume de 50 μL (47,5 μL si les synaptosomes doivent être dépolarisés par KCl; voir la section 4).
      REMARQUE: Pour la remise en suspension, la fraction synaptosomique est d’abord filée à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C et le surnageant (tampon) est retiré. La pastille synaptosomique est ensuite remise en suspension dans le tampon de Krebs par pipetage doux à l’aide d’une pointe de pipet de 200 μL.
    14. Procéder à la dépolarisation (section 4).
  2. Préparation de synaptoneurosomes
    REMARQUE: Les protocoles alternatifs34,35 pour les synaptoneurosomes peuvent également être utilisés.
    1. Faire passer le cerveau à homogénéat à travers un filtre à filet pré-mouillé de 100 μm de pores dans un porte-filtre à l’aide d’une seringue de 1 mL.
      REMARQUE: Le pré-mouillage de tous les filtres est important pour éviter la perte d’échantillon et doit être effectué à l’aide d’un tampon d’homogénéisation. Pour cela, le tampon d’homogénéisation est passé à travers les filtres dans le porte-filtre à l’aide d’une seringue de 1 mL jusqu’à ce que le tampon s’écoule.
    2. Recueillir le filtrat (F1) dans un tube pré-refroidi de 1,5 mL sur de la glace.
    3. Répéter le procédé (étapes 3.2.1 et 3.2.2) pour la fraction F1 afin d’obtenir le second filtrat (F2).
    4. Passer F2 filtrer à travers un filtre net de 5 μm de pores.
    5. Recueillir le filtrat (F3) dans un tube pré-refroidi de 1,5 mL sur de la glace.
    6. Centrifuger filtrer F3 à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
    7. Réinstaurer la pastille (synaptoneurosomes) dans le tampon de Krebs sur de la glace à une concentration de 2-3 mg de protéines/mL dans un volume de 50 μL (47,5 μL si les synaptosomes doivent être dépolarisés par KCl; voir la section 4).
      Remarque : le protocole peut être brièvement suspendu ici.
    8. Estimer la concentration en protéines à l’aide d’un test de Bradford.
    9. Procéder à la dépolarisation (section 4).

4. Dépolarisation médiée par KCl de terminaux synaptiques isolés

  1. Équilibrer synaptosomes/synaptoneurosomes à 37 °C pendant 5-10 min.
  2. Stimuler les synaptosomes/synaptoneurosomes en ajoutant du KCl pour augmenterK+ extracellulaire à 50 mM pendant 30 s à 37 °C et ajouter un volume égal de tampon de Krebs au jeu de contrôle non stimulé respectif.
    REMARQUE : Par exemple, ajoutez 2,5 μL de KCl de 1 M aux synaptosomes remises en suspension dans 47,5 μL de tampon de Krebs; et ajouter 2,5 μL de tampon de Krebs au synaptosome de contrôle non stimulé respectif. Pour les expériences dans lesquelles un grand nombre d’échantillons sont impliqués, procéder avec pas plus de 2 échantillons à la fois de sorte que le temps de dépolarisation ne dépasse pas 30 s.
  3. Mettre fin à la stimulation en ajoutant du glutaraldéhyde (section 5).

5. Fixation et coloration à la phalloïde des échantillons

  1. Ajouter le glutaraldéhyde aux échantillons homogénéaux/synaptosomal/synaptoneurosomal à une concentration finale de 2,5% pendant 2-3 min à température ambiante.
    NOTA : Nous avons ajouté 6 μL de solution de glutaraldéhyde à 25 % de sorte que la concentration finale de glutaraldéhyde dans les échantillons de 50 μL (homogénés/synaptosomes/synaptoneurosomes) était d’environ 2,5 %. La fixation est critique et doit être rapide et donc immédiatement après l’ajout de glutaraldéhyde, l’échantillon doit être vigoureusement vortexé.
  2. Sédimenter les échantillons à 20 000 x g pendant 5 min.
  3. Retirez le surnageant.
    REMARQUE: Jetez le surnageant dans une hotte car le glutaraldéhyde est toxique.
  4. Perméabiliser le culot par remise en suspension dans 100 μL de tampon de Krebs contenant 0,1% de Triton X-100 et 1 mg/mL de NaHB4 pendant 2-3 min à température ambiante.
  5. Sédimenter les échantillons à 20 000 x g pendant 5 min.
  6. Retirez la mémoire tampon de perméabilisation.
  7. Laver le culot avec 200 μL de tampon De Krebs par centrifugation à 20 000 x g pendant 5 min.
  8. Ressusciter et colorer la pastille avec 1x phalloïde Alexa Fluor 647 (correspondant à 500 μU) dans 100 μL de tampon Krebs pendant 10 minutes dans l’obscurité à température ambiante.
    REMARQUE: D’autres variétés d’analogues de la phalloïde fluorescente sont disponibles dans le commerce et peuvent être remplacées pour le dosage. La concentration de phalloïde et le volume total de l’échantillon d’incubation peuvent devoir être modifiés en fonction de la quantité et du type de tissu ou d’échantillon testé, et les conditions optimales doivent être normalisées en conséquence.
  9. Centrifuger les échantillons colorés à 20 000 x g pendant 5 min.
  10. Retirez la phalloïde non liée (surnageant).
  11. Laver l’échantillon avec 200 μL de tampon de Krebs par centrifugation à 20 000 x g pendant 5 min.
  12. Remise en suspension dans 200 μL de tampon de Krebs contenant 0,32 M de saccharose.
    Remarque : le protocole peut être brièvement suspendu ici.

6. Analyse fluorométrique et diffusion de la lumière

  1. Distribuez les échantillons tachés de phalloïde Alexa Fluor 647 dans une plaque noire de 96 puits.
  2. Mesurer l’intensité de fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 645 nm et une longueur d’onde d’émission de 670 nm dans un lecteur de plaques à température ambiante.
  3. Transférer les échantillons de la plaque noire de 96 puits vers la plaque transparente de 96 puits à l’aide de pointes de pipet de 200 μL.
  4. Mesurer la diffusion de la lumière à 540 nm pour corriger les pertes qui auraient pu se produire au cours des étapes précédentes de fixation, de perméabilisation et de coloration.
    NOTA : Les variations du matériel biologique conservé dans les échantillons colorés pourraient être plus importantes pour de plus petites quantités de matières premières (voir discussion).
  5. Inclure un ensemble de phalloïde Alexa Fluor 647 dans le tampon de Krebs à différentes concentrations (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x et 1x correspondant à 25, 50, 125, 175, 250, 375 et 500 μU) pour chaque lot de l’essai en tant que courbe standard.
    REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative qui n’affecte pas les résultats de l’essai, en particulier lorsque les concentrations d’actine F sont exprimées de manière relative (section 7). Le protocole peut être suspendu ici.

7. Analyse des données

  1. La quantité de F-actine dans les échantillons est directement proportionnelle à l’intensité de fluorescence de la phalloïdine liée. Exprimer en termes absolus les unités de phalloïde liées calculées à partir de la courbe linéaire de la norme de phalloïdine marquée.
    REMARQUE : À titre d’exemple, voir les figures 2A-B, 3A, 4A-B et la figure supplémentaire 2.
  2. Exprimer les niveaux de F-actine sous la forme d’une fraction des échantillons de contrôle.
    REMARQUE : À titre d’exemple, voir les figures 5A à B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linéarité du test pour l’évaluation des niveaux de F-actine
Tout d’abord, une courbe standard pour l’augmentation linéaire de la fluorescence de la phalloïde Alexa Fluor 647 a été établie et répétée pour chaque ensemble d’expériences(Figure 1). Pour étudier la plage linéaire de l’essai, différentes quantités d’homogénats cérébraux provenant de rongeurs(figures 2A et 2B)et de sujets humains post mortem(figures 3A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le dosage décrit ici, essentiellement adapté d’une étude précédente30 avec des modifications, utilise une phallotoxine, la phalloïde marquée d’une étiquette fluorescente. Les analogues de la phalloïde fluorescente sont considérés comme l’étalon-or pour la coloration des filaments d’actine dans les tissus fixes47,48,49. En fait, ce sont les outils les plus anciens pour identifier spécifiquement les filamen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), le New Zealand Health Research Council (#16-597) et le Département d’anatomie de l’Université d’Otago, en Nouvelle-Zélande. Nous sommes redevables à la Banque de tissus neurologiques de HCB-IDIBAPS BioBank (Espagne) pour les tissus cérébraux humains. Nous remercions Jiaxian Zhang pour son aide dans l’enregistrement et le montage de la vidéo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tube en polycarbonate à paroi épaisse de 3,5 mLBeckman Coulter349622Pour la centrifugation par gradient (préparation des synaptosmes)
Alexa Fluor 647 PhalloïdineThermo Fisher ScientificA22287Ligand spécifique de l’actine F
Anticorps contre   ; b-actineSanta Cruz BiotechnologySc-47778Pour l’évaluation des taux d’actine totale par immunobuvard
Anticorps contre le GAPDHAbcamAb181602Pour l’évaluation des taux de GAPDH par immunobuvardage
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad5000006Bradford Estimation des protéines basée sur
chlorure de calcium dihydraté (CaCl2· ; 2H2O)Sigma-AldrichC3306Composant tampon Krebs
cOmplete, Mini, sans EDTA Cocktail d’inhibiteurs de protéaseSigma-Aldrich4693159001Pour l’inhibition de l’activité de la protéase endogène pendant la préparation de l’échantillon
Corning 96 puits Polystyrène transparent à fond platCorning3596Pour les mesures de diffusion de la lumière
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270Composant tampon de Krebs
Sulfoxyde de diméthyleSigma-AldrichD5879Solvant pour la phalloïdine et la latrunculine A
Scanner à plat fluorescent (scanner infrarouge Odyssey)Li-Cor BiosciencesPour la détection de signaux immunoréactifs sur les immunoblots
Solution de glutaraldéhyde (25 % dans l’eau) Grade IISigma-AldrichG6257Fixateur
HEPESSigma-AldrichH3375Ingrédient tampon pour la préparation d’échantillons et composant tampon Krebs
Latronculine ASigma-AldrichL5163Dépolymériseur de filaments d’actine
Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2· ; 6H2O)Sigma-AldrichM2670Composant tampon Krebs
Microplaques
Filtre à membrane Mitex 5 mmMilliporeLSWP01300Préparation des synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black PlateThermo Fisher Scientific237105Pour les mesures fluorométriques
Filtre en nylon 100 mmMilliporeNY1H02500Préparation de synaptoneurosomes
Cocktail inhibiteur de la phosphatase IVAbcamab201115Pour l’inhibition de l’activité de la phosphatase endogène pendant la préparation de l’échantillon
Chlorure de potassium (KCl)Sigma-AldrichP9541Composant tampon de Krebs et pour la dépolarisation des terminaisons synaptiques
Phosphate de potassium monobasique ((KH2PO4 )Sigma-AldrichP9791Composant tampon Krebs
Borohydrure de sodium (NaBH4)Sigma-Aldrich71320Composant du tampon de perméabilisation
Chlorure de sodium (NaCl)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944Composant tampon Krebs
Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL900Composant tampon Krebs
SpectraMax i3xDispositifsPour les mesures fluorométriques
SaccharoseFisher ChemicalS/8600/60Ingrédient tampon pour la préparation d’échantillons
Porte-filtre SwimnexMilliporeSx0001300Préparation de synaptoneurosomes
Broyeur de tissus 5 mL Potter-ElvehjemDuran Wheaton Kimble358034Pour l’homogénéisation des tissus
Triton X-100Sigma-AldrichX100Composant du tampon de perméabilisation
Base TrizmaSigma-AldrichT6066Ingrédient tampon pour la préparation des échantillons
le moléculaires

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381(2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908(2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992(2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647(2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009(2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119(2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492(2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118(2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin PolymerizationFluorescence SpectroscopyF Actin QuantificationBrain Tissue AssayPhalloidin StainingSynaptic TerminalsSynaptosome PreparationLatrunculin AHigh Throughput Assay96 Well Plate

Related Articles