Summary
يتم تقديم بروتوكول الحقن القائم على Agrobacterium (الحقن الزراعي) لتلقيح فيروس فسيفساء ذيل الثعلب وفيروسات فسيفساء قصب السكر المستنسخة في شتلات الذرة. يؤدي التلقيح بهذه الطريقة إلى العدوى الفيروسية ، وإسكات الجينات التي يسببها الفيروس للجينات الواسمة ، والإفراط في التعبير الفيروسي عن GFP.
Abstract
تستخدم مناهج التلقيح القائمة على Agrobacterium على نطاق واسع لإدخال النواقل الفيروسية في الأنسجة النباتية. تفصل هذه الدراسة بروتوكولا لحقن شتلات الذرة بالقرب من الأنسجة المرستماتية مع Agrobacterium الذي يحمل ناقلا فيروسيا. تم استخدام مستنسخات فيروس الفسيفساء المؤتلف ذيل الثعلب (FoMV) المصممة لإسكات الجينات والتعبير الجيني لتحسين هذه الطريقة ، وتم توسيع استخدامها لتشمل فيروس فسيفساء قصب السكر المؤتلف (SCMV) المصمم للتعبير الجيني. يتم إدخال شظايا الجينات أو تسلسلات الترميز ذات الأهمية في جينوم فيروسي معدل ومعد تم استنساخه في ناقل البلازميد الثنائي T-DNA pCAMBIA1380. يتم تحويل بنى البلازميد الناتجة إلى سلالة Agrobacterium tumefaciens GV3101. يمكن حقن شتلات الذرة التي لا يتجاوز عمرها 4 أيام بالقرب من عقدة coleoptilar مع إعادة تعليق البكتيريا في محلول MgSO4. أثناء العدوى بالبكتيريا الأكروباكتيرية ، يتم نقل الحمض النووي T-DNA الذي يحمل الجينوم الفيروسي إلى خلايا الذرة ، مما يسمح بنسخ جينوم الحمض النووي الريبي الفيروسي. عندما يتكاثر الفيروس المؤتلف وينتشر بشكل منهجي في جميع أنحاء النبات ، يمكن ملاحظة الأعراض الفيروسية والتغيرات المظهرية الناتجة عن إسكات آفة الجينات المستهدفة التي تحاكي 22 (les22) أو phytoene desaturase (pds) على الأوراق ، أو يمكن الكشف عن التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) عند الإضاءة باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو المجهر الفلوري. للكشف عن الفيروس وتقييم سلامة الإدراج في وقت واحد ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من أوراق النبات المحقون ويتم إجراء RT-PCR باستخدام الاشعال المحيطة بموقع الاستنساخ المتعدد (MCS) الذي يحمل التسلسل المدخل. وقد استخدم هذا البروتوكول بفعالية في العديد من الأنماط الجينية للذرة ويمكن توسيعه بسهولة ليشمل ناقلات فيروسية أخرى، مما يوفر أداة يسهل الوصول إليها لإدخال النواقل الفيروسية في الذرة.
Introduction
تم تصميم النسخ المعدية للعديد من الفيروسات النباتية لإسكات الجينات الناجم عن الفيروسات (VIGS) ، والإفراط في التعبير الجيني (VOX) ، ومؤخرا ، تحرير الجينات التي تدعم الفيروسات (VEdGE) 1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11 . مع تطوير تركيبات فيروسية جديدة ، يجب أيضا النظر في طرق لإصابة الأنسجة النباتية بنجاح بهذه الفيروسات المعدلة. تشمل الطرق الحالية لإطلاق العدوى الفيروسية في النباتات قصف الجسيمات ، أو التلقيح بالفرك لنسخ الحمض النووي الريبي في المختبر أو استنساخ الحمض النووي ، أو التلقيح بثقب الأوعية الدموية ، أو تلقيح Agrobacterium tumefaciens (التلقيح الزراعي) 5،12،13،14،15،16،17 . كل طريقة من طرق التطعيم هذه لها مزايا وعيوب متأصلة ، والتي تشمل التكلفة ، والحاجة إلى معدات متخصصة ، وجدوى داخل نظام معين للفيروسات النباتية. يفضل الطرق التي تستخدم تسلل أو حقن سلالات Agrobacterium التي تحتوي على تركيبات T-DNA الثنائية المصممة لتوصيل الفيروسات المؤتلفة ، لأنها بسيطة وغير مكلفة. ومع ذلك ، لا توجد طرق مفصلة للتلقيح الزراعي للأنواع أحادية الفلقة مثل Zea mays (الذرة).
تم نشر أحد التقارير الأولى عن التلقيح الزراعي لتسليم الفيروس في عام 1986 ، عندما تم إدخال جينوم فيروس فسيفساء القرنبيط (CaMV) في بنية T-DNA ، وتم تلقيح Agrobacterium الناتج الذي يحمل هذا البناء على نباتات اللفت18. ومنذ ذلك الحين تم تطوير طرق إضافية للتلقيح الزراعي. على سبيل المثال ، في حالة فيروس فسيفساء ذيل الثعلب (FoMV) ، يمكن استخدام Nicotiana benthamiana كمضيف وسيط لتوليد جزيئات الفيروس في الأوراق التي توفر مصدرا للتلقيح 6. إن التلقيح المطاطي للذرة باستخدام أوراق N. benthamiana المصابة فعال وسريع وبسيط ، لكن استخدام مضيف وسيط لا يعمل مع جميع الفيروسات التي تصيب الذرة. ففيروس فسيفساء قصب السكر، على سبيل المثال، لا يمكن أن يصيب N. benthamiana، مما يتطلب استخدام مصادر تلقيح بديلة للناقلات المشتقة من هذا الفيروس. في عام 1988 ، تم إدخال Agrobacterium التي تحتوي على فيروس خط الذرة (MSV) ، وهو فيروس DNA ، في شتلات الذرة عن طريق الحقن (الحقن الزراعي) ، مما يدل على أن طرق التلقيح القائمة على Agrobacterium مفيدة أيضا ل monocots19. على الرغم من هذا النجاح المبكر مع الحقن الزراعي ، فقد تم نشر عدد قليل من الدراسات التي تستخدم هذه التقنية في الذرة ، مما يترك أسئلة مفتوحة حول إمكانية تطبيق هذه الطريقة على فيروسات الحمض النووي الريبي وناقلات VIGS و VOX و VEdGE 20،21،22. ومع ذلك ، فإن الاستخدام الواسع النطاق للحقن الزراعي في أنواع monocot واعد ، لأن هذا النهج العام قد استخدم في السحلية والأرز والقمح 23،24،25،26،27،28.
تم تحسين هذا البروتوكول لسلالة FoMV و Agrobacterium GV3101 وتم تطبيقه أيضا على متجه SCMV. FoMV هو فيروس potexvirus مع مجموعة واسعة من المضيفين تشمل 56 نوعا من الأحاديات والثنائيات29. يحتوي FoMV على حاسة إيجابية تبلغ 6.2 كيلو قاعدة (kb) ، جينوم RNA أحادي الخيط يشفر خمسة بروتينات مختلفة من خمسة إطارات قراءة مفتوحة (ORFs) 30،31،32،33،34،35. تم تطوير FoMV سابقا إلى ناقل VIGS و VOX للذرة من خلال دمج استنساخ معدي في العمود الفقري البلازميد T-DNA 6,36,37. تم تعديل الجينوم الفيروسي لتطبيقات VIGS عن طريق إضافة موقع استنساخ (MCS1*) مباشرة في اتجاه مجرى بروتين المعطف (CP) (الشكل 1A)36. وفيما يتعلق بتطبيقي VOX وVEdGE، تم تكرار مروج الإنتاج الأنظف وأضيف موقع استنساخ ثان (MCS2) لتمكين إدراج تسلسلات ذات أهمية بين ORF 4 وCP (الشكل 1B)6. متجه FoMV الذي يحتوي على كل من MCS1 و MCS2 بدون إدراج هو متجه FoMV فارغ (FoMV-EV) (الشكل 1).
SCMV هو فيروس غير ذي صلة تم تطويره ل VOX في الذرة 38. وهو عضو في عائلة Potyviridae ، التي تم تصميم العديد من أعضائها للتعبير عن البروتينات الأجنبية في planta39,40,41,42,43,44. يشمل النطاق المضيف ل SCMV الذرة والذرة الرفيعة وقصب السكر45,46 ، مما يجعله ذا قيمة للدراسات الوظيفية الجينية في نباتات المحاصيل الرئيسية هذه 36,38. SCMV لديه إحساس إيجابي ، جينوم الحمض النووي الريبي أحادي الخيط يبلغ طوله حوالي 10 كيلو بايت في الطول 47,48. لإنشاء متجه SCMV VOX ، تم استخدام تقاطع P1 / HCPro الراسخ كموقع إدراج للتسلسلات غير المتجانسة38. ويتبع موقع الاستنساخ هذا تسلسل ترميز موقع انقسام البروتياز NIa-Pro، مما يؤدي إلى إنتاج بروتينات مستقلة عن البروتين المتعدد SCMV (الشكل 1C).
تم تحويل بلازميدات الحمض النووي T-DNA التي تحمل cDNA المعدية لهذه الفيروسات المؤتلفة إلى سلالة Agrobacterium GV3101. GV3101 هي سلالة من نوع النوبالين ، والتي من المعروف أنها قادرة على نقل الحمض النووي T-DNA إلى الأنواع أحادية الفلقة ، بما في ذلك الذرة 26،28،49. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت دراسات الحقن الزراعي السابقة سلالات C58 أو مشتقاتها GV3101 ، وكذلك 19،20،22،27.
تم استخدام ثلاثة جينات مميزة في تطوير هذا البروتوكول: اثنان لإسكات الجينات وواحد للتعبير الجيني. تم استخدام جزء من 329 زوج أساسي (bp) من آفة جين الذرة يحاكي 22 (les22 ، GRMZM2G044074) لبناء ناقل إسكات FoMV-LES22. عندما يتم إسكات les22 في الذرة ، تظهر بقع صغيرة مستديرة من الخلايا الميتة على طول الأوعية الدموية للأوراق التي تتوسع وتتجمع في مناطق واسعة من أنسجة الأوراق الميتة50. FoMV-PDS ، الذي يحتوي على جزء 313 نقطة أساس من جين الذرة الرفيعة phytoene desaturase (pds ، LOC110436156 ، هوية تسلسل 96٪ إلى pds الذرة ، GRMZM2G410515) ، يحفز إسكات PDS في الذرة ، مما يؤدي إلى خطوط صغيرة من الخلايا المبيضة ضوئيا على طول الأوعية الدموية للأوراق التي تطول بمرور الوقت51. تم استخدام تسلسل الترميز السليم لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) لإثبات التعبير عن البروتين لكل من FoMV (FoMV-GFP) و SCMV (SCMV-GFP). عادة ما يكون تعبير GFP في الأوراق أكثر قابلية للكشف في 14 يوما بعد التلقيح (DPI)6. على الرغم من وجود دراسات سابقة تستخدم الحقن الزراعي للناقلات الفيروسية في الذرة ، فقد أظهرت هذه التجارب فقط أن الحقن الزراعي يمكن أن يسهل العدوى الفيروسية من استنساخ معدي في شتلات الذرة ولا يتوسع إلى الفيروسات المؤتلفة المصممة لتطبيقات VIGS أو VOX 19,20,21,22. يعتمد البروتوكول المعروض هنا على طرق الحقن الزراعي السابقة ، وخاصة Grismley et al.19. بشكل عام ، تتوافق طريقة الحقن الزراعي هذه مع ناقلات VIGS و VOX ، ولا تتطلب معدات متخصصة أو مضيفات بديلة كمصادر للتلقيح ، وتقلل من الوقت الإجمالي والتكلفة اللازمين لإعداد وتنفيذ التطعيمات بالنسبة للطرق الشائعة الأخرى التي تتطلب البيولوجيا أو النسخ في المختبر. سيسهل هذا البروتوكول دراسات الجينوم الوظيفية في الذرة مع التطبيقات التي تشمل VIGS و VOX و VEdGE.
Protocol
1. بناء البلازميد
ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول على ناقلات فيروسية أخرى أو سلالات Agrobacterium ، ولكن هذا قد يؤثر على النجاح العام للتلقيح عن طريق الحقن الزراعي. قم دائما بإجراء خطوات التلقيح والطلاء البكتيري في غطاء التدفق الرقائقي.
- بناء إسكات FoMV
ملاحظة: يتم استخدام وسائط Luria-Bertani (LB) (Miller) لجميع الوسائط ما لم ينص على خلاف ذلك. يتكون LB السائل عن طريق تعليق 25 جم من الحبيبات في 1000 مل من الماء المقطر والتعقيم لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية. يتم تصنيع وسائط LB الصلبة بالمثل مع إضافة 1.5٪ من الأجار قبل التعقيم. تضاف المضادات الحيوية بعد تبريد LB إلى ~ 60 درجة مئوية ، ويتم سكب المحلول في ألواح بتري 95 × 15 مم. تركيزات المضادات الحيوية التي يجب استخدامها هي كما يلي: ريفامبيسين (ريف) عند 25 ميكروغرام / مل ، جنتاميسين (جنت) عند 50 ميكروغرام / مل ، وكاناميسين (كان) عند 50 ميكروغرام / مل.- يقوم PCR بتضخيم شظايا من جين الذرة ليتم إسكاتها (على سبيل المثال ، les22 أو pds) باستخدام تمهيدي أمامي مع موقع تقييد PacI وتمهيدي عكسي مع موقع تقييد XbaI. سيمكن ذلك من ربط شظايا الجينات في MCS1 * من الناقل الثنائي FoMV-pCAMBIA1380 في الاتجاه المضاد للإحساس.
ملاحظة: قم بإعداد PCR باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة ، والاشعال الأمامي والخلفي عند 10 ميكرومتر لكل منهما ، وقالب الحمض النووي البلازميد ، والماء ، وفقا لمواصفات بوليميراز الحمض النووي. تضخيم لمدة 35 دورة ، باستخدام درجة حرارة التلدين وفقا لبوليميراز الحمض النووي ودرجة حرارة انصهار التمهيدي (Tm) ، وتمديد 30 ثانية لكل قاعدة كيلوقاعدة ليتم تضخيمها. - قم بإجراء تنقية PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لمواصفات المجموعة.
- هضم منتج PCR النقي و FoMV-EV مع إنزيمات التقييد XbaI و PacI. استخدم 1 ميكروغرام من البلازميد أو كل منتج PCR النقي ، 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x ، 1 ميكرولتر من إنزيم التقييد ، وأضف الماء لإنشاء حجم تفاعل نهائي 20 ميكرولتر. احتضان وفقا لمواصفات الإنزيم.
- قم بربط منتج PCR المهضوم و FoMV-EV جنبا إلى جنب مع ليغاز الحمض النووي T4 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- قم بتحويل البلازميد المربوط إلى خلايا DH5α المختصة كيميائيا باستخدام طريقة الصدمة الحرارية.
- تذوب الخلايا على الجليد وتضيف 3 ميكرولتر من البلازميد إلى الأنبوب. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة ، ثم صدمة الحرارة لمدة 30 ثانية عند 42 درجة مئوية.
- ضعيه على الجليد لمدة 5 دقائق، وأضيفي 200 ميكرولتر من المرق الأمثل مع القمع الهدامي (SOC) واتركي خلايا الإشريكية القولونية تتعافى في وسائط SOC لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
- طبق على وسائط LB الانتقائية kanamycin واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تحقق من المستعمرات بحثا عن نسخ مستنسخة دقيقة عن طريق تسلسل Sanger باستخدام الاشعال FM-5840F و FM-6138R (الجدول التكميلي 1). تقديم 250 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد إلى منشأة من شأنها إجراء تسلسل سانجر. لهذه التجربة تم إرسال عينات إلى مرفق الحمض النووي الأساسي بجامعة ولاية أيوا.
- قم بتلقيح 2 مل من LB السائل مع المستعمرة المختارة واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة. استخراج الحمض النووي البلازميد من الثقافة بين عشية وضحاها من خلال إعداد الحمض النووي البلازميد البلازميد القلوي52.
- تحويل الحمض النووي البلازميد إلى خلايا سلالة Agrobacterium GV3101 باستخدام طريقة التجميد والذوبان. اسمح ل 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة كيميائيا بالذوبان على الجليد ، وأضف 1-5 ميكرولتر من البلازميد واحتضنها على الجليد لمدة 30 دقيقة. ضع في النيتروجين السائل لمدة 1 دقيقة ، ثم احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. أضف 1 مل من SOC ، واتركه للتعافي لمدة 2-3 ساعات عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز ، ولوحة على وسائط LB الانتقائية RIF و gent و kan واحتضنها عند 28 درجة مئوية لمدة يومين.
- مستعمرات الشاشة لوجود إدراج مع مستعمرة PCR. اختر مستعمرة بكتيرية واحدة واخلطها في 30 ميكرولتر من الماء. قم بإعداد تفاعل PCR عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من مزيج البوليميراز الرئيسي ، و 1.25 ميكرولتر من كل 10 ميكرومتر تمهيدي ، FM-5840F و FM-6138R ، و 3 ميكرولتر من تعليق المستعمرة البكتيرية ، والماء إلى حجم نهائي قدره 25 ميكرولتر.
- تلقيح 2-5 مل من LB السائل (ريف ، جنت ، كان) مع مستعمرة Agrobacterium الصحيحة. اتركه ينمو بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
- امزج الثقافة بين عشية وضحاها بمحلول جليسرين بنسبة 50٪ 1: 1. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- يقوم PCR بتضخيم شظايا من جين الذرة ليتم إسكاتها (على سبيل المثال ، les22 أو pds) باستخدام تمهيدي أمامي مع موقع تقييد PacI وتمهيدي عكسي مع موقع تقييد XbaI. سيمكن ذلك من ربط شظايا الجينات في MCS1 * من الناقل الثنائي FoMV-pCAMBIA1380 في الاتجاه المضاد للإحساس.
- بناء تعبير FoMV
- يقوم PCR بتضخيم تسلسل الترميز ذي الأهمية بما في ذلك كودونات البدء والتوقف (على سبيل المثال ، GFP) كما هو موضح في 1.1.1 ، مضيفا موقع تقييد Bsu36I على التمهيدي الأمامي وموقع تقييد PspOMI على التمهيدي العكسي لتمكين الاستنساخ الاتجاهي في الاتجاه المعنى إلى MCS2.
- قم بإجراء تنقية PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لمواصفات المجموعة.
- هضم منتج PCR و FoMV-EV مع إنزيمات التقييد Bsu36I و PspOMI ، كما هو موضح في 1.1.3.
- قم بربط منتج PCR المهضوم و FoMV-EV جنبا إلى جنب مع ليغاز الحمض النووي T4 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تتحول إلى خلايا DH5α المختصة كيميائيا E. coli باستخدام طريقة الصدمة الحرارية كما هو موضح في 1.1.5. طبق على وسائط LB الانتقائية kanamycin واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تحقق من المستعمرات بحثا عن نسخ دقيقة عن طريق تسلسل Sanger كما هو موضح في 1.1.6 باستخدام الاشعال 5AmuS2 و 5AmuA2 (الجدول التكميلي 1).
- قم بتلقيح 2 مل من LB السائل مع المستعمرة المختارة واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة. استخراج الحمض النووي البلازميد من الثقافة بين عشية وضحاها من خلال إعداد الحمض النووي البلازميد البلازميد القلوي52.
- تحويل الحمض النووي البلازميد إلى سلالة Agrobacterium GV3101 الخلايا المختصة كيميائيا باستخدام طريقة ذوبان الجليد كما هو موضح في 1.1.8. لوحة على ريف، جنت، وكان وسائل الإعلام LB انتقائية واحتضان في 28 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
- مستعمرات الشاشة لوجود إدراج مع مستعمرة PCR باستخدام الاشعال 5AmuS2 و 5AmuA2.
- تلقيح 2-5 مل LB السائل (ريف ، جنت ، كان) مع مستعمرة Agrobacterium الصحيحة. رجه طوال الليل عند 225 دورة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية.
- امزج الثقافة بين عشية وضحاها بمحلول جليسرين بنسبة 50٪ 1: 1. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- بناء تعبير SCMV
- يقوم PCR بتضخيم الجين محل الاهتمام (على سبيل المثال ، GFP) باستثناء كودون التوقف كما هو موضح في 1.1.1 ، بما في ذلك موقع هضم PspOMI على التمهيدي الأمامي وموقع هضم SbfI على التمهيدي العكسي لتمكين الاستنساخ الاتجاهي في المتجه الثنائي SCMV-pCAMBIA1380.
ملاحظة: يجب استنساخ الإدراج في إطار يحتوي على البروتين الفيروسي. - قم بإجراء تنقية PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لمواصفات المجموعة.
- هضم منتج PCR و SCMV-EV باستخدام إنزيمات التقييد PspOMI و SbfI ، كما هو موضح في 1.1.3.
- قم بربط منتج PCR المهضوم و SCMV-EV جنبا إلى جنب مع ليغاز الحمض النووي T4 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- قم بتحويل المنتج إلى خلايا DH5α E. coli المختصة كيميائيا باستخدام طريقة الصدمة الحرارية كما هو موضح في 1.1.5. لوحة على وسائط LB الانتقائية kan واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- مستعمرات الشاشة للنسخ المستنسخة الدقيقة عن طريق تسلسل Sanger كما هو موضح في 1.1.6 باستخدام الاشعال SC-745F و HCProR1 (الجدول التكميلي 1).
- قم بتلقيح 2 مل من LB السائل مع المستعمرة المختارة واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة. استخراج الحمض النووي البلازميد من الثقافة بين عشية وضحاها من خلال إعداد الحمض النووي البلازميد البلازميد القلوي52.
- تحويل الحمض النووي البلازميد إلى سلالة Agrobacterium GV3101 الخلايا المختصة كيميائيا باستخدام طريقة ذوبان الجليد كما هو موضح في 1.1.8. لوحة على ريف، جنت، وكان وسائل الإعلام LB انتقائية واحتضان في 28 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
- مستعمرات الشاشة لوجود إدراج مع مستعمرة PCR مع الاشعال SC-745F و HCProR1 كما هو موضح في 1.1.9.
- تلقيح 2-5 مل من LB السائل (ريف ، جنت ، كان) مع مستعمرة Agrobacterium الصحيحة. رجه طوال الليل عند 225 دورة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية.
- امزج الثقافة بين عشية وضحاها بمحلول جليسرين بنسبة 50٪ 1: 1. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- يقوم PCR بتضخيم الجين محل الاهتمام (على سبيل المثال ، GFP) باستثناء كودون التوقف كما هو موضح في 1.1.1 ، بما في ذلك موقع هضم PspOMI على التمهيدي الأمامي وموقع هضم SbfI على التمهيدي العكسي لتمكين الاستنساخ الاتجاهي في المتجه الثنائي SCMV-pCAMBIA1380.
2. إعداد الشتلات
- زرع 1-2 بذور الذرة (الذرة الحلوة "البانتام الذهبي" ، FR1064 ، B73 ، إلخ) في وسط نمو قائم على الخث في إدخالات صغيرة موضوعة داخل الصواني قبل 4-7 أيام من الحقن. ضع في غرفة نمو أقل من 16 ساعة يوميا عند 25 درجة مئوية و 8 ليال عند 22 درجة مئوية (~ 185 إشعاعا نشطا ضوئيا (PAR)) أو في دفيئة أقل من 16 ساعة يوميا عند 22-25 درجة مئوية و 8 ساعات ليلا عند 22-25 درجة مئوية (350-400 PAR).
ملاحظة: تختلف القابلية للبكتيريا الزراعية بين الأنماط الوراثية للذرة، مما يؤثر على معدلات النجاح. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض النواقل الفيروسية غير متوافقة مع بعض الأنماط الوراثية للذرة. - الماء بانتظام والتسميد مرة واحدة في الأسبوع مع 15-5-15 الأسمدة السائلة في 330 جزءا في المليون (PPM).
3. إعداد Agrobacterium
- قبل يوم واحد من الحقن ، قم بإعداد وسائط سائلة LB باستخدام المضاد الحيوي المناسب (RIF ، gent ، kan) وتلقيحها بسلالة Agrobacterium التي تحمل البنية الفيروسية المطلوبة. يوصى بإضافة 20 ميكرولتر من مخزون الجلسرين إلى 50 مل من LB ، والتي يجب أن تنتج ما يكفي من الثقافة البكتيرية لتلقيح >100 نبات ويمكن زيادتها أو تقليلها حسب الحاجة.
ملاحظة: قم بإعداد ما يكفي من اللقاح للحصول على كمية نهائية من التعليق البكتيري لا تقل عن 1 مل بكثافة بصرية تبلغ 600 نانومتر (OD600) من 1.0 لكل 4-5 نباتات. - رجه بسرعة 225 دورة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- بكتيريا بيليه لمدة 10 دقائق عند 4000 × غرام في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبرناتانت.
- اغسل الكريات جيدا ب 1 مل من الماء منزوع الأيونات (DI) عن طريق السحب أو الدوامة اللطيفة.
- كرر الخطوة 3.3 لبكتيريا الكريات.
- أعد تعليق الكريات في محلول 1 مل من محلول MgSO4 10 mM عن طريق السحب أو الدوامة اللطيفة.
- اختياريا، أضف 200 ميكرومتر من الأسيتوسينجون إلى الحل. على الرغم من شيوع استخدامها، إلا أن الأسيتوسينجون يعزز فقط القدرة على تحويل بعض سلالات Agrobacterium . لم يجد المؤلفون أن إضافة الأسيتوسيرينغون تؤثر على الكفاءة في هذا البروتوكول (الجدول التكميلي 2).
ملاحظة: يمكن تصنيع محلول MgSO4 10 mM من محلول مخزون 1 M مع درجة حموضة 6.3 مخزنة في درجة حرارة الغرفة. من المحتمل ألا يتطلب الحل تعديل درجة الحموضة.
- اختياريا، أضف 200 ميكرومتر من الأسيتوسينجون إلى الحل. على الرغم من شيوع استخدامها، إلا أن الأسيتوسينجون يعزز فقط القدرة على تحويل بعض سلالات Agrobacterium . لم يجد المؤلفون أن إضافة الأسيتوسيرينغون تؤثر على الكفاءة في هذا البروتوكول (الجدول التكميلي 2).
- قم بقياس OD600 للعينة باستخدام مقياس الطيف الضوئي وقم بتخفيفه إلى 1.0 OD600 باستخدام محلول MgSO4 10 mM.
ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة. يمكن الاحتفاظ بالتعليق البكتيري في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 5 ساعات قبل الحقن.
4. الحقن
ملاحظة: يمكن استخدام شتلات الذرة من عمر 4-7 أيام للحقن. يتأثر معدل نمو الشتلات بشكل كبير بظروف النمو ، وكمية PAR (أي أعلى PAR في الدفيئة منها في غرفة النمو) ، والنمط الوراثي ، من بين أمور أخرى يمكن أن يكون من الصعب السيطرة عليها في ظروف الدفيئة. يمكن حقن النباتات في عمر 4 أيام عندما يكون طولها 2-3 سم دون أوراق موسعة وعمرها 7 أيام عندما يتم توسيع الورقة ذات الطرف المستدير السفلي. ينخفض معدل نجاح طرق التلقيح هذه بسرعة مع تقدم عمر النباتات بعد 7 أيام من البذر. موقع الحقن هو نفسه بغض النظر عن عمر الشتلات.
- ارتداء نظارات السلامة ، حقن التعليق البكتيري في الشتلات 2-3 ملم فوق عقدة coleoptilar باستخدام إبرة 25G × 5/8 "متصلة بحقنة 1 مل يمكن التخلص منها.
ملاحظة: العقدة coleoptilar هي المكان الذي ستتشكل فيه جذور التاج في النهاية. هذه هي أدنى عقدة في النبات. عادة ، سيكون هناك تغيير في اللون من الأخضر إلى الأبيض عند العقدة وتحتها. موقع الحقن فوق meristem مباشرة. قد يساعد تشريح بعض الشتلات في هذه المرحلة في تصور موقع meristem وبالتالي موقع الحقن المناسب. - ضع ضغطا لطيفا على المحقنة حتى يملأ التعليق الكوليوبتيل أو يكون مرئيا في الزغب ، اعتمادا على مرحلة نمو النباتات. هذا هو ما يقرب من 100-200 ميكرولتر من التعليق.
ملاحظة: إذا كان من الصعب حقن التعليق في الشتلات ، فقد يكون موقع الحقن منخفضا جدا. الضغط المعتدل هو كل ما يجب أن يكون مطلوبا لحقن التعليق. - حقن جميع الشتلات ، وتغيير المحاقن والإبر لكل بناء.
5. الرعاية المستمرة للنباتات
- زرع الشتلات المحقونة إلى 13 × 13 × 15 سم أو أكبر الأواني عندما يكون عمرها 7-8 أيام.
- الحفاظ على ظروف النمو (16 ساعة من الفترة الضوئية والتسميد مرة واحدة في الأسبوع).
6. تأكيد العدوى (ظاهريا و RT-PCR)
- ظاهريا تسجيل النباتات بين 14-21 نقطة في البوصة. الآفات الناجمة عن إسكات الجينات الضابطة الآفات تحاكي 22 أو phytoene desaturase يمكن رؤيتها بسهولة على الأوراق وتختلف عن أعراض FoMV. يمكن الكشف عن تعبير GFP عن طريق التصوير المجهري الفلوري أو التصوير الآخر للأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: قد تستغرق بعض التركيبات / النواقل الفيروسية وقتا أطول لإظهار الأعراض أو قد لا تظهر أي أعراض على الإطلاق. ظروف الإضاءة العالية تزيد بشكل كبير من الأنماط الظاهرية الناجمة عن إسكات الآفة التي تحاكي 22 و phytoene desaturase. قد تكون الآفات أقل وضوحا أو غائبة إذا تم الحفاظ على النباتات في ظروف إضاءة منخفضة مثل غرفة النمو ، ومع ذلك لا ينبغي أن يتأثر معدل العدوى الفعلي كما هو محدد بواسطة RT-PCR (الجدول 1). - لتأكيد العدوى جزيئيا ، قم بأخذ عينة من الورقة 6 بين 14-21 نقطة في البوصة واستخراج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام استخراج الفينول والكلوروفورم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- استخدام الحمض النووي الريبي المستخرج كقالب لإنشاء cDNA من الخيط الأول.
- قم بإعداد تفاعل cDNA مع ما يصل إلى 5 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي ، و 1 ميكرولتر من الاشعال العشوائية hexamer ، و 1 ميكرولتر من oligo (dT) 18 الاشعال ، و 1 ميكرولتر من dNTPs ، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي والماء للحصول على حجم نهائي قدره 14.5 ميكرولتر.
- باستخدام الاشعال المصممة للبناء الفيروسي و cDNA كقالب ، قم بإجراء PCR على كل عينة لتأكيد العدوى الفيروسية وتحديد سلامة الجين أو جزء الجين محل الاهتمام كما هو موضح في 1.1.1 ، باستثناء تقليل الدورات إلى 25 ل FoMV و 30 ل SCMV لتجنب الإيجابيات الكاذبة.
- بالنسبة لتركيبات إسكات FoMV ، استخدم الاشعال FM-5840F و FM-6138R للتضخيم عبر MCS1 * ، الذي يحتوي على جزء جين الذرة. بالنسبة لتركيبات تعبير FoMV ، استخدم الاشعال 5AmuS2 و 5AmuA2 للتضخيم عبر MCS2 ، الذي يحتوي على الجين المدخل.
- بالنسبة لتركيبات تعبير SCMV ، استخدم الاشعال SC745-F و HCProR1 للتضخيم عبر MCS ، الذي يحتوي على الجين المدرج (الشكل التكميلي 3).
- بالنسبة لجين التحكم الداخلي المنشأ، استخدم الاشعال ZmActS و ZmActA، اللذين يضخمان جزء mRNA من أكتين الذرة (GRMZM2G126010) أو الاشعال ZmUbiF و ZmUbiR، والتي تضخم جزء mRNA من بوليوبيكويتين الذرة (GRMZM2G409726_T01).
- تصور منتج PCR على هلام أغاروز بنسبة 1٪ يحتوي على بقعة حمض نووي لتحديد وجود أو عدم وجود فيروس وجزء جيني أو جيني.
Representative Results
كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير بروتوكول بسيط للإدخال المباشر للفيروسات المؤتلفة المصممة لإسكات الجينات أو التعبير الجيني في شتلات الذرة (الشكل 2). يتم تصميم ناقلات الفيروس التي تحمل إدراجات واستنساخها باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية. يتم إدخال شظايا الجينات لإسكات الصوت في MCS1* في FoMV-EV ويتم إدخال تسلسلات الترميز للتعبير في FoMV-EV في MCS2 أو SCMV-EV في MCS. يتم نقل البلازميدات الناتجة إلى سلالة Agrobacterium GV3101. في وقت لاحق ، يتم حقن شتلات الذرة في غضون أسبوع أو أقل بعد الزراعة. بعد أسبوعين من الحقن ، يمكن تقييم النباتات ظاهريا وجزيئيا للعدوى الفيروسية ، وإسكات الجينات ، والتعبير الجيني.
تزرع نباتات الذرة في وسط قائم على الخث لمدة 4-7 أيام. في هذه المرحلة ، يكون meristem القمي فوق العقدة coleoptilar مباشرة (الشكل 3A). بعد أن يمتد coleoptile 2-3 سم أو حتى 7 أيام بعد البذر ، يتم حقن النباتات 2-3 مم فوق عقدة coleoptilar (الشكل 3B-F). في حوالي 12 يوما بعد الحقن ، ستبدأ النباتات في عرض الأنماط الظاهرية الصامتة على أوراقها ، والتي تلاحظ عادة بالقرب من الأنسجة الوعائية ، وهذه الآفات تختلف بصريا عن أعراض الفسيفساء الفيروسية FoMV (الشكل 4). يمكن اكتشاف كل من وجود FoMV وإسكات الجينات المستهدفة في النباتات المحقونة (الشكل 5). يمكن الكشف عن تعبير GFP قبل أسبوعين من الحقن تحت المجهر الفلوري وهو الأقوى على الأوراق 5-7 (الشكل 6). عند ملاحظته تحت نظام التصوير الفلوري ، يمكن تصور تعبير GFP من FoMV على أنه العديد من المناطق الصغيرة المثقوبة من التألق الموزعة عبر الأوراق بالقرب من الأنسجة الوعائية بينما يتكون تعبير GFP من SCMV من بقع أكبر (الشكل 6 ، الشكل التكميلي 1). على الرغم من أن أعراض الفسيفساء الفيروسية غالبا ما تكون مرئية على النباتات المصابة بتركيبات إسكات FoMV ، إلا أن النباتات التي يتم حقنها بتركيبات تعبير GFP التي تعبر بنجاح عن GFP غالبا ما لا تعاني من هذه الأعراض. نتيجة لذلك ، قد لا يزال النبات الذي لا تظهر عليه أعراض مرئية إيجابيا للفيروس والتعبير عن GFP. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تجنب ثقب meristem أثناء إجراء الحقن الزراعي لأن هذا يمكن أن يسبب عيوبا مورفولوجية ، ولكن النباتات الناتجة تبقى على قيد الحياة وغالبا ما تكون أعراضا (الشكل 7).
على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تطويره في الأصل باستخدام الذرة الحلوة ، إلا أنه يمكن تلقيح العديد من الخطوط الناضجة بنجاح باستخدام تركيبات إسكات الجينات FoMV باستخدام الحقن الزراعي. على سبيل المثال ، عادة ما يكون لدى FR1064 و B73 معدلات عالية من العدوى الفيروسية (الجدول 2). والجدير بالذكر أن Mo17 ، وهو خط ذو مقاومة جينية معروفة ل FoMV ، كان لديه كفاءة عدوى بنسبة 0٪ كما هو متوقع 36,53. بالإضافة إلى ذلك ، يؤثر البناء المستخدم على كفاءة العدوى (الجدول 3). في حالة FoMV ، عادة ما يكون لدى FoMV-EV و FoMV-LES22 أعلى كفاءة في العدوى بنسبة 53٪ و 54٪ على التوالي. تتمتع FoMV-PDS بكفاءة أقل قليلا بنسبة 38٪ ، و FoMV-GFP هي الأقل بنسبة 17٪. SCMV-GFP لديه كفاءة عدوى تبلغ 8٪. هذه النسب المئوية هي متوسطات على مدى عدة تجارب. يمكن أن يكون للتجارب الفردية كفاءة أعلى أو أقل في العدوى.
الشكل 1: التمثيلات التخطيطية لاستنساخ FoMV و SCMV T-DNA المستخدمة في الحقن الزراعي في الذرة. يحتوي متجه FoMV على موقعين متعددين للاستنساخ (MCS1* و MCS2). المتجه الفارغ ، FoMV-EV ، هو 7,269 نقطة أساس ولا يحتوي على أي إدراج في أي من MCS. (أ) يمكن تحقيق إسكات الجينات باستخدام ناقل FoMV عن طريق إدخال شظايا الجينات في MCS1 * ، المعينة كتسلسل الاهتمام (SOI) ، عادة في الاتجاه المضاد للحس. (ب) يمكن تحقيق التعبير الجيني باستخدام ناقل FoMV عن طريق إدخال ORFs الجينية في MCS2 في اتجاه المعنى ، المسمى SOI. (ج) صمم متجه SCMV ليكون له MCS واحد بين P1 و HCPro. المتجه الفارغ ، SCMV-EV ، هو 11015 نقطة أساس ولا يحتوي على أي إدخالات في MCS. سيتم التعبير عن ORFs الجينية التي يتم إدخالها في MCS الموجودة في الإطار مع البروتين المتعدد SCMV كبروتينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ملخص تخطيطي لبروتوكول الحقن الزراعي . (أ) استنساخ SOI ، إما CDS أو جزء جيني ، إلى الناقل الفيروسي ويتحول إلى سلالة Agrobacterium GV3101. (ب) تزرع الذرة وتنمو لمدة 4-7 أيام. (ج) تنمو GV3101 في الثقافة السائلة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية. (D) إعداد تعليق بكتيري للحقن. (ه) حقن الشتلات 2-3 مم فوق عقدة coleoptilar مع 100-200 ميكرولتر من التعليق. (و) زرع الشتلات عندما يكون عمرها 7 أيام إلى أواني أكبر وتنمو لمدة 2-3 أسابيع حتى تصبح الورقة الخامسة مرئية. النمط الظاهري إذا رغبت في ذلك. (ز) عينة من الورقة 5 واستخراج الحمض النووي الريبي. (ح) صنع cDNA وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الفيروس / SOI. (I) تشغيل على هلام للتحليل النوعي لتحديد وجود / عدم وجود الفيروس وSOI مبتورة أو سليمة. تم إنشاء هذا الرقم مع BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: طريقة الحقن الزراعي لتلقيح الشتلات فوق العقدة القولونية مباشرة . (أ) النباتات التي يبلغ عمرها 4-5 أيام. يتم توسيع coleoptile بالكامل ، وقد تكون الورقة الحقيقية الأولى مرئية جزئيا ، ولكنها ليست مكشوفة. (ب) النباتات التي يبلغ عمرها 6-7 أيام. يمكن توسيع الورقة الأولى ولكن لن تكون هناك أطواق مرئية. ستكون الورقة الثانية مرئية أيضا وقد تبدأ في الظهور في هذه المرحلة. (ج) تشريح النباتات التي يتراوح عمرها بين 6 و 7 أيام والتي تبين موقع الميريستيم القمي فيما يتعلق بالعقدة القولونية. (د) حقن النباتات القديمة 4-5 أيام. (ه) حقن النباتات التي يتراوح عمرها بين 6 و 7 أيام. (و) حقن النباتات التي يتراوح عمرها بين 6 و 7 أيام باستخدام محلول صبغي ، يظهر التلقيح المصبوغ يخرج من وبر الشتلات. (ز) صورة مقربة لموقع حقن النباتات التي يتراوح عمرها بين 6 و 7 أيام فيما يتعلق بالعقدة القولونية. (ح) صورة مقربة لنبات عمره 6-7 أيام بعد الحقن، تظهر التلقيح المصبوغ في وبر النبات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أعراض جينات التحكم في إسكات الصوت المستخدمة في تجارب الحقن الزراعي . (أ) ورقة تم تصويرها بسرعة 17 نقطة في البوصة بعد حقن النبات ب FoMV-LES22. يحمل FoMV-LES22 إدراج 329 نقطة أساس من CDS 3 'من الآفة تحاكي 22 جين الذرة في الاتجاه المضاد للإحساس. يؤدي إسكات الصوت إلى تراكم مستقلب سام والذي بدوره يسبب الآفات الميتة التي تظهر لأول مرة على شكل خطوط على طول الأوعية الدموية وتنمو إلى بقع أكبر كما هو موضح هنا. (ب) ورقة تم تصويرها بسرعة 17 نقطة في البوصة بعد حقن النبات ب FoMV-PDS. يحمل FoMV-PDS إدراج زوج أساسي 313 من CDS 3 'من جين الذرة الرفيعة phytoene desaturase في الاتجاه المضاد للإحساس. يؤدي إسكات pds في الذرة إلى نمط ظاهري للتبييض الضوئي الجهازي يبدأ على شكل خطوط صغيرة ورقيقة على طول الأوعية الدموية التي تنمو إلى خطوط أطول على طول الورقة كما هو موضح هنا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: qRT-PCR للنباتات التي يتم حقنها بتركيبات إسكات الجينات FoMV. تأكيد عدوى FoMV الجهازية وإسكات الجينات الناجمة عن تركيبات FoMV-LES22 و FoMV-PDS التي يتم تسليمها عن طريق الحقن الزراعي في نباتات الذرة الحلوة (Golden x Bantam). (أ) تظهر الصور الهلامية تحليلات RT-PCR تؤكد وجود متجه فارغ FoMV-MCS1* (315 مضخم للفرسان) و FoMV-PDS (625 مضخم للثنايا) في الورقة 6 من خمسة نباتات فردية. تنتج الاشعال PCR المستخدمة أمبليكون يمتد عبر MCS1*. يعمل الأمبليكون الأكتين الجيني للذرة (Zm-Actin) كجين مرجعي. يمثل الرسم البياني الشريطي قيم التعبير النسبي qRT-PCR لتعبير pds في الورقة 6 في 37 يوما بعد التلقيح (DPI) عن طريق الحقن الزراعي باستخدام FoMV-MCS1* أو FoMV-PDS. يمكن اكتشاف قمع pds في كل من النسخ المتماثلة البيولوجية الخمسة (p = 0.003 ؛ اختبار Dunnett اللاحق ؛ تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (SD) لثلاثة نسخ متماثلة تقنية). (ب) تظهر الصور الهلامية تحليلات RT-PCR التي تؤكد وجود FoMV-MCS1* (315 مضخم للفرسان) في الورقة 6 من خمسة نباتات فردية. تم الكشف عن FoMV-LES22 (625 bp amplicon) في أنسجة الورقة 6 (عينات FoMV-LES22 1-5 ، 38 DPI) والورقة 4 (عينات FoMV-LES22 6-10 ، 20 DPI) لعشرة نباتات فردية. كان أمبليكون Zm-Actin بمثابة الجين المرجعي. يمثل الرسم البياني الشريطي قيم التعبير النسبي qRT-PCR لتعبير les22 في أنسجة الذرة عن طريق الحقن الزراعي للتركيبات الفيروسية FoMV-MCS1* أو FoMV-LES22. يحدث قمع Les22 في 9 من 10 نسخ بيولوجية (p = < 0.0001 ؛ اختبار دونيت المخصص ؛ تشير أشرطة الخطأ إلى SD لثلاث نسخ متماثلة فنية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. الأنماط الظاهرية للبنى المختلفة المستخدمة في تجارب الحقن الزراعي. تم حقن جميع النباتات المصورة عندما كان عمرها 6-7 أيام مع سلالة Agrobacterium GV3101 التي تحمل الهياكل المشار إليها. تم التقاط الصور بسرعة 16 نقطة في البوصة. (أ) أعراض أوراق pCAMBIA1380 (العمود الفقري البلازميدي الفارغ) ، FoMV-EV ، FoMV-GFP ، و SCMV-GFP في الضوء المرئي ، تحت مرشح الكلوروفيل FluorCam عند التعرض 250 ميكروثانية ، وتحت مرشح FluorCam GFP عند التعرض 10 مللي ثانية. (ب) صور الفحص المجهري الفلوري لأوراق النباتات المعالجة بالوهمية (التي يتم حقنها بمحلول MgSO4 فقط) و FoMV-EV و FoMV-GFP المحقونة. يتم عرض قنوات DIC و DsRed و EGFP وتم التقاط كل منها عند التعرض ل 1500 مللي ثانية. شريط المقياس هو 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7. الآثار المورفولوجية للحقن. مثال على الآثار المورفولوجية الأكثر حدة التي يمكن أن تحدث من الحقن المباشر في الأنسجة المريستماتيكية. يمكن أن تؤدي هذه الإصابة إلى "تمزيق" الأوراق وتقسيم الجذع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| فيروس | ظروف النمو | الجيني | # النباتات المصابة | مجموع عدد النباتات | ٪ العدوى | متوسط نسبة العدوى |
| فومف-EV | غرفة النمو | الذرة الحلوة | 22 | 23 | 96% | 97% |
| ب٧٣ | 18 | 18 | 100% | |||
| ب١٠٤ | 20 | 21 | 95% | |||
| غازات الدفيئه | الذرة الحلوة | 20 | 23 | 87% | 89% | |
| ب٧٣ | 17 | 18 | 94% | |||
| ب١٠٤ | 16 | 19 | 84% | |||
| SCMV-EV | غرفة النمو | الذرة الحلوة | 14 | 21 | 67% | 47% |
| ب٧٣ | 5 | 18 | 28% | |||
| ب١٠٤ | 10 | 21 | 48% | |||
| غازات الدفيئه | الذرة الحلوة | 14 | 23 | 61% | 49% | |
| ب٧٣ | 0 | 19 | 0% | |||
| ب١٠٤ | 19 | 22 | 86% |
الجدول 1: تأثير الدفيئة وظروف غرفة النمو على كفاءة التلقيح بالحقن الزراعي. تم إنبات البذور في ظل ظروف نمو متطابقة. تم حقن الشتلات المنبتة ونصفها إلى غرفة نمو (25 درجة مئوية 16 ساعة ضوء النهار / 22 درجة مئوية 8 ساعات ليلا ؛ 185 PAR) وتم نقل النصف الآخر إلى دفيئة (22-25 درجة مئوية 16 ساعة ضوء النهار / 22-25 درجة مئوية 8 ساعات ليلا ؛ 350-400 PAR). ويورد هذا الجدول معدل الإصابة كنسبة مئوية، محسوبة من عدد النباتات التي أكدت RT-PCR إصابتها بالفيروس المعني مقسوما على العدد الإجمالي للنباتات المحقونة بالزراعة. لا يوجد فرق إحصائي في كفاءة العدوى بين غرفة النمو وظروف الدفيئة (FoMV اثنين من الذيل t-test p=0.08; SCMV اثنين من الذيل t-test p = 0.96).
| النمط الوراثي للذرة | فومف-EV | فومفي-ليس22 | المجموع المجمع | ||||
| المصابه | مجموع | ٪ مصاب | المصابه | مجموع | ٪ مصاب | ٪ مصاب | |
| الذرة الحلوة | 18 | 23 | 78% | 15 | 23 | 65% | 72% |
| MO47 | 7 | 22 | 32% | 1 | 21 | 5% | 19% |
| كيه 55 | 1 | 15 | 7% | 3 | 17 | 18% | 13% |
| W64A | 10 | 22 | 45% | 8 | 20 | 40% | 43% |
| MO17 | 0 | 16 | 0% | 0 | 13 | 0% | 0% |
| ب٧٣ | 10 | 18 | 56% | 7 | 17 | 41% | 49% |
| ب١٠١ | 12 | 21 | 57% | 8 | 24 | 33% | 44% |
| FR1064 | 4 | 4 | 100% | 4 | 4 | 100% | 100% |
| ب١٠٤ | 10 | 22 | 45% | 5 | 21 | 24% | 35% |
| WCC22 | 2 | 7 | 29% | 4 | 6 | 67% | 46% |
| ايه 188 | 0 | 3 | 0% | 4 | 6 | 67% | 44% |
الجدول 2: كفاءة العدوى في بنى FoMV عبر الأنماط الوراثية للذرة. تم حقن FoMV-EV و FoMV-LES22 في 11 نمطا وراثيا من الذرة. بعد الحقن ، تم نقل الشتلات إلى الدفيئة. يفصل هذا الجدول معدل الإصابة كنسبة مئوية، محسوبة من عدد النباتات المصابة ب FoMV كما هو مؤكد بواسطة RT-PCR مقسوما على العدد الإجمالي للنباتات المحقونة بالزراعة. ويظهر المعدل الإجمالي المجمع للعدوى متوسط معدلات الإصابة لكل نمط وراثي لكل من بنيات FoMV التي تم اختبارها.
| مرحلة النبات | نباتات عمرها 4-5 أيام | نباتات عمرها 6-7 أيام | المجموع المجمع | ||||
| عَرَضي | مجموع النباتات | ٪ مصاب | عَرَضي | مجموع النباتات | ٪ مصاب | ٪ مصاب | |
| فومف-EV | 42 | 72 | 58% | 80 | 170 | 47% | 53٪ (أ) |
| FoMV-PDS | 65 | 157 | 41% | 66 | 184 | 36% | 39٪ (ب ج) |
| فومفي-ليس22 | 115 | 195 | 59% | 144 | 292 | 49% | 54٪ (أ ب) |
| FoMV-GFP | 16 | 103 | 16% | 37 | 217 | 17% | 16٪ (C) |
| SCMV-GFP | 10 | 95 | 11% | 5 | 82 | 6% | 8٪ (ج) |
الجدول 3: ملخص تجارب الحقن. يمثل هذا الجدول ملخصا لتجارب الحقن التي أجريت من أغسطس 2017 إلى أغسطس 2018 على شتلات الذرة الحلوة Golden Bantam. تم تقييم النباتات بحثا عن الأعراض الفيروسية (FoMV-EV) أو إسكات الأعراض (pds و les22) أو تألق GFP (GFP) من خلال الفحص البصري (FoMV-EV و FoMV-PDS و FoMV-LES22) أو FluorCam (FoMV-GFP و SCMV-GFP). يتم عرض النتائج بشكل فردي للنباتات التي يبلغ عمرها 4-5 أيام والنباتات التي يبلغ عمرها 6-7 أيام ، بالإضافة إلى ملخص عبر جميع الأعمار النباتية. لا يوجد فرق كبير بين النباتات التي يبلغ عمرها 4-5 أيام والنباتات القديمة 6-7 أيام (ANOVA أحادية الاتجاه ، F = 0.6513). تم العثور على فرق بين البنية الفيروسية (Onaway ANOVA ، F = <0.0001) ، مع الحروف التي تمثل تقرير رسائل ربط Tukey-Kramer HSD.
الجدول التكميلي 1: جدول يسرد جميع أسماء التمهيدي والتسلسلات المستخدمة في هذا البروتوكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول التكميلي 2: اختبار الأسيتوسينغون. (أ) اختبار الأسيتوسيرينجون الأولي ، مقارنة معدلات أعراض النباتات الوهمية ، FoMV-EV ، و FoMV-LES22 المحقونة بين معلقات التلقيح مع 200 μM acetosyringone (+) أو بدون acetosyringone (-). (ب) مقارنة معدلات الإصابة ب FoMV-LES22 على النحو الذي تحدده RT-PCR بين معلقات التلقيح بدون acetosyringone (-) ، مع 200 μM acetosyringone (+) ، وإضافة 20 μM من acetosyringone إلى الثقافة البكتيرية قبل 4 ساعات من إعادة التعليق في المخزن المؤقت إلى جانب إضافة 200 uM acetosyringone إلى التعليق النهائي (++). بشكل عام ، لم يكن هناك فرق كبير بين علاجات aceotysyringone (Oneway ANOVA ، f = 0.5452). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الشكل التكميلي 1: التصوير الفلوري والتحقق الجزيئي من SCMV المحقون بالزراعة والتعبير عن البروتينات غير المتجانسة في الذرة. تم حقن الذرة زراعيا ببنية SCMV معدلة تحتوي على كل من CDSs من GFP و nano luciferase (NLuc). (أ) استخدم التصوير الفلوركامي لفحص وكشف GFP. اليسار هو نبات حقن وهمي واليمين هو SCMV-NLucGFP حقن النبات. (ب) تم فصل مستخلصات بروتين الأوراق بواسطة SDS-PAGE وتم تقييمها لوجود بروتين معطف NLuc و GFP و SCMV (CP) بواسطة فحص لوسيفيراز داخل الهلام أو لطخة مناعية كما هو موضح. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
Agrobacterium هي أداة أساسية تسهل العديد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية في البحوث المتعلقة بالنبات. توفر هذه الدراسة بروتوكول حقن زراعي لتلقيح ناقلات الفيروسات FoMV و SCMV مباشرة في أنسجة الذرة لتطبيقات VIGS و VOX. والهدف الرئيسي هو زيادة سهولة وفائدة التكنولوجيات القائمة على الفيروسات لأغراض البحث في نباتات المحاصيل الأحادية الوط. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن التلقيح الزراعي المباشر للذرة لعدد قليل من الفيروسات ، إلا أن المؤلفين ليسوا على دراية ببروتوكول مفصل ، ولا توجد أمثلة على تطبيقات VIGS و VOX في تلك الدراسات19,22.
وقد أفيد ، وتم تأكيده أثناء تطوير هذا البروتوكول ، أن موقع الحقن هو عامل رئيسي لإطلاق عدوى فيروسية جهازية بنجاح عن طريق الحقن الزراعي 19. يفترض أن يكون حقن الموقع الموصى به باستمرار على النبات هو أكبر متغير ، لأن الموقع الدقيق لل meristem في شتلات الذرة لا يمكن اكتشافه بالعين تقريبا. لتقليل التباين بين الأشخاص ، يوصى بتشريح عدد قليل من شتلات الذرة وصولا إلى meristem لتصور موقعها بشكل أفضل (الشكل 3C). يجب أن يكون موقف meristem فيما يتعلق بعقدة coleoptilar هو نفسه تقريبا بالنسبة للنباتات التي يتراوح عمرها بين 4-7 أيام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ممارسة الحقن بسائل مصبوغ يوفر دليلا مرئيا بسهولة على كيفية ملء "اللقاح" لأزيز الورقة ، ولأن موقع الحقن مميز بالصبغة ، يمكن تأكيد دقة موقع الحقن (الشكل 3G ، H). الأنسجة المريستماتيكية هي الأكثر عرضة للحقن الزراعي ، ولكن حقن معلقات Agrobacterium مباشرة في هذا النسيج يؤدي إلى تأثيرات مورفولوجية غير مرغوب فيها (الشكل 6)19. تبقى النباتات ذات الميريستيم التالفة على قيد الحياة ، ولكن العيوب الناتجة غير مرغوب فيها ، وبالتالي ، يجب تجنب الحقن المباشر لهذا الأنسجة.
هناك العديد من المتغيرات التي قد تؤثر على الإطلاق الناجح للعدوى الفيروسية الجهازية عن طريق الحقن الزراعي لأن ثلاثة أنظمة بيولوجية معقدة (النبات والفيروس وسلالة Agrobacterium) يجب أن تتفاعل بتنسيق. ويمكن أن يساعد على هذا التفاعل المعقد الخلايا سريعة الانقسام في المنطقة الميرستيماتية، مما يجعلها موقعا مثاليا للتلقيح الزراعي19. يجب أن تكون سلالة Agrobacterium قادرة على إصابة خلايا الأنسجة النباتية لتوصيل الحمض النووي T الذي يحمل الجينوم الفيروسي ، ويجب أن يكون النبات عرضة للفيروس من أجل بدء التكاثر الفيروسي والعدوى الجهازية. تختلف الأنماط الجينية للذرة في قابليتها للفيروسات (على سبيل المثال ، Mo17 مقاوم ل FoMV) أو سلالات Agrobacterium ، ولكن يبدو أن الغالبية التي تم اختبارها عرضة لكل من FoMV و SCMV (الجدول 1 والجدول 2)53. على سبيل المثال ، قد يكون الخط الداخلي FR1064 وصنف الذرة الحلوة Golden Bantam عرضة بشكل خاص لكل من GV3101 Agrobacterium والمتجهات القائمة على FoMV.
يعد رقم الورقة التي تم أخذ عينات منها وتوقيت أخذ العينات ل RT-PCR أمرا بالغ الأهمية لإجراء تقييم دقيق للعدوى الفيروسية. في الأمثلة الموضحة هنا ، تم تحديد رقم الورقة من خلال البدء من الورقة الأولى المستديرة (المعروفة باسم "ورقة الإبهام") والعد لأعلى. تم أخذ عينات من الأوراق بمجرد توسيعها وبدأت الورقة التالية في الظهور. ومع ذلك ، قد تختلف الأوراق المثلى لأخذ العينات بناء على أنواع الفيروسات المستخدمة ، وظروف النمو ، والنمط الجيني للذرة. لذلك ، يوصى بإجراء تجربة دورة زمنية أولية عند تطبيق هذا البروتوكول على نظام فيروسات جديد لتحسين استراتيجية أخذ العينات فيما يتعلق بالإجازات والتوقيت.
يؤثر البناء المحدد المستخدم بشكل كبير على كفاءة هذا البروتوكول. على سبيل المثال، فإن المتجهات الفارغة، FoMV-EV و SCMV-EV، و FoMV-PDS و FoMV-LES22، وكلاهما يحتوي على إدخالات صغيرة (313 نقطة أساس و 329 نقطة أساس، على التوالي)، تنتج عادة أعلى النسب المئوية للنباتات ذات الأعراض الفيروسية في هذه التجارب (الجدولان 1 والجدول 2). ومع ذلك، فإن الفيروسات المؤتلفة التي تحمل إدخالات أكبر من GFP ORF (720 نقطة أساس) في FoMV-GFP و SCMV-GFP، لديها معدلات إصابة أقل بكثير بالمقارنة مع النباتات التي يتم حقنها بالناقل الفارغ أو هياكل إسكات الجينات. قد يكون هذا الاتجاه بسبب الآثار السلبية على اللياقة الفيروسية الناجمة عن زيادة كميات المواد الوراثية الخارجية في الجينوم الفيروسي. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن استقرار إدراج النواقل الفيروسية النباتية يعتمد إلى حد كبير على حجم الإدراج وتسلسله36,54,55,56,57. بالإضافة إلى ذلك، كان هناك اختلاف ملحوظ في النسبة المئوية للنباتات التي تصاب بالعدوى بعد التلقيح إما بناقل FoMV أو SCMV الفارغ، مما يشير إلى الحاجة إلى عمل إضافي لتحسين هذا البروتوكول ل SCMV (الجدول 1). تشير هذه النتائج إلى أنه قد تكون هناك حاجة إلى بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها عند تطوير بنية ، لأن تسلسل وطول الجزء يمكن أن يؤثرا على الكفاءة.
بشكل عام ، أظهرت هذه الدراسة أن الحقن الزراعي لشتلات الذرة هو طريقة تلقيح فعالة لفيروسين مختلفين من فيروسات نبات الحمض النووي الريبي ، وتكوينات ناقلات متعددة ، و 11 نمطا وراثيا للذرة. يشير هذا العمل مع FoMV و SCMV ، مقترنا بالأعمال السابقة التي تستخدم الحقن مع فيروس مرقش كلوروتيك الذرة (MCMV) أو MSV ، إلى أن الحقن الزراعي مناسب لتلقيح شتلات الذرة بنسخ معدية من كل من فيروسات الحمض النووي الريبي والحمض النووي19،20،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر هذا العمل أيضا أن الحقن الزراعي هو طريقة قابلة للتطبيق لناقلات VIGS و VOX ويمكن تطبيقه على النباتات التي لا يتجاوز عمرها أربعة أيام (الجدول 3). ومن المتوقع أن يتم تكييف البروتوكول المعروض هنا بسهولة من قبل علماء أحياء الذرة لتسهيل البحث في دراسات علم الجينوم الوظيفية التي تنطوي على إسكات الجينات العابرة (VIGS) والإفراط في التعبير (VOX). كما أن الحقن الزراعي لديه القدرة على تسهيل نهج تحرير الجينات القائمة على الفيروسات (VEdGE) التي كانت ستكون محدودة بخلاف ذلك بسبب الاعتماد على تحويل النبات ، مما قد يؤدي إلى تحسين كفاءة التحرير وكذلك إمكانية الوصول إليها58،59،60. وبالنظر إلى أن سلالة Agrobacterium المناسبة، والأنماط الجينية للذرة، والنواقل الفيروسية يتم دمجها بعناية، فمن المتوقع أن يصبح التلقيح عن طريق الحقن الزراعي أداة قيمة لتحليل وظائف الجينات العابرة في الذرة.
Disclosures
ليس لدى الباحثين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
جامعة ولاية أيوا هي جزء من فريق يدعم برنامج حلفاء الحشرات في DARPA HR0011-17-2-0053. تم دعم هذا العمل أيضا من قبل معهد علوم النبات بجامعة ولاية أيوا ، ومركز الهندسة الحيوية للمحاصيل بجامعة ولاية أيوا ، ومشروع NIFA Hatch التابع لوزارة الزراعة الأمريكية رقم 3808 ، وصناديق ولاية أيوا. كما تم دعم K.L.H. جزئيا من قبل برنامج تدريب الخريجين على الظواهر النباتية التنبؤية بجامعة ولاية أيوا بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم (DGE #1545453) ومنحة مبادرة البحوث الزراعية والغذائية رقم 2019-07318 من المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها وتفسيرها وفي كتابة المخطوطة. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر الممولين.
نشكر لوتر (USDA-ARS ، Ames ، IA) على بذور الخطوط المزروعة بالذرة ، وكريستيان ف. مونتيس سيري (جامعة ولاية أيوا) على صنع استنساخ FoMV-GFP ، وتايلر أوستن (جامعة ولاية أيوا) للمساعدة التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
| 15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
| 1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
| 25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| 28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
| 37°C Incubator | For E. coli | ||
| Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
| Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
| Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
| cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
| DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
| DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
| EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
| Ethanol | For RNA extraction | ||
| Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
| Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
| Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
| FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
| Fluorescence Microscope | |||
| Gel Electrophoresis Box | |||
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
| Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
| Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
| Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
| Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
| Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
| Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
| Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
| MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
| PacI | New England Biolabs | R0547 | |
| Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
| Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
| pH Meter | |||
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
| Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
| PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
| Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
| Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
| SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
| Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
| Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
| Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
| Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Thermocycler | For PCR | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
| Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
| Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| XbaI | New England Biolabs | R0145 |
References
- Zaidi, S. E. A., Mansoor, S. Viral vectors for plant genome engineering. Frontiers in Plant Science. 8, 539 (2017).
- Kant, R., Dasgupta, I. Gene silencing approaches through virus-based vectors: speeding up functional genomics in monocots. Plant Molecular Biology. 100, 3-18 (2019).
- Hu, J., et al. A barley stripe mosaic virus-based guide RNA delivery system for targeted mutagenesis in wheat and maize. Molecular Plant Pathology. 20 (10), 1463-1474 (2019).
- Pasin, F., Menzel, W., Daròs, J. A. Harnessed viruses in the age of metagenomics and synthetic biology: an update on infectious clone assembly and biotechnologies of plant viruses. Plant Biotechnology Journal. 17 (6), 1010-1026 (2019).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B. Plant virus vectors 3.0: Transitioning into synthetic genomics. Annual Review of Phytopathology. 57 (1), 211-230 (2019).
- Mei, Y., et al. Protein expression and gene editing in monocots using foxtail mosaic virus vectors. Plant Direct. 3 (11), 00181 (2019).
- Ruiz, M. T., Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell. 10 (6), 937-946 (1998).
- Bekele, D., Tesfaye, K., Fikre, A. Applications of virus induced gene silencing (VIGS) in plant functional genomics studies. Journal of Plant Biochemistry & Physiology. 07 (01), 1000229 (2019).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Jackson, A. O. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annual Review of Phytopathology. 34 (1), 299-323 (1996).
- Holzberg, S., Brosio, P., Gross, C., Pogue, G. P. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. Plant Journal. 30 (3), 315-327 (2002).
- Wang, R., et al. An efficient virus-induced gene silencing vector for maize functional genomics research. Plant Journal. 86 (1), 102-115 (2016).
- Redinbaugh, M. G., et al. Transmission of viral RNA and DNA to maize kernels by vascular puncture inoculation. Journal of Virological Methods. 98 (2), 135-143 (2001).
- Scholthof, H. B. The capsid protein gene of tomato bushy stunt virus is dispensable for systemic movement and can be replaced for localized expression of foreign genes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6 (3), 309 (1993).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Kikkert, M., Jackson, A. O. Tomato bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function in cell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion. Virology. 213 (2), 425-438 (1995).
- Scholthof, H. B. Rapid delivery of foreign genes into plants by direct rub-inoculation with intact plasmid dna of a tomato bushy stunt virus gene vector. Journal of Virology. 73 (9), 7823-7829 (1999).
- Zhang, J., et al. Vacuum and co-cultivation agroinfiltration of (germinated) seeds results in tobacco rattle virus (TRV) mediated whole-plant virus-induced gene silencing (VIGS) in wheat and maize. Frontiers in Plant Science. 8, 393 (2017).
- Vaghchhipawala, Z., Rojas, C. M., Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Agroinoculation and agroinfiltration: simple tools for complex gene function analyses. Methods in Molecular Biology. 678, Clifton, N.J. 65-76 (2011).
- Grimsley, N., Hohn, B., Hohn, T., Walden, R. "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83 (10), 3282-3286 (1986).
- Grimsley, N. H., Ramos, C., Hein, T., Hohn, B. Merisfematic tissues of maize plants are most suscepnsle to agroinfection with maize streak virus. Bio/Technology. 6 (2), 185-189 (1988).
- Martin, D. P., Rybicki, E. P. Improved efficiency of Zea mays agroinoculation with Maize streak virus. Plant Disease. 84 (10), 1096 (2000).
- Martin, D. P., Willment, J. A., Rybicki, E. P. Evaluation of maize streak virus pathogenicity in differentially resistant Zea mays genotypes. Phytopathology. 89 (8), 695-700 (1999).
- Wang, Q., et al. Further characterization of Maize chlorotic mottle virus and its synergistic interaction with Sugarcane mosaic virus in maize. Scientific Reports. 7, 39960 (2017).
- Hsieh, M. H., et al. Optimizing virus-induced gene silencing efficiency with Cymbidium mosaic virus in Phalaenopsis flower. Plant Science. 201-202 (1), 25-41 (2013).
- Hsieh, M. H., et al. Virus-induced gene silencing unravels multiple transcription factors involved in floral growth and development in Phalaenopsis orchids. Journal of Experimental Botany. 64 (12), 3869-3884 (2013).
- Zenna, N. S., et al. Genetic analysis of tolerance to rice tungro bacilliform virus in rice (Oryza sativa L.) through agroinoculation. Journal of Phytopathology. 154 (4), 197-203 (2006).
- Marks, M. S., Kemp, J. M., Woolston, C. J., Dale, P. J. Agroinfection of wheat: A comparison of Agrobacterium strains. Plant Science. 63 (2), 247-256 (1989).
- Dasgupta, I., et al. Rice tungro bacilliform virus DNA independently infects rice after Agrobacterium-mediated transfer. Journal of General Virology. 72 (6), 1215-1221 (1991).
- Boulton, M. I., Buchholz, W. G., Marks, M. S., Markham, P. G., Davies, J. W. Specificity of Agrobacterium-mediated delivery of maize streak virus DNA to members of the Gramineae. Plant Molecular Biology. 12 (1), 31-40 (1989).
- Paulsen, A. Q. Purification and properties of foxtail mosaic virus. Phytopathology. 77 (11), 1346 (1977).
- Bancroft, J. B., Rouleau, M., Johnston, R., Prins, L., Mackie, G. A. The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA. Journal of General Virology. 72 (9), 2173-2181 (1991).
- Bruun-Rasmussen, M., Madsen, C. T., Johansen, E., Albrechtsen, M. Revised sequence of foxtail mosaic virus reveals a triple gene block structure similar to potato virus X. Archives of Virology. 153 (1), 223-226 (2008).
- Rouleau, M., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Partial purification and characterization of foxtail mosaic potexvirus RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 197 (2), 695-703 (1993).
- Rouleau, M., Smith, R. J., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology. 204 (1), 254-265 (1994).
- Samuels, T. D., et al. Subcellular targeting and interactions among the potato virus X TGB proteins. Virology. 367 (2), 375-389 (2007).
- Cho, S. Y., Kim, K. H. Identification of the capsid protein-binding region of the SL1(+) RNA located at the 5' region of the potato virus X genome. Plant Pathology Journal. 28 (1), 75-80 (2012).
- Mei, Y., Zhang, C., Kernodle, B. M., Hill, J. H., Whitham, S. A. A foxtail mosaic virus vector for virus-induced gene silencing in maize. Plant Physiology. 171 (2), 760-772 (2016).
- Bouton, C., et al. Foxtail mosaic virus: A viral vector for protein expression in cereals. Plant Physiology. 177 (4), 1352-1367 (2018).
- Mei, Y., Liu, G., Zhang, C., Hill, J. H., Whitham, S. A. A sugarcane mosaic virus vector for gene expression in maize. Plant Direct. 3 (8), 00158 (2019).
- Gal-On, A., Meiri, E., Huet, H., Hua, W. J., Raccah, B., Gaba, V. Particle bombardment drastically increases the infectivity of cloned DNA of zucchini yellow mosaic potyvirus. Journal of General Virology. 76 (12), (1995).
- Gao, R., et al. Construction of an infectious cDNA clone and gene expression vector of Tobacco vein banding mosaic virus (genus Potyvirus). Virus Research. 169 (1), 276-281 (2012).
- López-Moya, J. J., García, J. A. Construction of a stable and highly infectious intron-containing cDNA clone of plum pox potyvirus and its use to infect plants by particle bombardment. Virus Research. 68 (2), (2000).
- Choi, I. R., French, R., Hein, G. L., Stenger, D. C. Fully biologically active in vitro transcripts of the eriophyid mite-transmitted wheat streak mosaic tritimovirus. Phytopathology. 89 (12), (1999).
- Kim, K. S., et al. Infectivity of in vitro transcripts of Johnsongrass mosaic potyvirus full-length cDNA clones in maize and sorghum. Archives of Virology. 148 (3), 563-574 (2003).
- Stewart, L. R., Bouchard, R., Redinbaugh, M. G., Meulia, T. Complete sequence and development of a full-length infectious clone of an Ohio isolate of Maize dwarf mosaic virus (MDMV). Virus Research. 165 (2), 219-224 (2012).
- Wylie, S. J., et al. ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae. Journal of General Virology. 98 (3), 352-354 (2017).
- Shukla, D. D. taxonomy of potyviruses infecting maize, sorghum, and sugarcane in Australia and the United States as determined by reactivities of polyclonal antibodies directed towards virus-specific N-termini of coat proteins. Phytopathology. 79 (2), 223 (1989).
- Shukla, D. D., Ward, C. W. Amino Acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group. Journal of General Virology. 69 (11), 2703-2710 (1988).
- Chung, B. Y. W., Miller, W. A., Atkins, J. F., Firth, A. E. An overlapping essential gene in the Potyviridae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (15), 5897-5902 (2008).
- Jarchow, E., Grimsley, N. H., Hohn, B. virF, the host-range-determining virulence gene of Agrobacterium tumefaciens, affects T-DNA transfer to Zea mays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (23), 10426-10430 (1991).
- Hu, G., Yalpani, N., Briggs, S. P., Johal, G. S. A porphyrin pathway impairment is responsible for the phenotype of a dominant disease lesion mimic mutant of maize. The Plant Cell. 10 (7), 1095 (2007).
- Qin, G., et al. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell Research. 17 (5), 471-482 (2007).
- Jones, P. Isolation of plasmid DNA from E. coli. Encyclopedia of Life Sciences. , (2003).
- Ji, Q., Yang, B., Lee, M., Chen, Y., Lübberstedt, T. Mapping of quantitative trait loci/locus conferring resistance to foxtail mosaic virus in maize using the intermated B73-×-Mo17 population. Plant Breeding. 129 (6), 721-723 (2010).
- Pacak, A., et al. The brome mosaic virus-based recombination vector triggers a limited gene silencing response depending on the orientation of the inserted sequence. Archives of Virology. 155 (2), 169-179 (2010).
- Miché, L., Battistoni, F., Gemmer, S., Belghazi, M., Reinhold-Hurek, B. Host-dependent expression of Rhizobium leguminosarum bv. viciae hydrogenase is controlled at transcriptional and post-transcriptional levels in legume nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (5), 1323-1331 (2018).
- Yamagishi, M., Masuta, C., Suzuki, M., Netsu, O. Peanut stunt virus-induced gene silencing in white lupin (lupinus albus). Plant Biotechnology. 32 (3), 181-191 (2015).
- Avesani, L., et al. Stability of Potato virus X expression vectors is related to insert size: Implications for replication models and risk assessment. Transgenic Research. 16 (5), 587-597 (2007).
- Ali, Z., et al. Efficient virus-mediated genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (8), 1288-1291 (2015).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B., Mirkov, T. E. Multiplexed gene editing and protein overexpression using a tobacco mosaic virus viral vector. Plant Physiology. 175 (1), 23-35 (2017).
- Ali, Z., Eid, A., Ali, S., Mahfouz, M. M. Pea early-browning virus-mediated genome editing via the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis. Virus Research. 244, 333-337 (2018).
