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Article de méthode

Un test métrique pour évaluer la mémoire de travail spatiale chez les rats adultes après une lésion cérébrale traumatique

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DOI :

10.3791/62291

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7 mai 2021

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1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Mayo Clinic, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine, Dnepropetrovsk State University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les lésions cérébrales traumatiques (TCC) sont généralement associées à des troubles de la mémoire. Ici, nous présentons un protocole pour évaluer la mémoire de travail spatiale après un TCC via une tâche métrique. Un test métrique est un outil utile pour étudier les troubles de la mémoire de travail spatiale après un TCC.

Résumé

Les troubles de la mémoire sensorielle, à court terme et à long terme sont des effets secondaires courants après une lésion cérébrale traumatique (TCC). En raison des limites éthiques des études humaines, les modèles animaux offrent des alternatives appropriées pour tester les méthodes de traitement et étudier les mécanismes et les complications connexes de la maladie. Les modèles expérimentaux de rongeurs ont toujours été les plus largement utilisés en raison de leur accessibilité, de leur faible coût, de leur reproductibilité et de leurs approches validées. Un test métrique, qui teste la capacité de se souvenir du placement de deux objets à différentes distances et angles l’un de l’autre, est une technique permettant d’étudier la déficience de la mémoire de travail spatiale (SWM) après un TCC. Les avantages significatifs des tâches métriques incluent la possibilité d’observation dynamique, le faible coût, la reproductibilité, la facilité relative de mise en œuvre et un environnement à faible stress. Ici, nous présentons un protocole de test métrique pour mesurer l’altération de la SWM chez les rats adultes après un TCC. Ce test fournit un moyen réalisable d’évaluer plus efficacement la physiologie et la physiopathologie du fonctionnement du cerveau.

Introduction

La prévalence des déficits neurologiques tels que l’attention, la fonction exécutive et certains déficits de mémoire après une lésion cérébrale traumatique modérée (TCC) est supérieure à 50%1,2,3,4,5,6,7,8. Le TCC peut entraîner de graves déficiences de la mémoire spatiale à court terme, à long terme et de travail9. Ces troubles de la mémoire ont été observés dans des modèles de rongeurs de TCC. Les modèles de rongeurs ont permis le développement de techniques pour tester la mémoire, permettant des examens plus approfondis de l’effet du TCC sur le traitement de la mémoire dans les systèmes de mémoire neuronale.

Deux tests, liés respectivement au traitement de l’information spatiale topologique et métrique, aident à mesurer la mémoire de travail spatiale (SWM). Le test topologique dépend de la modification de la taille de l’espace environnemental ou des espaces connexes de connexion ou d’enceinte autour d’un objet, tandis que le test métrique évalue les changements d’angles ou de distance entre les objets10,11. Goodrich-Hunsaker et al. ont d’abord adapté le test topologique humain pour les rats10 et ont appliqué la tâche métrique pour dissocier les rôles du cortex pariétal (PC) et de l’hippocampe dorsal dans le traitement de l’information spatiale11. De même, Gurkoff et ses collègues ont évalué les tâches de mémoire métriques, topologiques et temporelles après une lésion de percussion du fluide latéral9. Il existe une corrélation entre les dommages causés à certaines régions du cerveau et l’altération de la mémoire métrique ou topologique. Il a été suggéré que les troubles de la mémoire métrique sont liés à des lésions dans le gyrus denté dorsal bilatéral et la sous-région CA3 de cornu ammonis (CA) de l’hippocampe, et que les troubles de la mémoire topologique sont liés à des lésions bilatérales du cortex pariétal10,12.

Le but de ce protocole est d’évaluer le déficit de mémoire spatiale dans une population de rats via une tâche métrique. Cette méthode est une alternative appropriée pour étudier les mécanismes de SWM après une lésion cérébrale, et ses avantages comprennent la facilité relative de mise en œuvre, une sensibilité élevée, un faible coût de reproductibilité, la possibilité d’observation dynamique et un environnement peu stressant. Comparé à d’autres tâches comportementales telles que le labyrinthe de Barnes13,14, la tâche de navigation nautique Morris15,16,17, ou les tâches de labyrinthe spatial18,19, ce test métrique est moins compliqué. En raison de sa facilité de mise en œuvre, le test métrique nécessite une période d’entraînement plus courte et moins stressante et se déroule sur seulement 2 jours9: 1 jour pour l’accoutumance et 1 jour pour la tâche. De plus, le test que nous proposons est plus facile à effectuer que d’autres tests à faible contrainte, tels que la tâche de reconnaissance d’objets nouveaux (NOR), et ne nécessite pas le jour supplémentaire d’accoutumant20.

Cet article fournit un modèle simple pour évaluer la SWM après une lésion cérébrale. Cette évaluation de la SWM post-TCC peut aider à une étude plus complète de sa physiopathologie.

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Protocole

Les expériences ont été réalisées conformément aux recommandations des déclarations d’Helsinki et de Tokyo et des lignes directrices pour l’utilisation des animaux d’expérimentation de la Communauté européenne. Les expériences ont été approuvées par le Comité de soins aux animaux de l’Université Ben Gourion du Néguev. Une chronologie du protocole est illustrée à la figure 1.

1. Interventions chirurgicales et TCC à percussion fluide

  1. Sélectionnez des rats Sprague-Dawley adultes mâles et femelles, logés à une température ambiante de 22 ± 1 °C et à une humidité de 40 % à 60 %, avec des cycles lumière-obscurité de 12 à 12 h.
  2. Fournir de la nourriture sous forme de chow et d’eau ad libitum. Effectuer des expériences entre les heures du matin, c’est-à-dire 6h00.m et 12h00.m.
  3. Effectuer une évaluation neurologique de base pour les groupes témoin et TCC avant le début de l’expérience (voir rubrique 2 ci-dessous).
  4. Anesthésier les rats avec de l’isoflurane inhalé à 4% pour l’induction et 1,5% pour le maintien de l’anesthésie. Assurez-vous que le rat est immobilisé en testant le réflexe ou le mouvement de la pédale en réponse à un irritant.
    REMARQUE: Utilisez un système d’administration continue d’isoflurane pour l’anesthésie. Effectuer toutes les procédures dans des conditions aseptiques.
  5. Effectuer une lésion paragittale fluide-percussion comme décrit précédemment21,22.
  6. Injecter par voie sous-cutanée 0,2 mL de bupivacaïne à 0,5 % le long du site d’incision potentiel, avant l’incision. ransfer le rat à la salle de réveil et continuer à surveiller l’état neurologique (p. ex., paralysie), respiratoire (p. ex., arrêt respiratoire) et cardiovasculaire (p. ex., diminution de la perfusion des tissus mous, changements de couleur des pupilles et bradycardie) pendant 24 h. Avant l’émergence de l’anesthésie, administrer 0,01 - 0,05 mg / kg de buprénorphine intramusculaire comme analgésie postopératoire. Répéter les doses toutes les 6 à 12 h pendant au moins 48 h.

2. Évaluation du score de gravité neurologique (SSN)

REMARQUE: L’évaluation du déficit neurologique a été effectuée et notée à l’aide d’un SSN, comme décrit précédemment23,24. Le score maximum d’altération de la fonction motrice et du comportement est de 24 points. Un score de 0 indique un état neurologique intact et 24 indique un dysfonctionnement neurologique grave, comme décrit précédemment24.

  1. Testez l’incapacité du rat à quitter un cercle (50 cm de diamètre) lorsqu’il est placé en son centre. Effectuez cette tâche trois fois, chaque séance dure 30 min, 60 min et plus de 60 min chacune.
    REMARQUE: Si vous ramassez des rats par la queue, tenez la base de la queue.
  2. Testez le rat pour une perte du réflexe de redressement.
    1. Placez l’animal sur le dos dans la paume de la main du chercheur. Donnez un score de 1 si l’animal est capable de se redresser25 (debout sur les quatre pattes).
  3. Testez le rat pour l’hémiplégie, l’incapacité du rat à résister au positionnement forcé.
  4. Soulevez le rat par sa queue pour tester la flexion réflexive du membre postérieur.
  5. Mettez le rat sur le sol pour tester sa capacité à marcher droit.
  6. Effectuez des tests pour trois comportements réflexifs: le réflexe du pavillon, le réflexe cornéen et le réflexe de sursaut.
    1. Pour le réflexe du pavillon, effectuez une stimulation tactile légère pour tester la rétraction de l’oreille comme décrit précédemment25.
    2. Pour tester le réflexe cornéen, surveillez la réponse au clignement des yeux lors de l’application légère d’un bâton souple sur l’œil et mesurez sur une échelle de 0 (aucune réponse) au clignotement triple des yeux (3), comme décrit précédemment25.
    3. Pour le réflexe de sursastence, faites glisser un stylo sur le dessus de la cage métallique et enregistrez la réponse avec une échelle de 0 (pas de réponse) à 3 (saut de 1 cm ou plus), comme décrit précédemment25.
  7. Notez le rat en fonction de la perte de comportement de recherche et de prostration (ne pas bouger ses moustaches, renifler ou courir après avoir été transféré dans un nouvel environnement)24.
  8. Testez les réflexes des membres pour le placement sur les membres antérieurs gauche et droit, puis les membres postérieurs gauche et droit.
  9. Analysez la fonctionnalité via la tâche d’équilibrage du faisceau avec un faisceau de 1,5 cm de large. Effectuez le test pour des sessions d’une durée de 20 secondes, 40 secondes et plus de 60 secondes.
  10. Exécutez le test de marche à la poutre avec trois poutres différentes: 8,5 cm de large, 5 cm de large et 2,5 cm de large.

3. Préparation de la tâche métrique

  1. Équipement
    1. Placez une plate-forme circulaire noire de 200 cm de diamètre et 1 cm d’épaisseur sur une table. La hauteur de la table doit être de 80 cm au-dessus du sol.
    2. Établissez deux objets différents au centre de la plate-forme circulaire à 68 cm l’un de l’autre.
      REMARQUE: Dans cette expérience, deux bouteilles en verre ont été utilisées pour les objets, une bouteille ronde d’une hauteur de 13,5 cm et une autre bouteille à facettes d’une hauteur de 20 cm. Remplissez les bouteilles d’eau pour assurer la stabilité.
    3. Préparez une caméra et installez le logiciel requis pour capturer, enregistrer et traiter les données. Installez la caméra à une hauteur de 290 cm du sol.
      REMARQUE: La distance entre la plate-forme et la caméra dépend des spécifications de la caméra. Le cadre de la caméra doit couvrir toute la zone de l’arène dans laquelle le test est effectué. La distance pour notre expérience entre la plate-forme et la caméra était de 210 cm.
  2. Accoutumance
    1. La veille de la tâche, habituez le rat au nouvel environnement pendant 10 minutes en le plaçant sur l’arène sans enregistrement vidéo.
      REMARQUE: N’effectuez pas les tâches neurologiques et la tâche métrique le même jour.
      REMARQUE : Effectuez des tests métriques dans une zone de lumière rouge.

4. Exécution de la tâche métrique

REMARQUE: L’exécution de la tâche métrique se compose de deux périodes: 1) période d’accoutumance (15 min) et 2) période de test (5 min).

  1. Période d’accoutumant
    1. Établissez deux objets différents au centre de la plate-forme circulaire à 68 cm l’un de l’autre.
    2. Placez le rat à l’extrémité de la plate-forme à égale distance des objets pendant une période de 15 minutes et enregistrez la vidéo.
    3. Retirez le rat de la plate-forme et placez-le dans une cage individuelle pendant 5 minutes.
    4. Nettoyez la plate-forme avec 5% à 10% d’alcool.
      REMARQUE: Jusqu’à 70% d’alcool peut être utilisé pour nettoyer la plate-forme dans des zones bien ventilées.
  2. Période d’essai
    1. Réduisez la distance entre les objets à 34 cm.
    2. Placez le rat sur la plate-forme pendant 5 minutes et enregistrez l’activité d’exploration du rat sur vidéo.
    3. Nettoyez la plate-forme avec 5% à 10% d’alcool.

5. Analyse des données

REMARQUE: L’analyse des données est effectuée par un logiciel de suivi vidéo spécialement conçu pour les études du comportement animal qui enregistre automatiquement l’activité et les mouvements des animaux (voir Tableau des matériaux). Ce logiciel automatise une gamme de variables comportementales, y compris la mobilité, l’activité et le comportement exploratoire.

  1. Avant d’analyser les fichiers vidéo, insérez la clé matérielle logicielle. Démarrez le logiciel de suivi vidéo et ouvrez le modèleprédéfini .
  2. Dans la section Configuration, vérifiez les paramètres comme suit : Arène, Contrôle d’évaluationet Paramètres de détection (voir Figure 2a).
    REMARQUE: Pour cette expérience, les paramètres de la zone d’exploration sont définis comme 6 cm autour de l’objet d’intérêt. Le temps pendant le rat est entré dans cette zone a été mesuré.
  3. Après avoir vérifié les paramètres, dupliquez-les et renommez-les.
  4. Sur l’écran général du programme, Grab Background en cliquant avec le bouton droit de la souris.
  5. Sélectionnez un fichier vidéo pour l’image d’arrière-plan. Dans le menu Parcourir, sélectionnez l’emplacement du fichier vidéo.
  6. Capturez l’image et marquez les zones et zones étudiées, en étalonnant l’image pour l’analyse. Effectuez les mêmes étapes pour le contrôle de la version d’évaluation et les paramètres de détection.
  7. Dans le menu général, sélectionnez Liste d’évaluation et téléchargez la liste des fichiers vidéo pour analyse.
  8. Ajoutez les vidéos et indiquez l’emplacement avec les paramètres requis.
  9. Sélectionnez Acquisition et Démarrer l’essai (voir Figure 2b,c). Exportez toutes les données sous forme de fichiers Excel (voir Figure 2d).
    REMARQUE: Effectuez tous les calculs pour les périodes d’accoutumage et de test. L’évaluation des tâches métriques est préparée à l’aide d’un modèle avancé.

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Résultats

L’importance des comparaisons entre les groupes a été déterminée à l’aide du test de Mann-Whitney. La signification statistique des résultats a été considérée à P < 0,05, tandis que la pertinence statistiquement élevée a été mesurée à P < 0,01.

Les résultats n’ont montré aucune différence dans le SSN entre tous les groupes avant l’intervention et 28 jours après le TCC. Chaque groupe se composait de 12 rats femelles ou 12 rats mâles. Les scores NSS obtenus 48 h après le TCC sont présentés...

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Discussion

En ciblant spécifiquement le processus d’information spatiale métrique, ce test métrique fournit un outil nécessaire pour comprendre le déficit de mémoire après un TCC. Le protocole présenté dans cet article est une modification des tâches comportementales décrites précédemment11. Une tâche métrique décrite précédemment utilisait deux paradigmes différents, chacun composé de trois sessions d’accoutumance et d’une session de test. Le premier paradigme consistait à rapprocher les objets familiers ap...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions la professeure Olena Severynovska; Maryna Kuscheriava M.Sc; Maksym Kryvonosov M.Sc; Daryna Yakumenko M.Sc; Evgenia Goncharyk M.Sc; et Olha Shapoval, candidate au doctorat au Département de physiologie, Faculté de biologie, d’écologie et de médecine, Université Oles Honchar Dnipro, Dnipro, Ukraine pour leurs contributions utiles et de soutien. Les données ont été obtenues dans le cadre de la thèse de doctorat de Dmitry Frank.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2 % de chlorhexidine en solution d’alcool à 70 %SIGMA - ALDRICH500 ccPour l’antisepsie générale de la peau dans le champ opératoire
. Bupivacaïne 0,1 %
4 planches de différentes épaisseurs (1,5 cm, 2,5 cm, 5 cm et 8,5 cm)Il s’agit d’évaluer le défaut
4-0 Suture en nylon4-00
FlaconsTechniplastACBT0262SU150 ml remplis de 100 ml d’eau et 100 ml de solution de saccharose à 1 % (p/v)
Bottlses (quatre) pour les tâchesPour les objets utilisés, deux petites bouteilles, la première ronde (hauteur 13,5 cm) et la seconde à facettes (hauteur 20 cm) et deux grandes bouteilles à facettes, la première 9x6 cm (hauteur 21 cm) et la seconde 7x7 cm (hauteur 21 cm).
Perceuse de scie cloche diamantéescie cloche en verreen option.  ;
Balance numériqueSIGMA - ALDRICHRs 4,000
Ciseaux de dissectionSIGMA - ALDRICHZ265969
Ethanol 99,9 %  ; Pharmacie5 %-10 % solution utilisée pour nettoyer les équipements et éliminer les odeurs
EthoVision XT (Logiciel vidéo)Noldus, Wageningen, Pays-BasDispositif optionnel
à percussion fluidefabriqué sur mesure à l’atelier  ;   ; Aucune marque spécifique n’est recommandée.
Éponges de gazeFisher22-362-178
Gants (gants de laboratoire fins)Facultatif.
Chauffage avec thermomètreHeatingpad-1Modèle : HEATINGPAD-1/2  ;   ; Aucune marque spécifique n’est recommandée.
Horizon-XLMennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100 %Piramamal Critical Care, IncNDC 66794-017Liquide anesthésique pour inhalation
Office 365 ProPlusMicrosoft-MicrosoftOffice Excel
Olympus BX 40microscope Olympus
Pinceopératoire SIGMA - ALDRICH
Fonctionnement  ; CiseauxSIGMA - ALDRICH
PC Ordinateur pour l’enregistrement USV et l’analyse de donnéesIntelIntel® ; core i5-6500 CPU @ 3,2 GHz, 16 Go de RAM, système d’exploitation 64 bits
Boîtes en plexiglas reliées par un passageDeux boîtes en plexiglas transparentes de 30 cm & times ; 20 cm & times ; 20 cm reliées par un passage étroit de 15 cm & times ; 15 cm & times ; 60 cm
Purina ChowPurina5001Rongeurs de laboratoire chow donné aux rats, souris et hamster est une nutrition du cycle de vie qui a été utilisée en recherche biomédicale pour plus de 5
cages à rats  ; (maison pour rats, cage ou autre enclos)Techniplast2000PAucune marque spécifique n’est recommandée
Lames de scalpel 11SIGMA - ALDRICHS2771
SPSSSPSS Inc., Chicago, IL, USA  ; 20 paquet
d’instrument stéréotaxiquefabriqué sur mesure à l’atelier de l’université  ;   ; Aucune marque spécifique n’est recommandée
Dispositif de chronométrageMinuterie d’intervalle : Chronométrage pour l’enregistrement desFacultatif. N’importe quelle minuterie fera l’affaire, bien qu’il soit pratique d’utiliser une minuterie d’intervalle si vous chatouillez plusieurs rats
Appareil de tâches topologiques et métriquesFabriqué par lui-même à l’Université Ben Gourion du NéguevPlate-forme circulaire blanche de 200 cm de diamètre et 1 cm d’épaisseur sur la table
Caméra vidéoLogitechC920 HD PRO WEBCAMCaméra vidéo numérique pour l’enregistrement haute définition du comportement du rat sous plus test de labyrinthe
Windows 10Microsoft
neurologique topologiques et métriques Kit de de 3 mm de diamètre universitaire étroit USV

Références

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