Article de méthode

Protocoles de PCR numérique en gouttelettes à transcription inverse en deux étapes pour la détection et la quantification du SRAS-CoV-2

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DOI :

10.3791/62295

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31 mars 2021

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1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2International College, University of Chinese Academy of Sciences, 3Sino-Africa Joint Research Center, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 5Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

Dans cet article

Résumé

Ce travail résume les étapes du développement de différents tests pour la détection du SARS-CoV-2 à l’aide d’un système ddPCR bicolore. Les étapes sont élaborées et des notes ont été incluses sur la façon d’améliorer les tests et les performances expérimentales. Ces tests peuvent être utilisés pour plusieurs applications SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Résumé

Le diagnostic de la pandémie actuelle de SRAS-CoV-2 est une priorité pour tous les pays du monde. Actuellement, la PCR quantitative à transcription inverse (RT-qPCR) est l’étalon-or pour le diagnostic du SRAS-CoV-2 car aucune solution permanente n’est disponible. Quelle que soit l’efficacité de cette technique, des recherches ont émergé montrant ses limites dans la détection et le diagnostic, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles peu abondantes. En revanche, il a été démontré que la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR), une technologie émergente récente présentant des avantages supérieurs à la qPCR, permet de surmonter les défis de la RT-qPCR dans le diagnostic du SRAS-CoV-2 à partir d’échantillons cibles peu abondants. Prospectivement, dans cet article, les capacités de la RT-ddPCR sont encore étendues en montrant les étapes à suivre pour développer des tests simplex, duplex, triplex et quadruplex à l’aide d’un système de détection bicolore. En utilisant des amorces et des sondes ciblant des sites spécifiques du génome du SRAS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 et RBD2), le développement de ces tests s’avère possible. De plus, des protocoles détaillés, des notes et des suggestions étape par étape sur la façon d’améliorer le flux de travail des tests et d’analyser les données sont fournis. L’adaptation de ce flux de travail dans les travaux futurs garantira que le nombre maximal de cibles peut être détecté de manière sensible dans un petit échantillon, ce qui améliorera considérablement le coût et le débit de l’échantillon.

Introduction

La réaction en chaîne de la polymérase (PCR), une technique bien reconnue, a subi plusieurs transformations depuis son avènement pour devenir une technique puissante capable d’apporter des réponses à la recherche sur les acides nucléiques. Ces transformations ont été une amélioration constante de l’ancienne technique. Ces transformations peuvent se résumer en trois générations1. La première génération est la PCR conventionnelle qui repose sur l’électrophorèse sur gel pour quantifier et détecter les cibles amplifiées. La deuxième génération est la PCR quantitative en temps réel (qPCR) qui peut détecter des échantillons en temps réel et s’appuyer sur une courbe standard pour quantifier directement les cibles d’un échantillon. La troisième génération, la PCR numérique (dPCR), peut effectuer à la fois la détection et la quantification absolue de cibles d’acides nucléiques sans avoir besoin d’une courbe standard. La dPCR a également été améliorée par le fait que les chambres de réaction sont séparées par les puits d’un mur en émulsions d’huile, d’eau et de produits chimiques stabilisateurs dans le même puits, comme on le voit dans la PCR numérique2 à base de gouttelettes. Dans la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR), un échantillon est divisé en milliers de gouttelettes de la taille d’un nanolitre contenant des cibles individuelles qui seront ensuite quantifiées à l’aide des statistiques de Poisson 2,3,4. Cette technique donne à la ddPCR un avantage dans la quantification des cibles peu abondantes par rapport aux autres générations de PCR.

Récemment, de multiples applications ont mis en évidence la supériorité de la ddPCR par rapport à la qPCR couramment utilisée lors de la détection et de la quantification de cibles faiblement abondantes 1,5,6. Le SARS-CoV-2 ne fait pas exception à ces applications 7,8,9,10,11,12. Depuis l’épidémie de SRAS-CoV-2, les scientifiques ont travaillé sur tous les fronts pour trouver des solutions sur la façon de diagnostiquer le virus et de le détecter efficacement. L’étalon-or actuel reste à être qPCR13. Cependant, la RT-ddPCR s’est avérée plus précise dans la détection de cibles SARS-CoV-2 peu abondantes à partir d’échantillons environnementaux et cliniques par rapport àla RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La plupart des travaux publiés sur la ddPCR du SARS-CoV-2 dépendent de tests simplex, les tests multiplex dépendant de tests commerciaux. Par conséquent, il faudrait faire davantage pour expliquer comment développer des tests RT-dPCR multiplex pour la détection du SRAS-CoV-2.

Dans une conception de test appropriée, le multiplexage peut être utilisé pour économiser sur les coûts, augmenter le débit de l’échantillon et maximiser le nombre de cibles pouvant être détectées de manière sensible dans un petit échantillon. Lors du multiplexage avec ddPCR, il faut tenir compte du nombre de fluorophores pouvant être détectés dans un système particulier. Certaines plates-formes ddPCR peuvent prendre en charge jusqu’à trois canaux tandis que d’autres ne prennent en charge que deux canaux. Par conséquent, lors du multiplexage avec deux canaux, il faut utiliser différentes approches, y compris le multiplexage d’ordre supérieur pour détecter plus de deux cibles14,15,16. Dans ce travail, un système de détection ddPCR bicolore est utilisé pour montrer les étapes à suivre pour développer différents tests SARS-CoV-2 RT-ddPCR qui peuvent être adaptés à différentes applications de recherche.

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Protocole

Déclaration éthique
L’Institut de virologie de Wuhan (WHIOV) fait partie des laboratoires et instituts approuvés par le CDC chinois de la ville de Wuhan pour mener des recherches sur le SRAS-CoV-2 et détecter la COVID-19 à partir d’échantillons cliniques. La recherche sur le développement de nouvelles techniques de diagnostic de la COVID-19 à l’aide d’échantillons cliniques a également été approuvée par le comité d’éthique de l’Institut de virologie de Wuhan (2020FCA001).

1. Flux de travail de traitement des échantillons (Figure 1A)

REMARQUE : Tout au long du protocole, il est important d’utiliser des salles séparées avec des pipettes dédiées pour la manipulation des échantillons (extraction et stockage), la préparation et l’entreposage des réactifs/mélanges maîtres, la préparation du mélange réactionnel (échantillon plus mélange maître) et la détection, afin d’éviter la contamination croisée. Les tests à développer peuvent être utilisés dans la détection d’échantillons cliniques ou d’échantillons de recherche. Tous les échantillons doivent être traités comme s’ils pouvaient transmettre des agents infectieux, même en utilisant des procédures de laboratoire sécuritaires. Les étapes de traitement des échantillons doivent être effectuées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) en suivant les règles strictes de la BSL-2, y compris le port d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.

  1. Inactivation de l’échantillon
    1. Prélever 1 mL d’échantillon de SRAS-CoV-2 dans un laboratoire BSL-2. Inactiver thermiquement les échantillons à 65 °C pendant 30 min.
      REMARQUE: Les échantillons peuvent provenir de diverses sources, par conséquent, il faut s’assurer que le volume à inactiver est suffisant pour assurer l’extraction ultérieure de l’ARN. La plupart des trousses d’extraction nécessitent un petit volume d’échantillon allant jusqu’à 200 μL, par conséquent, un volume d’échantillon d’environ 1 mL serait suffisant pour l’inactivation. Les tensioactifs, les kits et les tampons de lyse peuvent également être utilisés pour l’inactivation directe et l’extraction d’ARN selon les propres SOP du laboratoire.
    2. Prélever les échantillons dans une enceinte de biosécurité (ESB) et les laisser reposer à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre aux aérosols potentiels de se déposer. Conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à 24 heures s’ils ne sont pas traités immédiatement.
      REMARQUE : Aucun contenant spécifique n’est requis pour le stockage des échantillons. Les échantillons peuvent être conservés dans les tubes ou contenants utilisés pendant l’inactivation. Pour ce travail, la plupart des échantillons ont été stockés dans des tubes de milieu de transport viral (VTM) ou des tubes de 1,5 mL.
  2. Extraction d’ARN
    REMARQUE: De nombreux instruments et kits d’extraction d’ARN avec des protocoles spécifiques sont disponibles pour une utilisation immédiate. Ici, une procédure automatisée suivant les instructions du fabricant est présentée.
    1. Retirez la plaque d’orifice de puits de 96 profondeurs préremplie; Inversez-le doucement à l’envers pour mélanger les billes magnétiques. Après avoir mélangé, agiter doucement la plaque sur une surface plane pour concentrer le réactif et les billes magnétiques qui peuvent se trouver sur la paroi jusqu’au fond de la plaque.
    2. Déchirez soigneusement le film d’étanchéité en feuille d’aluminium pour éviter les vibrations de la plaque et le déversement de liquide. Ajouter 20 μL de protéinase K et 200 μL de l’échantillon par puits dans les rangées 2 et 8 de la plaque de 96 puits. Ensuite, placez la plaque de 96 puits sur la base de l’instrument d’extraction automatique d’acide nucléique à 32 canaux.
      Remarque : Exécutez le programme sur l’ordinateur dans les 1 h suivant l’ajout de l’exemple.
    3. Insérez le manchon de barre magnétique dans la fente pour carte de l’instrument d’extraction automatique d’acide nucléique à 32 canaux. Sélectionnez le programme GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (version rapide) et exécutez-le.
    4. Une fois l’extraction terminée, prélever les échantillons d’acides nucléiques dans les rangées 6 et 12 (environ 100 μL/échantillon) et les répartir dans une plaque propre sans nucléase de 96 puits. Conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à 24 heures jusqu’à utilisation ou à -20 °C pendant une période plus longue.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser une pipette multicanal de 100 μL pour transférer les échantillons dans une nouvelle plaque de 100 à 200 μL, car elle peut correspondre directement aux colonnes de la plaque d’échantillonnage.
  3. Génération d’ADNc
    REMARQUE : Pour les échantillons conservés pendant une longue période, évitez les cycles de congélation ou de décongélation multiples. Effectuer la génération d’ADNc à l’aide d’un kit d’ADNc en suivant les instructions du fabricant.
    1. Dans un tube de PCR de 100 ou 200 μL placé sur un bloc de glace ou de refroidissement, ajouter 2 μL de 5x mélange maître RT (p. ex., Perfect Real Time), 5 μL d’ARN échantillon et 3 μL de ddH2O libre de RNase par réaction (volume total de 10 μL).
    2. Placez le tube de PCR dans un thermocycleur réglé pour fonctionner à 37 °C pendant 15 min (transcription inverse), 85 °C pendant 5 s (inactivation thermique de la transcriptase inverse) et 4 °C pendant une durée infinie.
      REMARQUE : Traiter les échantillons immédiatement ou conserver à 4 °C jusqu’à 24 heures jusqu’à utilisation ou à -20 °C jusqu’à 6 mois.

2. Optimisation du test et du flux de travail ddPCR

REMARQUE: Optimisez les tests avant/après la lecture des gouttelettes. En fonction des résultats, ils peuvent être optimisés à tout moment du travail pour obtenir de meilleurs résultats. Vous trouverez ci-dessous quelques facteurs courants à prendre en compte lors de l’optimisation des expériences de ddPCR.

  1. Validez les amorces et les sondes ddPCR (Tableau 1).
    NOTE: Les amorces ORF1ab et N ont été adaptées de China CDC17, le gène de contrôle endogène humain (RPP30) de Lu et al.18, et RBD2 de Nyaruaba et al.13. Toutes les amorces et sondes à l’exception de RBD2 avaient déjà été testées et optimiséespar ddPCR 7,8,18.
  2. Exécutez les contrôles d’échantillon de test ddPCR comprenant un contrôle positif (un échantillon avec les quatre cibles), un contrôle sans modèle (NTC; Eau exempte de nucléases ou échantillon sans cibles) et extraction/contrôle négatif (acide nucléique total extrait d’une cellule humaine cultivée non infectieuse ou d’échantillons groupés de volontaires en santé).
    REMARQUE : Les échantillons témoins standard avec des copies connues des gènes cibles sont préférés. Cependant, en l’absence de normes, utiliser les échantillons disponibles pour définir leurs contrôles ou leur matrice d’échantillonnage. Exécutez les contrôles avec les échantillons de test.
  3. Optimiser la température de recuit (Figure 2D) en insérant un gradient de température de 55 °C à 65 °C dans l’étape de recuit de la PCR (étape 3.2).
    REMARQUE: L’optimisation de la température de recuit aide à trouver la meilleure température où la séparation des gouttelettes est maximale (identification facile de la cible) avec un minimum de pluie. Après avoir obtenu les résultats, réduisez la plage de température pour une meilleure optimisation, par exemple 55 °C à 60 °C.
  4. Optimiser les concentrations de l’amorce et de la sonde. Si la séparation optimale entre les gouttelettes positives et négatives n’est pas obtenue dans les essais, faire varier les concentrations de l’amorce (300-900 nM) et/ou de la sonde (100-400 nM).
    REMARQUE: L’abaissement des concentrations d’amorce / sonde entraîne une amplitude de gouttelettes cible plus faible et son augmentation augmente également l’amplitude de la cible. Cela peut être utile dans le multiplexage basé sur l’amplitude.
  5. Testez la sensibilité analytique en tenant compte de différents paramètres, y compris la limite de blanc (LoB), la limite de détection (LoD), la spécificité et la sensibilité en utilisant des échantillons standard et d’essai, selon vos préférences.

3. Flux de travail ddPCR (Figure 1B) et développement de tests (Tableau 2)

REMARQUE : Comme d’autres systèmes de détection ddPCR, ce flux de travail comprend également quatre étapes (Figure 1B), notamment la préparation du mélange réactionnel, la génération de gouttelettes, l’amplification par PCR et la lecture des gouttelettes.

  1. Préparation du mélange réactionnel
    REMARQUE : Préparez tous les tests dans une pièce propre et séparée et à l’intérieur d’une ESB. Observez les précautions standard, y compris l’utilisation de gants propres, de pipettes propres, d’eau sans nucléase et de désinfectants. Les réactifs aliquotes sont stockés dans des tubes séparés et stockés à -20 °C pour éviter les cycles répétés de décongélation par le gel. Préparer les dosages comme indiqué dans le tableau 2. Les solutions mères d’apprêt et de sonde doivent être conservées à des concentrations élevées de 100 μM. Les solutions de travail peuvent être stockées dans des aliquotes de 20 à 40 μM (diluées dans de l’eau sans nucléase).
    1. Étapes communes à tous les tests
      REMARQUE : Avant de préparer les essais, calculez le volume total de mastermix nécessaire en fonction du nombre d’échantillons. Ici, chaque volume de composant mastermix a été multiplié par 1,05 pour tenir compte des erreurs de pipetage.
      1. Décongeler et équilibrer les matériaux de réaction à température ambiante. Vortex brièvement (30 s) des composants de réaction pour assurer l’homogénéité, et centrifuger brièvement pour recueillir le contenu au fond du tube.
      2. Préparer un mélange amorce-sonde (PP) par essai en mélangeant des volumes de réaction spécifiques comme indiqué dans le tableau 2 à partir des solutions de travail.
      3. Préparer le mélange maître en mélangeant 11 μL (1x) de 2x supermix ddPCR pour sondes (sans dUTP), mélange PP (selon le dosage comme indiqué dans le tableau 2 de la solution de travail) et eau exempte de nucléases jusqu’à un volume final de 19,8 μL par puits. Répartir le mélange maître dans les puits d’une plaque de ddPCR de 96 puits exempte de nucléases en fonction du nombre d’échantillons.
        REMARQUE: Pour la plaque d’échantillonnage, assurez-vous que les 8 puits d’une colonne ont la solution. Si seulement quelques puits sont utilisés, par exemple 5 échantillons, remplissez les 3 autres puits avec 22 μL d’eau exempte de nucléases ou de tampon de contrôle chacun.
      4. Pour obtenir le volume final du mélange réactionnel (22 μL), ajouter 2,2 μL d’échantillon d’ADNc par puits contenant le mélange maître. Scellez la plaque avec un scellant de plaque PCR jetable.
        Remarque : Effectuez les ajouts d’échantillons dans la salle désignée. Inclure les contrôles, c.-à-d. positif, NTC et extraction. De plus, si les échantillons d’ARN sont de faible concentration, réduire le volume d’eau dans le mélange principal et augmenter le volume de l’échantillon en conséquence jusqu’à 5,5 uL.
      5. Une fois le mélange réactionnel réparti par puits, vortex brièvement (15-30 s) et centrifuger (10-15 s) pour recueillir le contenu au fond de la plaque. Procéder à la génération de gouttelettes.
  2. Production automatisée de gouttelettes (figure supplémentaire 1)
    REMARQUE: Différents générateurs de gouttelettes peuvent être utilisés; cependant, cette étude a été réalisée avec un générateur de gouttelettes automatisé (AutoDG). Pour éviter la contamination par amplicon, assurez-vous que le générateur de gouttelettes et les lecteurs disposent d’un espace dédié dans des zones séparées. Lors du chargement des consommables, il est recommandé de commencer le chargement à partir de l’arrière de l’instrument en travaillant vers l’avant pour éviter de déplacer les mains sur les consommables afin d’éviter la contamination croisée.
    1. Procurez-vous tous les consommables nécessaires à la configuration de l’AutoDG, y compris l’huile AutoDG pour les sondes, les cartouches DG32, les pointes de pipettes, le bloc de refroidissement, la plaque d’échantillonnage, la plaque de gouttelettes (nouvelle plaque ddPCR propre) et une poubelle.
    2. Sur l’écran tactile AutoDG, appuyez sur Configurer la plaque d’échantillonnage, sélectionnez les colonnes où se trouvent les échantillons sur la plaque d’échantillonnage, puis appuyez sur OK.
      REMARQUE: L’écran devient jaune indiquant LOAD où les consommables doivent être chargés.
    3. Ouvrez la porte AutoDG et chargez les consommables à leur place respective.
      REMARQUE: Les endroits respectifs où les consommables doivent être chargés auront un indicateur jaune qui deviendra vert plus tard si les consommables sont chargés. Ceci est similaire à l’écran tactile.
    4. Chargez la plaque d’échantillonnage et la plaque de génération de gouttelettes.
      REMARQUE: La plaque de génération de gouttelettes doit être placée sur le bloc de refroidissement. Assurez-vous que le bloc de refroidissement est violet (prêt à l’emploi) et non rose (doit être conservé dans un congélateur jusqu’à ce que la couleur redevienne violette).
    5. Fermez le capot AutoDG, assurez-vous que l’écran est vert (consommables chargés) et sélectionnez/assurez-vous que le type d’huile est Huile pour sondes avant d’appuyer sur Start Droplet Generation (Démarrer la génération de gouttelettes).
    6. Attendez que les gouttelettes soient générées. Ouvrez la porte une fois que l’écran affiche Droplets Ready et retirez la plaque contenant les gouttelettes.
    7. Sceller la plaque à l’aide d’une feuille perforable à l’aide d’un scellant à plaques réglé à 185 °C pendant 5 s. Passez à l’amplification par PCR.
      REMARQUE: L’amplification PCR doit être démarrée dans les 30 minutes suivant la génération de gouttelettes.
  3. Amplification par PCR
    1. Insérez la plaque de gouttelettes scellée dans un cycleur thermique à puits de 96 profondeurs, réglez le volume de l’échantillon à 40 μL et la température du couvercle à 105 °C.
    2. La PCR amplifie les gouttelettes à l’aide du programme : 95 °C pendant 10 min (activation enzymatique), 40 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 30 s et 1 min de recuit/extension à 57 °C, désactivation enzymatique à 98 °C pendant 10 min, et pas de maintien à 4 °C indéfiniment. Après la PCR, lire les gouttelettes ou conserver à 4 °C jusqu’à 24 h.
      NOTE: Utilisez une vitesse de rampe de 2 °C / s à toutes les étapes, car les vitesses de rampe peuvent différer pour différents thermocycleurs. Maintenir la plaque pendant au moins 30 minutes à 4 °C pour permettre la stabilisation des gouttelettes avant de lire les gouttelettes.
  4. Lecture de gouttelettes
    1. Transférez la plaque à 96 puits à cycle thermique dans un lecteur de gouttelettes et, sur un ordinateur connecté au lecteur de gouttelettes, ouvrez / démarrez le logiciel d’accompagnement.
    2. En mode de configuration, sélectionnez Nouveau , puis double-cliquez sur n’importe quel puits pour ouvrir la boîte de dialogue Éditeur de puits . Sélectionnez les puits à lire et choisissez Experiment: ABS, Supermix: ddPCR Supermix for Probes (no dUTP), Target 1 Type: Ch1 Unknown, Target 2 Type: Ch2 Unknown.
      REMARQUE : Les options négatives, blanches, NTC ou positives peuvent être sélectionnées dans le menu déroulant du type cible 1/2 pour les échantillons de contrôle.
    3. Attribuez les noms de la cible ou de l’échantillon en fonction de la disposition de la plaque et sélectionnez Appliquer. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez OK et enregistrez le modèle créé. Cliquez sur Exécuter et, lorsque vous y êtes invité, choisissez la bonne couleur (FAM/HEX).
      REMARQUE: Il est recommandé d’amorcer le système avant l’exécution avant la première exécution de la journée. Vérifiez également si tous les voyants du lecteur sont verts et, si ce n’est pas le cas, suivez l’application recommandée sur l’état de l’info-bulle.
    4. Une fois l’acquisition des données terminée, retirez la plaque du lecteur. Analyser les données au besoin.
      REMARQUE: Étant donné que les résultats préliminaires peuvent être vus à l’écran, l’exécution des échantillons positifs dans les premiers puits peut être utilisée pour le contrôle de la qualité en temps réel.

4. Analyse des données (figures supplémentaires 2 et 3)

  1. Vérifiez les données de tous les puits pour le nombre total de gouttelettes. Si le nombre de gouttelettes est de 10 000 <, ignorez les résultats et répétez le test. Définissez une limite pour accepter les résultats positifs et négatifs. Par exemple, un nombre de gouttelettes allant jusqu’à 3 gouttelettes positives ou plus peut être considéré comme le seuil pour des résultats positifs.
    REMARQUE: Les données de tous les tests, y compris les tests simplex, duplex, triplex et quadruplex, sont générées à l’aide du logiciel associé. Cependant, ce logiciel ne convient que pour les tests simplex et duplex. Pour les tests multiplex d’ordre élevé (cibles >3), un logiciel externe est nécessaire.
  2. Tests Simplex et duplex
    REMARQUE: Le logiciel externe peut également analyser les données recto et duplex. Cependant, l’utilisation du logiciel d’accompagnement est plus facile pour ces tests, donc utilisé dans cet article.
    1. Double-cliquez sur le fichier .qlp à analyser pour l’ouvrir et sélectionnez Analyser.
    2. Utilisez les outils de seuil de l’amplitude 1D et de l’amplitude 2D pour distinguer les gouttelettes positives et négatives pour chaque puits dans le bon canal. Les échantillons NTC et les échantillons témoins positifs peuvent être utilisés comme guide pour l’établissement du seuil.
      REMARQUE: Les résultats FAM sont visibles dans le canal 1 tandis que HEX/VIC dans le canal 2.
    3. Après la définition du seuil, les résultats peuvent être exportés sous forme de fichier .csv et analysés dans Excel ou enregistrés en lisant directement dans la fenêtre de résultats.
  3. Mélange de sondes Triplex (Figure supplémentaire 2) et Essais quadruplex (Figure supplémentaire 2)
    REMARQUE: Avant d’analyser le mélange de sonde triplex et le test quadruplex, téléchargez le logiciel externe. Reportez-vous à la configuration minimale requise avant l’installation.
    1. Ouvrez le fichier .qlp en cliquant dessus avec le bouton droit de la souris et en choisissant Ouvrir avec le logiciel externe, ou en ouvrant le logiciel externe et en cliquant sur l’option Parcourir pour localiser le fichier .qlp dans votre dossier, ou en faisant simplement glisser le fichier .qlp et en le déposant sur le logiciel externe déjà ouvert.
    2. Dans l’onglet éditeur de plaques, sélectionnez les puits à analyser sur le côté droit de l’onglet.
      1. Pour le mélange de sondes triplex, sélectionnez Quantification directe (DQ) comme type d’expérience, sélectionnez Probe Mix Triplex comme informations de test et entrez les noms des cibles en conséquence, puis cliquez sur Appliquer.
      2. Pour quadruplex, sélectionnez Quantification directe (DQ) comme type d’expérience, sélectionnez Amplitude Multiplex comme informations de test et entrez les noms des cibles en conséquence, puis cliquez sur Appliquer.
    3. Sur le côté gauche de l’onglet Amplitude 2D, utilisez les Outils graphiques pour attribuer des couleurs spécifiques à différents clusters cibles en suivant les suggestions contextuelles de la fenêtre Sélectionner pour attribuer un cluster .
      REMARQUE: Le mode de cluster préféré peut être appliqué en fonction des préférences des utilisateurs.
    4. Une fois les couleurs cibles attribuées, les données de quantification peuvent être lues dans la fenêtre Données de puits en bas à droite. Exportez les données vers Excel/csv pour une analyse plus approfondie à l’aide de l’icône à triple barre située dans le coin supérieur droit du tableau de données du puits.

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Résultats

Dans une étude de validation de principe, la performance analytique des tests multiplex a été testée sur des échantillons cliniques et de recherche19. La performance des tests multiplex était supérieure à celle d’une RT-PCR19. Étant donné qu’un faible nombre de gouttelettes peut indiquer un problème lors de la génération de gouttelettes, dans cet article, un seuil de 10 000 gouttelettes par puits a été fixé sur la base de données empiriques.

Une ...

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Discussion

Peu de ressources sont disponibles sur la façon de développer des tests RT-ddPCR pour la détection du SRAS-CoV-2. Bien qu’ils ne soient pas utilisés dans cet article, des échantillons standard avec des copies connues peuvent être utilisés pour développer et optimiser les essais. Dans ce travail cependant, des échantillons de SARS-CoV-2 cultivés dans des cellules Vero-E6 ont été dopés dans un arrière-plan d’ARN génomique humain et utilisés comme échantillons standard pour développer les tests. Des séquences d’amorce et de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit à révéler.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le mégaprojet de contrôle des maladies infectieuses du ministère de la Santé de Chine, numéro de subvention 2017ZX10302301-005 et le Centre conjoint de recherche sino-africain, numéro de subvention SAJC201605.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Extracteur d’acide nucléique entièrement automatique à 32 canaux Purificateur 32Genfine BiotechFHT101-32Extracteur automatisé pour ARN
AutoDG Huile pour sondesBioRad12003017QX200 Consommable AutoDG
ddPCR Plaques à 96 puitsBioRad12003185
ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP)BioRad1863024Fabrication d’un mastermix de test ddPCR
DG32 AutoDG CartouchesBioRad1864108QX200 Consommable AutoDG
Bain-marie thermostatique électroniquePékin Changfeng Instrument and Meter CompanyXMTD-8000Inactivation thermique d’échantillons
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA ExtractionFMY502T5Extraction par billes magnétiques d’échantillons d’ARN inactivés
Feuille perçable ThermoscellagesBioRad1814040
Pointes de pipette pour l’AutoDGBioRad1864120QX200 AutoDG
Poubelles pour l’AutoDGBioRad1864125QX200 AutoDG Consommable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)TaKaRaRR036Agénération d’ADNc
PX1 Scelleuse de plaques PCRBioRad1814000Scellez la plaque de gouttelettes de AutoDG
QuantaSoft 1.7 LogicielBioRad10026368Acquisition et analyse de données
QuantaSoft Analysis Pro 1.0BioRadN/AAnalyse de données
QX200 Gererator de gouttelettes automatisé (AutoDG)BioRad1864101QX200 Consommable AutoDG
QX200 Lecteur de gouttelettesBioRad1864003Lecture de gouttelettes et acquisition de données
T100 ThermocycleurBioRad1861096Amplification de la cible des gouttelettes (PCR) et génération d’ADNc

Références

  1. Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
  2. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
  3. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), Basel, Switzerland. 1271(2018).
  4. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236(1999).
  5. Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621(2017).
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