Évaluation des mesures fonctionnelles de la santé des muscles squelettiques dans les microtissus musculaires squelettiques humains

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour produire des réseaux de microtissus musculaires squelettiques humains en 3D et des tests de fonction in situ en aval mini-invasifs, y compris des analyses de force contractile et de manipulation du calcium.

Résumé

Les modèles in vitro tridimensionnels (3D) du muscle squelettique constituent une avancée précieuse dans la recherche biomédicale, car ils offrent la possibilité d’étudier la réforme et le fonctionnement des muscles squelettiques dans un format évolutif qui se prête à des manipulations expérimentales. Les systèmes de culture musculaire 3D sont souhaitables car ils permettent aux scientifiques d’étudier le muscle squelettique ex vivo dans le contexte des cellules humaines. Les modèles 3D in vitro imitent étroitement certains aspects de la structure tissulaire native du muscle squelettique adulte. Cependant, leur application universelle est limitée par la disponibilité de plates-formes simples à fabriquer, coûteuses et conviviales, et produisant des quantités relativement élevées de tissus musculaires squelettiques humains. De plus, étant donné que le muscle squelettique joue un rôle fonctionnel important qui est altéré au fil du temps dans de nombreux états pathologiques, une plate-forme expérimentale pour les études de microtissu est plus pratique lorsque des mesures de force transitoire et contractile de calcium mini-invasives peuvent être effectuées directement dans la plate-forme elle-même. Dans ce protocole, la fabrication d’une plate-forme de 96 puits connue sous le nom de « MyoTACTIC » et la production en masse de microtissus musculaires squelettiques humains 3D (hMMT) sont décrites. En outre, les méthodes pour une application mini-invasive de la stimulation électrique qui permet des mesures répétées de la force musculaire squelettique et de la manipulation du calcium de chaque microtissu au fil du temps sont rapportées.

Introduction

Le muscle squelettique est l’un des tissus les plus abondants dans le corps humain et soutient les fonctions clés du corps telles que la locomotion, l’homéostasie thermique et le métabolisme¹. Historiquement, des modèles animaux et des systèmes de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ont été utilisés pour étudier les processus biologiques et la pathogenèse des maladies, ainsi que pour tester des composés pharmacologiques dans le traitement des maladies musculaires squelettiques^2,3. Alors que les modèles animaux ont grandement amélioré nos connaissances sur les muscles squelettiques ....

Protocole

1. Fabrication de plaques MYOCTACTIQUES PDMS

REMARQUE: La fabrication de plaques myotactices PDMS nécessite un moule négatif PU, qui peut être fabriqué comme décrit précédemment³⁰. Le fichier SolidWorks de conception assistée par ordinateur (CAO) pour la conception de plaques MyoTACTIC a été mis à disposition sur GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).

1. Préparer ~ 110 g de solution de polymère PDMS dans un gobelet en plastique jetable à un rapport de 1:15 de monomère à agent de durcissement en utilisant les composants du kit d’élastomère de silicone. Remuer la solution de pol....

Résultats

Les méthodes décrites ici sont les méthodes permettant de couler une plate-forme de culture myoTACtique à base de PDMS à 96 puits à partir d’un moule PU, de fabriquer des réseaux de tissus répliques hMMT et d’analyser deux aspects de la fonction hMMT dans la génération de force du dispositif de culture et la manipulation du calcium. La figure 1 offre un aperçu schématique de la préparation des puits de culture myotactique avant l’ensemencement de la hMMT. PDMS est un polymère à base de silic.......

Discussion

Ce manuscrit décrit des méthodes pour fabriquer et analyser un modèle de culture 3D hMMT qui peut être appliqué à des études de biologie musculaire de base, à la modélisation de maladies ou à des tests de molécules candidates. La plate-forme MyoTACTIC est économique, facile à fabriquer et nécessite un nombre relativement faible de cellules pour produire des microtissus musculaires squelettiques. Les mmTh formés au sein de la plateforme de culture MyoTACTIC sont constitués de myotubes alignés, multinucléés et striés, et r.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution saline à 0,9 %,	marque maison	1010	10 mL d’aliquotes de la solution sont préparées et stockées à 4 ° C
25G Aiguille	BD, Medstore, Université de Toronto	2548-CABD305127
Acide 6-aminocaproïque, &ge ; 99 % (titrage), Powder	Sigma - Aldrich	A2504-100G	Une solution mère de 50 mg / mL est générée en dissolvant 5 mg de poudre d’acide 6-aminocaproïque dans 100 mL d’eau distillée autoclave. La solution est filtrée sous vide et des aliquotes de 10 mL sont stockées à 4° ; C
6.35 mm ID Tubing	VWR	60985-528
AB1167 Myoblast Cell Line	Institut de Myologie (Paris, France)
Générateur de formes d’onde arbitraires	Rigol	DG1022Z
Extrait de membrane basale (Geltrex)	Thermo Fisher Scientific	A14132-02	Stocké sous forme d’aliquotes de 50 µ ; L ou 100 & micro ; L à -80° ;
C Benchtop Benchtop Vacuum Chamber	Sigma - Aldrich	D2672
BNC to Aligator Clip Cable			Commandé auprès d’Amazon
Culture Plastics	Sarstedt		Comprend des plaques de culture, des pipettes sérologiques, etc
Dimethyl Sulfoxide	Sigma - Aldrich	D8418-250ML
DPBS, poudre, sans calcium, sans magnésium	Thermo Fisher Scientific
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	Il s’agit d’un DMEM à haute teneur en glucose avec de la L-glutamine et du pyruvate de sodium
Sérum fœtal bovin	Fisher Scientific 10437028
Fibrinogène de plasma bovin	Sigma - Aldrich	F8630-5G	Des aliquotes allant de 7 à 10 mg de poudre de fibrinogène sont fabriquées et stockées à -20° ; C
Filtropur Seringue Filtre, 0,22um Taille des pores	Sarstedt	83.1826.001
Sérum de cheval	Gibco	16050-122
Insuline recombinante humaine	Sigma - Aldrich	91077C	La solution mère est 100X et fabriquée en dissolvant 1 mg d’insuline recombinante humaine dans 1 mL de DMEM et 1 µ ; L de NaOH 10N. La solution est filtrée et stockée sous forme d’aliquotes de 1 mL à 4° ; C
Logiciel d’acquisition d’images	Olympus	cellSens Dimension
Logiciel de traitement	d’images National Institutes of Health	ImageJ
Isotemp Oven	Thermo Fisher Scientific	201
Microscope	Olympus	IX83
Microscope - Support de caméra	Labcam	Labcam pour iPhone	Commandé sur Amazon
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140-122
Seringues jetables en plastique, 1cc	BD	2606-309659
Seringues jetables en plastique, 50cc	BD	2612-309653
Pluronic F-127, poudre, BioReagent	Sigma - Aldrich	P2443-250G	Une solution mère à 5 % d’acide pluronique est obtenue en dissolvant 5 g de poudre d’acide pluronique dans 100 ml d’eau distillée réfrigérée et autoclavée. La solution est filtrée sous vide et des aliquotes de 10 mL sont stockées à 4° ; C
Polydiméthylsiloxane (kit d’élastomère de silicone Sylgard 184)	Les kits 4019862 Dow		sont également disponibles chez Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Moule négatif en polyuréthane	Agent
	Mann Release Technologies	200
Pompe à vide à palettes rotatives	Edwards	A65401906
Scalpel	Almedic, Medstore, Université de Toronto	2586-M36-0100
Lame de rasoir à simple tranchant	VWR	55411-050
Cellule musculaire squelettique Basal Medium	Promocell	C-23260	30 mL d’aliquotes sont générées et stockées à 4° ;C.
Milieu de croissance des cellules musculaires squelettiques (prêt à l’emploi)	Promocell	C-23060	42 mL d’aliquotes sont générées et stockées à 4° ;C.
Smartphone (iPhone)	Apple	SE
Standard Duty Dry Vacuum Pump	Welch	2546B-01
Sterilization Bag	Alliance	211-SCM2
Thimble	Igege		Commandé chez Amazon
Thrombin from human plasma	Sigma - Aldrich	T6884-250UN	100 unités de thrombine sont dissoutes dans 1 mL d’une solution de BSA à 0,1 %. 10 et micro ; Les aliquotes L sont préparées et stockées à - 20 °C.
Fil de cuivre étamé	Arco	B8871K48	Commandé chez Amazon
Trypan Blue Solution, 0,4 %	Thermo Scientific	15250061
Trypsine-EDTA, 0,25 %	Thermo FIsher Scientific	25200072 Chambre à
vide 2	SP Bel-Art	F42027-0000

stérile . 21600069 de démoulage interne