Article de méthode

Vaccination intranasale et collecte de lait dans les études sur l’immunisation maternelle chez le lapin blanc de Nouvelle-Zélande (Oryctolagus cuniculus)

DOI :

10.3791/62317

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31 juillet 2021

 ,  ,  , 
1Division of Laboratory Animal Resources, Duke University Medical Center, 2Department of Pathology, Duke University Medical Center, 3Department of Immunology, Duke University Medical Center, 4Duke Human Vaccine Institute, Duke University Medical Center

Dans cet article

Résumé

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Cet article décrit et démontre l’administration de vaccins intranasaux et la collecte de lait de lapins en conctation (Oryctolagus cuniculus) comme moyen d’évaluer l’immunité muqueuse dans un modèle translationnelle approprié de vaccination maternelle.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En raison des similitudes dans la placentation et le transfert d’anticorps avec les humains, les lapins sont un excellent modèle d’immunisation maternelle. D’autres avantages de ce modèle de recherche sont la facilité de reproduction et de prélèvement d’échantillons, une période de gestation relativement courte et une portée de grande taille. Les voies d’immunisation couramment évaluées comprennent les voies d’immunisation sous-cutanées, intramusculaires, intranasales et intradermiques. Le prélèvement d’échantillons non terminaux pour la détection chronologique des réponses immunologiques à ces immunisations comprend le prélèvement de sang, à la fois des mères et des trousses, et le lait provenant de l’allée. Dans cet article, nous démontrerons les techniques que notre laboratoire a utilisées dans les études de vaccination maternelle chez les lapins blancs de Nouvelle-Zélande(Oryctolagus cuniculus),y compris l’immunisation intranasale et la collecte de lait.

Introduction

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Les études sur l’immunisation maternelle et le transfert d’anticorps sont inestimables pour de nombreuses raisons, car il s’agit de la voie initiale du transfert de l’immunité et de la protection subséquente contre les agents pathogènes et les maladies chez les nouveau-nés et les nourrissons. La vaccination maternelle a le potentiel d’avoir un impact positif sur la santé maternelle et infantile/infantile au niveau mondial en réduisant la morbidité et la mortalité associées à certains agents pathogènes au cours de cette période vulnérable1. L’objectif principal de cette stratégie est d’augmenter les niveaux d’anticorps maternels spécifiques tout au long de la grossesse. Ces anticorps peuvent ensuite être transférés au nouveau-né et au nourrisson à des niveaux suffisants pour protéger contre les infections jusqu’à ce que leur système immunitaire soit suffisamment mature pour répondre adéquatement aux défis1,2,3. Des travaux antérieurs ont démontré que des titres d’anticorps plus élevés à la naissance sont associés soit à une protection complète, soit à une apparition retardée et à une gravité réduite de nombreuses maladies infectieuses différentes chez le nouveau-né, y compris le tétanos, la coqueluche, le virus respiratoire syncytial (VRS), la grippe et les infections streptococciques du groupe B1,2,3.

Chez l’homme, les anticorps maternels sont transférés passivement à travers le placenta et sont également transférés à travers le lait maternel via l’allaitement. Des travaux antérieurs ont démontré que les taux d’IgA spécifiques au VIH dans le lait maternel humain chez les mères infectées par le virus étaient associés à une réduction de la transmission postnatale du virus, ce qui suggère un rôle protecteur pour les IgA4anti-VIH dans le lait maternel. Des études chez des primates non humains ont démontré que l’immunisation contre le VIH peut induire une réponse anticorps significative dans le lait maternel, et bien que des réponses sériques similaires aux IgG aient été induites à la suite d’une immunisation systémique par rapport à l’immunisation muqueuse, l’immunisation muqueuse a induit une réponse significativement plus élevée aux IgA dans le lait5,6.

L’identification d’un modèle animal approprié sur le plan translationnelle pour ces études devrait tenir compte du type de placentation et des mécanismes de transfert d’anticorps passifs, ainsi que du transfert d’anticorps par le lait maternel. Il existe trois principaux types de placentation chez les mammifères en fonction des types de tissus et des couches à l’interface materno-fœtale, y compris l’hémochorial (primates, rongeurs et lapins), l’endothéliochorial (carnivores) et l’épithéliochorial (chevaux, porcs et ruminants). Le placenta hémochorial est le type le plus invasif, permettant une communication directe entre l’apport sanguin maternel et le chorion, ou la membrane fœtale la plus externe. Sur la base du nombre de couches de trophoblastes, il existe plusieurs variations de placentation hémochoriale, y compris le placenta hémomonochorial trouvé chez les primates, le placenta hémochichorial chez le lapin et le placenta hémotrichorial observé chez le rat et la souris7. Ce contact direct entre l’apport sanguin maternel et le chorion permet le transfert passif d’anticorps à travers le placenta pendant la gestation. Les IgG sont la seule classe d’anticorps qui traverse de manière significative le placenta humain8,tandis que les IgA sont la classe prédominante d’Ig présente dans le lait maternel humain9. Parmi les modèles scientifiquement pertinents, seuls les primates (y compris les humains), les lapins et les cobayes transfèrent des IgG in utero et des IgA dans le lait10,11. Par conséquent, le modèle du lapin intègre des facteurs comparables à ceux chez l’homme qui contrôlent le transfert transplacentaire d’IgG et le transfert lactationnel d’IgA.

En plus de servir de modèle exceptionnel pour l’immunité maternelle et le développement de vaccins, les similitudes entre les cavités nasales du lapin et de l’homme en font un modèle approprié pour l’immunisation intranasale. Le volume de la cavité nasale du lapin est plus similaire à celui des humains que les modèles de rongeurs basés sur la masse corporelle relative12. De plus, Casteleyn et coll. 12 ont démontré que le tissu lymphoïde associé nasal (NALT) est plus volumineux chez le lapin que chez les rongeurs. Le NALT est situé principalement à l’aspect ventral et ventromedial du méat nasal ventral et à l’aspect latéral et dorsolatéral du méat nasopharyngé chez le lapin, tandis que chez les rongeurs, le tissu lymphoïde n’est présent que le long de l’aspect ventral du méat nasopharyngé12. Chez le lapin, la structure et l’emplacement des lymphocytes intraépithéliales et lamina propria, ainsi que les follicules lymphoïdes isolés, sont similaires à ceux des humains12.

Les avantages supplémentaires de l’utilisation du lapin comme modèle d’immunité maternelle et muqueuse comprennent sa fécondité élevée et sa période de gestation relativement courte. Les gros vaisseaux sanguins auriculaires permettent un accès relativement facile à de grands volumes de sang pour les collectes en série. Une variété d’échantillons muqueux peuvent être prélevés pour les tests de réponse anticorps spécifiques à l’antigène, y compris le lait maternel13 (lors de l’allaitement), les sécrétions muqueuses ou les lavages (par exemple, orale14,15,16,lavage bronchoalvéolaire13,17,18,19,vaginal20,21,22)et matières fécales20,23,24,25. Des échantillons de lait peuvent être facilement prélevés pendant l’allaitement pour évaluer la présence de réponses anticorps spécifiques à l’antigène. Bien qu’ils ne soient pas aussi abondants que pour les humains et les souris, une grande variété de réactifs expérimentaux sont disponibles pour les études et les essais spécifiques aux lapins. Dans cet article, nous décrirons et démontrerons l’immunisation intranasale et la collecte de lait chez les lapins blancs de Nouvelle-Zélande (Oryctolagus cuniculus).

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Protocole

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Toutes les procédures ont été approuvées et exécutées conformément aux politiques de l’IACUC de l’Université Duke.

REMARQUE : Les matériaux nécessaires sont fournis dans la table des matériaux.

1. Sédation et anesthésie du lapin

  1. Calmer le lapin femelle (sexuellement mature; environ 5-30 mois) en administrant l’acepromazine par voie intramusculaire (IM) à une dose de 1 mg/kg. Selon la taille de l’animal, utilisez une seringue de 1 ou 3 mL avec une aiguille de 25 G. Les muscles epaxiaux sont le site préféré de l’injection intramusculaire.
    REMARQUE: L’acepromazine peut également être administrée par voie sous-cutanée, mais la MI est préférée par le laboratoire, car elle agit plus rapidement et réduit l’incidence des lésions cutanées.
  2. Attendez 10-15 minutes pour permettre à l’acepromazine de prendre effet.
  3. Anesthésiez le lapin avec de l’isoflurane en plaçant le cône de nez connecté sur le nez de l’animal. Réglez le vaporisateur jusqu’à 4% d’isoflurane combiné avec jusqu’à 4 litres / minute d’oxygène. Les lapins ont une forte aversion pour l’isoflurane, il est donc nécessaire de les restreindre suffisamment lors du masquage de l’animal.
  4. Une fois complètement anesthésié, comme évalué par le pinna, la pédale, et/ou le réflexe palpébral, appliquez le lubrifiant ophtalmique à chaque oeil pour empêcher le dessèchement des yeux et l’ulcération cornéenne suivante.
  5. Surveillez continuellement les réflexes et la respiration pendant l’anesthésie, et réduisez le taux d’isoflurane à 1-2% une fois qu’un plan adéquat d’anesthésie a été atteint.

2. Immunisation intranasale

  1. Préparer une solution d’immunisation avant la manipulation de l’animal.
  2. Calmez le lapin comme décrit ci-dessus.
  3. Une fois que le membre du laboratoire est prêt à administrer le vaccin et que le lapin est dans un plan d’anesthésie adéquat, éteignez l’isoflurane et l’oxygène et retirez le cône de nez.
  4. Placez le lapin en réamence dorsale et soutenez le cou et la tête à un angle d’environ 45 ° qui permet un accès et une visualisation faciles des deux narines par le membre du laboratoire qui administre le vaccin.
  5. Chargez la pipette avec pas plus de 100 μL de la solution vaccinale et administrez rapidement la solution dans chaque narine. La pipette doit être maintenue à un angle d’environ 45°, incliné vers l’aspect médial du passage nasal.
    NOTA : L’objectif de l’immunisation est que la solution entre en contact avec la membrane muqueuse des narines, de sorte que la pointe ne doit pas être placée dans les narines, car cela pourrait entraîner une abrasion ou une irritation des tissus muqueux et potentiellement influencer l’immunogénicité du vaccin administré par voie nasale. Le vaccin doit être administré rapidement et fait de la même manière dans l’autre nare.
  6. Après l’administration dans les deux voies nasales, maintenir le lapin en réamence dorsale pendant 30 secondes afin de minimiser les fuites de la solution vaccinale.
    REMARQUE : Le laboratoire n’administre généralement pas plus de 100 μL par narine à la fois. Si un volume plus important doit être administré, avec un total maximal de 500 μL, le vaccin peut être administré en aliquotes de 100 μL avec une période de repos de 30 secondes entre les vaccinations, et des administrations supplémentaires de vaccin répétées, avec 30 secondes de repos entre chaque administration, jusqu’à ce que le volume total de vaccin soit livré.
  7. Après l’immunisation, placez le lapin sur le ventrum pour le rétablissement et surveillez de près l’animal jusqu’à ce qu’il puisse maintenir la réamence sternale.

3. Collecte du lait

  1. Calmez le lapin en allaitant comme décrit ci-dessus.
  2. Nettoyez la peau sur la veine marginale de l’oreille avec l’écouvillon/lingette d’alcool.
  3. À l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 25 g, administrer environ 1 à 2 UI d’ocytocine par voie intraveineuse par l’intermédiaire de la veine marginale de l’oreille pour induire la déception du lait.
    REMARQUE: En raison de la relaxation des muscles lisses, il est courant pour le lapin d’uriner ou de déféquer après l’administration d’ocytocine.
  4. Après l’administration d’ocytocine, appliquez une pression sur le site d’injection avec le morceau de gaze.
  5. Tout en maintenant le masque d’anesthésie sur le nez du lapin, soutenez le lapin sur son quartier arrière.
    REMARQUE: La collecte du lait peut également être effectuée avec l’animal en recumbency latérale, mais le laboratoire constate que la collecte est plus facile lorsque le lapin est appuyé sur sa croupe avec un assistant tenant le lapin debout avec le masque d’anesthésie.
  6. Ouvrez le tube stérile pour vous préparer à la collecte du lait et localisez le tissu mammaire et les trayons associés. Les trayons sont généralement entourés de fourrure humide provenant d’allaitements récents, et le tissu mammaire est facilement palpable lorsqu’il est plein de lait.
  7. Saisissez le tissu mammaire associé à une trayon entre le pouce et l’index et appliquez une pression douce et massante sur le tissu glandulaire dans la direction du trayon. Placez le tube de collecte sur le trayon pour recueillir le lait exprimé.
    REMARQUE: Il peut parfois prendre plusieurs minutes pour que l’ocytocine soit efficace, et la production de lait semble varier entre les glandes mammaires. Si l’expression du lait n’est pas réussie, attendez quelques minutes ou tournez autour des glandes mammaires supplémentaires. Le lait de toutes les tétines peut être collecté dans le même flacon. Typiquement, plusieurs millilitres de lait peuvent être facilement collectés à partir d’une bèce en lait.
  8. Après la collecte du lait, éteignez l’isoflurane et l’oxygène et laissez le lapin se rétablir tout en étant surveillé de près jusqu’à ce que l’animal soit en mesure de maintenir la recumbence sternale.

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Résultats

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La figure 1donne un aperçu d’un plan d’étude typique de l’immunisation intranasale de la mère, qui comprend les immunisations, la reproduction, l’allaitement, la lactation et le transfert d’anticorps. Bien qu’il ne soit pas illustré, le sang devrait être prélevé avant l’immunisation initiale pour les mesures de base et tout au long du reste de l’étude à intervalles réguliers. Le sang est facilement obtenu par l’intermédiaire de l’artère centrale d’oreille avec la sédation douce et un agent a...

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Discussion

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Bien que cela ne soit pas décrit dans le protocole ci-dessus, un élevage réussi des lapins est nécessaire pour ce modèle maternel et pour permettre la collecte du lait. Les lapins sont facilement élevés par couverture vivante dans un cadre de recherche. Il est recommandé de le transférer dans la cage du mâle pour la reproduction, car il peut être territorial et agressif s’il est gardé dans sa propre cage avec le mâle. Si les femelles ne sont pas réceptives après 15 minutes (comme indiqué en s’envolant en mordant ou en vo...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier la Division des ressources animales de laboratoire de l’Université Duke et son équipe d’élevage pour leur aide et les grands soins prodigués aux animaux. De plus, les auteurs aimeraient remercier l’équipe de PhotoPath du Département de pathologie pour son aide dans les parties audio et vidéo du manuscrit. Ces travaux ont été soutenus par des fonds de recherche discrétionnaires du laboratoire Staats.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vaccination intranasale
Anesthésie/VaporisateurVet Equip901807
Aiguille hypodermique (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (bouteille de 250 ml)Patterson Veterinary07-893-13892-4 %
Seringue Luer Lock (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Vaccin muqueuxN/AN/AVaccin expérimental
Cône de nezMcCulloch Medical07891-1097
Pointes de pipetteVWR53503-290
PipetteVWR89079-962
PromAce (Maléate d’acépromazine)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg
IM Puralube Stérile Pommade ophtalmiqueDechra07-888-2572
Milk Collection
Alcohol Prep 2-plyCovidien07-839-8871
Appareil d’anesthésie/vaporisateurVet Equip901807
Aiguilles hypodermiques (25 g)Terumo07-806-7584
Isoflurane (bouteille de 250 ml)Patterson Veterinary07-893-13892-4
 %Luer Lock Seringue (1 mL)Air-Tite07-892-7410
Éponge non tissée (4x4)Covidien07-891-5815
Cône de nezMcCulloch Medical07891-1097
PromAce (Maléate d’acépromazine)Boehringer Ingelheim07-893-57341mg/kg
IM Puralube Stérile Pommade ophtalmiqueDechra07-888-2572
Flacon conique stérile (15 mL)Falcon14-959-49B

Références

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Transfert d anticorpsImmunit muqueusePr l vement sanguinMesure des IgGD tection des IgAImmunit passive

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