Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique

Les souris et les humains ont deux types de tissus adipeux : le tissu adipeux blanc (WAT) et le tissu adipeux brun (MTD)¹. WAT stocke l’énergie sous forme de triglycérides dans les adipocytes blancs, et les adipocytes bruns (BA) de BAT dissipent l’énergie chimique sous forme de chaleur². En fonction de leur origine développementale, les BA sont ensuite classés en BA classiques (cBA) qui se sont formés au cours du développement embryonnaire et en BA dérivés d’adipocytes blancs (cellules beiges / brite, converties à partir d’adipocytes blancs dans des conditions de stress)³. Les BA sont multiloculaires et expriment la protéine thermogénique de découplage 1 (UCP1)⁴. Le dépôt de MTD interscapulaire (iBAT) est l’un des principaux dépôts de cBA chez les petits mammifères⁵, tandis que les cellules beiges sont dispersées dans WAT⁶.

En raison de leur nature de dissipation de l’énergie, les BA ont reçu beaucoup d’attention en tant que cible thérapeutique pour réduire l’obésité⁷. Pour exploiter les BA dans le but de traiter l’obésité, il est essentiel de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la fonction, la survie et le recrutement des BA. Les tissus adipeux, y compris la MTD et la WAT, sont hétérogènes. À l’exception des adipocytes, les tissus adipeux contiennent de nombreux autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales, les cellules souches mésenchymateuses et les macrophages⁸. Bien qu’il existe des outils génétiques pour épuiser spécifiquement les gènes candidats chez les souris BA, tels que UCP1::Cre line⁹, les techniques de purification des BAT ou WAT sont limitées, ce qui rend difficile l’étude des BA au niveau d’un type unicellulaire. De plus, sans obtenir des BA purs, la relation entre les BA et les non-BA ne sera pas clairement définie. Par exemple, le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα) a été utilisé comme marqueur pour les cellules mésenchymateuses indifférenciées, et il est exprimé dans les cellules endothéliales et interstitielles de la MTD. Dans les MTD soumises à un stress froid, les cellules progénitrices PDGFRα positives donnent naissance à de nouveaux BAs¹⁰. PDGFRα est activé par son ligand PDGF, un facteur de croissance qui régule la croissance et la prolifération des cellules mésenchymateuses¹¹; cependant, il n’est pas clair si les BA influencent le comportement des cellules progénitrices PDGFRα positives en sécrétant PDGF.

Récemment, un protocole d’isolement des BA a été publié, basé sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)¹². Dans ce protocole, une solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % a été utilisée pour séparer les BA des non-BA, et les BA enrichies ont été purifiées par FACS. L’application de ce protocole est limitée par l’exigence du processus FACS, qui repose à la fois sur l’équipement et sur l’expérience d’exploitation du FACS. Dans cette étude, un nouveau protocole pour isoler les BA des MTD a été développé. Les BA isolés par ce protocole peuvent être directement utilisés pour des études d’expression génique et protéique. De plus, les données de cette étude suggèrent que les AB sont une ressource importante du FGPD.

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la recherche médicale maçonnique. UCP1::Cre⁹ et Rosa 26^tdLes lignées de souris Tomato¹³ ont été signalées précédemment. Toutes les souris ont été maintenues à température ambiante avec un cycle lumière/obscurité de 12 h.

1. Préparation des solutions et du tissu adipeux brun (MTD)

1. Préparer la solution de digestion et la solution de séparation dans des tubes à centrifuger de 15 mL.
2. 10 mL de solution de digestion BAT : À 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, ajouter 3,5 mg/mL de Dispase II, 1 mg/mL de collagénase II et 10 mM de CaCl₂ pour obtenir une solution de digestion BAT.
3. 10 mL de solution d’iodixanol à 12 % (solution de séparation) : Mélanger 1 mL de PBS 10x, 2 mL d’iodixanol à 60 %, 0,01 mL de 1 M MgCl2, 0,025 mL de 1 M KCl, 0,1 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,2 M et 6,865 mL de ddH2O pour obtenir₁₂% d’iodixanol.
4. Euthanasier une souris adulte avec une surdose de CO₂ . Brièvement, remplissez la cage de la souris avec 100% de CO₂ à un taux de déplacement de 10-30% du volume de la cage par min. 5 min plus tard, confirmez la mort en vérifiant l’absence de respiration visible.
5. Disséquez l’animal et collectez les MTD interscapulaires. Retirez WAT et les couches musculaires au microscope stéréoscopique.
6. Pour avoir une digestion suffisante, couper chaque lobe de la MTD en ~ 3 mm³ parties et les placer dans une fiole propre de 50 ml avec une barre d’agitation métallique et une solution de digestion de 5 ml. Avant de commencer la digestion, laisser reposer la fiole contenant la MTD et le tampon de digestion sur la glace pendant 1 h.
   REMARQUE: Dans les étapes suivantes, environ 80 mg de BAT ont été utilisés pour l’isolement des adipocytes bruns.

2. Procédure d’isolement des BA

1. Placer la fiole sur un agitateur magnétique enfermé dans un incubateur. Réglez la vitesse d’agitation à 60 tr/min et la température de l’incubateur à 35 °C, respectivement. La digestion durera environ 30 min. Si les tranches de MTD forment des amas autour de la barre d’agitation pendant la digestion, utilisez un embout de pipette de 1 mL pour perturber les tissus agrégés.
2. Placez un filtre à crépine de 70 μm sur un tube à centrifuger propre de 50 mL. Pipeter environ 4 ml de suspension cellulaire à travers la passoire. Laver la crépine avec 4 mL de solution d’iodixanol à 12%. Pipeter de haut en bas pour mélanger les cellules et la solution d’iodixanol. Transférer le mélange de cellules dans deux tubes à essai en polystyrène transparent de 5 mL.
   REMARQUE: À la fin de la digestion, la solution de digestion doit être trouble, indiquant une digestion suffisante. Utilisez une solution de digestion fraîche à chaque fois. Une fois préparée, la solution de digestion doit être utilisée dans les 2 heures.
3. Répétez les étapes 2.2 et 2.3 une fois de plus si la digestion n’est pas suffisante.
4. Laisser les tubes en polystyrène transparent contenant la solution de séparation et les BA sur la glace pendant 1 h. Les BA formeront une couche sur le dessus.
5. Retirer 20 μL des BA isolés pour l’examen au microscope.

3. Isolement de l’ARN et des protéines des BA

1. Pipeter la couche BA dans deux tubes microcentrifugés de 1,7 mL pour l’isolement de l’ARN et des protéines. Retirez soigneusement la solution excessive d’iodixanol sans perturber la couche BAs.
2. Ajouter 1 mL de Trizol pour isoler simultanément l’ARN, l’ADN et la protéine dans la solution cellulaire. Mélanger suffisamment pour lyser les cellules.
3. Ajouter 200 μL de chloroforme pour séparer les phases.
4. Centrifuger le tube pendant 9 981 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. Après centrifugation, utiliser la phase aqueuse pour l’isolement de l’ARN. Dans cette étude, l’ARN total a été utilisé pour la transcription inverse, et la RT-PCR quantitative a été réalisée avec la PCR en temps réel. Les séquences d’amorces sont énumérées dans le tableau des matériaux.
6. Transférer 300 μL de la phase organique dans un tube microcentrifuge de 2 mL.
7. A la phase organique, ajouter 2,5 volume 100% éthanol et vortex pendant 10 s.
8. Ajouter 200 μL de 1-Bromo-3-chloropropane et vortex pendant 10 s.
9. Ajouter 600 μL d’eau bidistillée et vortex pendant 10 s.
10. Laisser reposer la solution mélangée pendant 10 min à température ambiante.
11. Centrifuger à 9 981 x g pendant 10 min à 4 °C. À cette étape, les phases seront séparées. La phase protéique est localisée dans la couche intermédiaire.
12. Retirer la solution aqueuse supérieure. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % dans la solution restante.
13. Centrifuger pendant 10 min, 9 981 x g, 4 °C. Après centrifugation, la pastille de protéine se forme. Jetez le surnageant.
14. Lavez la pastille avec 1 ml d’éthanol 100 %.
15. Centrifuger pendant 10 min, 9981 x g, 4 °C. Conservez la pastille et jetez le surnageant.
16. Sécher le granulé à l’air pendant 10 min à température ambiante.
17. Mesurer le poids de la pastille humide. Ajouter une solution de SDS à 1 % dans un rapport de 20 μL/mg de granulés.
18. Dissoudre la pastille en mettant le tube dans un shaker chauffé. Réglez la température à 55 °C et la vitesse à 11 x g. Il faut généralement 5 à 10 minutes pour dissoudre complètement la pastille de protéine.
    NOTE: La concentration de la protéine dissoute peut être mesurée par le dosage^{BCA 14}.

Préparation de la MTD interacapulaire pour l’isolement des adipocytes bruns
Le processus d’isolement des adipocytes bruns (BA) est illustré à la figure 1A. L’ensemble du processus, de la préparation des MTD et des solutions de digestion/séparation à l’obtention de BA isolés, prendra environ 4 h.

Chez les souris adultes, la MTD abondante existe dans la région interscapulaire. Cette MTD interscapulaire (iBAT) est recouverte de couches musculaires et de WAT (Figure 1B). Avant de commencer la procédure de digestion, les couches musculaires et WAT doivent être enlevées pour produire un iBAT propre (Figure 1C). Dans un protocole d’isolement BAs publié, le BAT haché a été utilisé pour l’isolement BAs12. Dans cette étude, la digestion de MTD de 3 mm3 (figure 1D) a produit plus de BA que les MTD émincées.

Séparation des BA des non-BA avec une solution BSA à 3%
Après la digestion iBAT, des BA dissociés ont été mélangés avec des non-BA dans le produit de digestion. Parce que les BA contiennent des gouttelettes lipidiques, leur densité est inférieure à celle des non-BA; cependant, la densité des BA n’est pas assez faible pour leur permettre de flotter efficacement vers le haut d’une solution PBS ordinaire. Le PBS contenant 3 % d’albumine sérique bovine (BSA) a été utilisé pour séparer les BA des non-BA12, ce qui a été répété avec succès dans cette étude (figure 2A).

Rosa 26 tdTomato est une lignée de souris rapporteures, qui exprime une forte protéine de fluorescencetdTomato (tdTom ) après une recombinaison médiée par Cre13. Ucp1::Cre souris transgéniques expriment Cre recombinase dans les BAs9. La lignée de souris Ucp1::Cre a été croisée avec des souris Rosa26 tdTomato pour marquer génétiquement les BA avec tdTom (Figure 2B). Pour valider la procédure d’isolement BAs, l’iBAT des souris Ucp1::Cre;tdTom/+ a été dissocié. La plupart des cellules enrichies dans la couche supérieure de la solution de BSA étaient en forme de framboise et contenaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires. De plus, la plupart de ces cellules en forme de framboise étaient tdTom positives (Figure 2C), confirmant qu’il s’agissait d’adipocytes bruns.

Séparation des BA des non-BA avec une solution d’iodixanol à 6%
3% de BA enrichie en solution de séparation BSA. Il n’était pas clair si ces BA isolés pouvaient être utilisés pour l’analyse de l’expression génique et protéique. L’ARN et les protéines ont ensuite été extraits des BA enrichis. L’extraction de l’ARN a été réalisée avec succès selon la procédure standard d’isolement de l’ARN. Cependant, le protocole standard d’isolement des protéines Trizol, également connu sous le nom de méthode Guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme (méthode GTPC), n’a pas bien fonctionné, ce qui était fastidieux et avait un très faible rendement en protéines. Par conséquent, une méthode améliorée d’isolement des protéines a été adoptée pour extraire les protéines des BA lysés par Trizol.

Dans ce protocole GTPC amélioré, de l’éthanol, du bromo-chloropropane et de l’eau ont été utilisés pour extraire les protéines de la phase organique15. Après addition d’éthanol, de bromochloropropane et d’eau dans la phase organique, et après centrifugation, des pastilles de protéines se sont formées entre la phase aqueuse et la phase organique (Figure 3A). La pastille de protéine a ensuite été lavée avec de l’éthanol à 100% et dissoute dans une SDS à 1%. Cette méthode GTPC améliorée a été utilisée pour extraire les protéines des BA enrichies en solution iBAT et BSA. Bien que la pastille de protéine BAT ait été facilement dissoute dans 1% SDS, la majeure partie de la pastille de protéine BAs isolée n’était pas soluble. Ensuite, la protéine dissoute a été examinée avec le gel SDS-PAGE. Comme le montre un gel SDS-PAGE coloré en bleu de Coomassie (Figure 3B), une bande protéique massive d’environ 60 kDa était présente dans les BA isolés, mais pas dans les échantillons de MTD. Étant donné que le poids moléculaire de BSA est de 66 kDa et que le BSA est abondant dans la solution de séparation des BA, cette bande protéique dominante devrait être BSA. Ces données suggèrent que le BSA de la solution de séparation des BA interfère avec l’extraction des protéines.

L’iodixanol est un milieu de gradient non ionique et iso-osmotique16 qui a été largement utilisé pour la cellule 17 et la purification des virus adéno-associés (AAV)18. Pour éviter l’interférence BSA des études d’expression protéique, l’iodixanol a été utilisé pour remplacer le BSA dans une nouvelle solution de séparation des BAs. La solution de BSA à 3% a une densité de 1,03, ce qui est similaire à 6% d’iodixanol. Dans une solution d’iodixanol à 6 %, les BA ont flotté vers le haut en 30 à 60 minutes (Figure 3C). Les BA isolés avec cette solution présentaient une forme typique de framboise et contenaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires (Figure 3D). Les protéines extraites de ces BA isolés ont été bien séparées dans le gel SDS-PAGE (Figure 3E).

Pour vérifier si la solution d’iodixanol à 6% séparait efficacement les BA des non-BA, nous avons marqué génétiquement les BA avec tdTom et examiné les cellules résidant dans la solution claire d’iodixanol à 6%. Après avoir séparé les BA des non-BA (étape 2.4), la solution d’iodixanol à 6% sous la couche de BA a été diluée 6 fois avec du PBS puis centrifugée à 600 x g pendant 5 min. Après centrifugation, une petite pastille de globules rouges a été formée sur le fond, qui pourrait être des cellules de fraction vasculaire stromale. Comme le montre la figure 3, les cellules de la couche BAs étaient des cellules tdTom positives (Figure 3F); cependant, les cellules récupérées à partir de la pastille étaient tdTom négatives (figure 3G). De plus, aucune gouttelette lipidique évidente n’était visible dans les cellules tdTom négatives. Ces données suggèrent que notre nouveau protocole peut séparer efficacement les BA des cellules non adipeuses.

Ensemble, ces données démontrent que l’isolement des BA avec une solution de BSA à 3% interfère avec les études biochimiques de suivi et suggèrent que la solution d’iodixanol à 6% est meilleure que la solution de BSA à 3% pour isoler les BA .

Analyse de l’expression génique et protéique avec des BA isolés.
Pour valider cette nouvelle procédure d’isolement des BA au niveau moléculaire, l’expression de trois gènes a été comparée entre les MTD et les BA isolés : Ucp1, Pdgfa et Pdgfra. Dans la MTD, Pdgfra est exprimée dans les cellules endothéliales et les cellules interstitielles, et les cellules PDGFRα positives sont des cellules progénitrices putatives10. Les niveaux d’ARNm d’Ucp1 et de Pdgfa étaient tous deux significativement plus élevés dans les BA isolés que dans les MTD (Figure 4A,B). Au contraire, l’ARNm de Pdgfra n’a été détecté que dans BAT (Figure 4B).

PPARγ est un facteur transcriptionnel contrôlant le développement du tissu adipeux, UCP1 est une protéine mitochondriale et PDGFRα est une protéine réceptrice membranaire. Ces trois protéines représentent des protéines distribuées dans différents compartiments cellulaires. Des transferts Western ont été effectués pour tester si la protéine extraite des BA lysés par Trizol et de la MTD convenait à l’analyse de l’expression protéique. UCP1 et PPARγ ont été détectés dans les BA et les MTD (Figure 4C,D), ce qui confirme que la protéine totale isolée des BA lysées par Trizol ou BAT convient au transfert Western. De plus, conformément aux résultats de la qRT-PCR, la protéine UCP1 a été enrichie en BA (Figure 4C); alors que le PDGFRα n’a été détecté que dans les MTD mais pas dans les BA purs (figure 4D). En résumé, ces données démontrent que notre nouvelle méthode d’isolement des BA est efficace et suggèrent que les BA enrichis par cette méthode peuvent être directement utilisés pour des études d’expression génique et protéique.

Figure 1: Préparation de l’iBAT pour l’isolement des adipocytes bruns. (A) Déroulement de la procédure d’isolement des adipocytes bruns. (B) Vue ventrale du tissu interscapulaire contenant les couches de MTD, WAT et musculaires. c) MTD interscapulaire (MTDi). Les couches musculaires et WAT adjacentes à iBAT ont été enlevées. (D) Une image représentative des morceaux iBAT utilisés pour l’isolement des adipocytes bruns. B-D, barre d’échelle = 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Séparation des adipocytes bruns de la solution de digestion. (A) Images des adipocytes bruns dissociés avant et après la séparation. Une solution de BSA à 3% a été utilisée pour séparer les adipocytes bruns des adipocytes non bruns. Barre d’échelle = 1 cm. (B) Vue schématique du marquage génétique des adipocytes bruns avec la protéine de fluorescence tdTomato. (C) Images d’adipocytes bruns isolés. DIC, contraste d’interférence différentielle. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Extraction de protéines totales à partir d’adipocytes bruns lysés. (A) Séparation de la phase protéique de la phase organique. (B) Coloration de Coomassie du gel SDS-PAGE. La protéine totale a été extraite de la BAT ou de la solution de BSA à 3% d’adipocytes bruns purifiés. La bande protéique BSA était indiquée par une flèche. (C) Couche d’adipocytes bruns formée sur une solution d’iodixanol à 6%. Barre d’échelle = 1 cm. (D) Adipocytes bruns isolés avec une solution d’iodixanol à 6%. Les adipocytes bruns étaient indiqués par des flèches jaunes. Barre d’échelle = 50 μm. (E) Coloration de Coomassie du gel SDS-PAGE. La protéine totale a été extraite des BAT ou des BA enrichies en solution d’iodixanol à 6%. (F) Images d’adipocytes bruns marqués tdTom. (G) Images de cellules récupérées à partir de la solution d’iodixanol sous la couche BAs. F et G, barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse de l’expression génique et protéique des adipocytes bruns isolés. Des adipocytes bruns isolés avec la méthode iodixanol ont été utilisés dans ces études d’expression génique et protéique. (A,B) qRT-PCR mesure de l’expression génique. Les niveaux d’ARNm ont été normalisés à 36B4. N=3. Test t de l’élève, *, P<0,01; **, P<0,01. (C) Western blot de PPARγ et UCP1. (D) Western blot de PDGFRα. C et D, membrane colorée S Ponceau a été utilisée comme contrôle de charge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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